CN112592851B - 一株对水产病原菌有广谱拮抗作用的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株对水产病原菌有广谱拮抗作用的嗜酸乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高效广谱抑菌的嗜酸乳杆菌及其应用。该嗜酸乳杆菌命名为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1‑2，保藏号为GDMCC 60903。该嗜酸乳杆菌SSRG1‑2具有良好的抑菌效果；在盐浓度为0.5％的培养基中，该菌株的生长最好，培养39h后菌液OD600值接近1.0；菌株SSRG1‑2对常见水产病原菌具有高效抑能力，在室内石斑鱼养殖攻毒试验中，显示出了很好的抗病性，且抑菌物质主要为蛋白类和非蛋白类复合物质，用于防治病原菌不会产生耐药性、无二次污染，在水产养殖病害防治中有较大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及水产微生物应用技术领域，具体涉及一株嗜酸乳杆菌及其在水产养殖防治病原菌中的应用。
背景技术
我国是世界第一大水产养殖大国，养殖产量约占世界水产养殖总产量的70％。但随着我国水产养殖规模的逐步扩大及集约化程度的不断提高，养殖过程饵料残留、排泄物累积等造成水产养殖水质不断恶化，水产养殖行业病害加剧，其中气单胞菌、弧菌等多种水产养殖常见病原菌，常常造成水产养殖动物相关病害的大规模暴发，给蓬勃发展的水产养殖业带来巨大损失，极大地限制了我国水产养殖业健康可持续发展。
目前，广谱抑菌抗生素广泛应用在防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等常见水产病原菌上，这不仅导致了一些“超级细菌”的出现，而且其在抑制病原菌的同时也杀灭了益生微生物，对养殖动物机体微生态平衡造成了严重破坏，其自身免疫水平反而会出现下降，易再次感染爆发疾病。
乳酸菌是人和动物肠道普遍存在的正常微生物，有调节免疫力、维持肠道内生态平衡等作用，具有良好的潜在益生性，目前关于其对病原菌防治研究主要在食品中，其作为一种新型生物防腐剂备受关注。但在水产养殖病害防治上研究很少。
但目前商品化的乳酸菌细菌素仅限于pediocin PA-1和Nisin等少数几种，原因在于许多乳酸菌细菌素pH范围窄、热不稳定、抑菌谱窄或产量相对较低，在食品中的应用受限。而抗菌类的乳酸菌在水产养殖中应用来抗菌防病的更少，因此，分离筛选具有高效广谱抑水产病原菌能力的乳酸菌菌株并将其应用于水产养殖中，对于水产养殖业逐步实现少抗到无抗养殖具有重要实际意义。
发明内容
本发明的目的提供一株对水产病原菌有广谱拮抗作用的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2，为水产养殖病原菌防治提供了一种良好的生物材料。
为实现上述目的，本发明公开了一株高效广谱拮抗病原菌嗜酸乳杆菌，其为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：60903，保藏日期为2019年12月25日。
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2是由发明人于2019年10月从鱼肠道中分离得到，该菌株生理生化特征为：革兰氏阳性菌，细胞形状为短杆状，大小为0.5～1.0×1.5～2.0μm(见图1)；菌落呈白色、表面光滑。可在盐度为3％的条件下旺盛生长。
提取上述喜盐抑菌嗜酸乳杆菌SSRG1-2的基因组DNA，利用27F/1492R引物扩增其16S rDNA基因，测序后得到的基因序列见SEQ ID NO.1。将该序列在NCBI及EzBioCloud网站上进行同源性比对分析、构建系统发育树，并结合形态学观察，结果表明，该菌株为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
本发明的第二个目的是提供嗜酸乳杆菌SSRG1-2在制备水产养殖中防治病原菌药物中的应用。
所述的水产养殖中防治病原菌药物是在水产养殖中防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的药物。
所述的水产养殖是盐度为0～3％的水产养殖。
本发明的第三个目的是提供嗜酸乳杆菌SSRG1-2在产生具有抑菌能力的蛋白类和非蛋白类物质复合物中的应用。所述的复合物能耐121℃高温，20min。
本发明的第四个目的是提供嗜酸乳杆菌SSRG1-2在制备增强鱼体免疫能力的制剂中应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2是个耐盐菌株，在盐度为3％的环境条件下也能旺盛生长。
(2)本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2能产生蛋白类和非蛋白类抑菌物质，对常见水产养殖病原菌有很好的抑菌效果。
综上所述，本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2在淡水或咸水中生长适应性强，对常见水产养殖病原菌抑菌效果好，在水产养殖中有较大的应用潜力。
本发明的Lactobacillus acidophilus SSRG1-2，于2019年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60903。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌SSRG1-2经结晶紫染色后在光学显微镜下(100×)的照片。
图2为不同蛋白酶处理嗜酸乳杆菌SSRG1-2发酵液后的抑菌结果示意图。
图3为盐浓度条件对嗜酸乳杆菌SSRG1-2生长影响的曲线示意图。
图4为嗜酸乳杆菌SSRG1-2对6种病原菌抑制效果的柱形示意图。
图5为在室内石斑鱼养殖攻毒试验中，不同处理对鱼体免疫影响的柱形示意图。
图6为嗜酸乳杆菌SSRG1-2发酵液离心后的上清液对病原菌菌株抑菌圈照片，其中，a为菌株GDMCC 1.551、b为菌株GDMCC 1.781(Vibrio harveyi 1.781)、c为GDMCC 1.379(Edwardsiella tarda 1.379)、d为BYC2-1(Aeromonas veronii BYC2-1)、e为GDMCC1.1220、f为GDMCC 1.237。
图7为嗜酸乳杆菌SSRG1-2及相近菌株的系统进化树；其中，使用NJ法建树，图中仅显示＞70％的bootstrap系数(重复1000次)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规试剂或按常规方式配制的试剂。
实施例1嗜酸乳杆菌SSRG1-2的富集培养与分离纯化及保存
每种鱼随机各取5条，均选取正常无病的个体。取样时用抄网迅速将鱼从水体中捞出，剪刀敲击头部致死后，将鱼置于灭菌塑料密封袋内，保存在冰盒中，3h内转移到实验室，12h内处理鱼样。
1、鱼肠道的处理。
a.在无菌操作台上进行鱼样处理，先用75％酒精擦拭鱼体表，用解剖剪沿肛门向上剪开；
b.肠道用无菌棉线分别结扎肠段，75％酒精擦拭消化道外壁，用镊子去除附着表面的脂肪；
c.剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物，混匀；-20℃保存待用；用磷酸盐缓冲液(pH7.2)轻柔漂洗。
样品前处理：将采集的5组样品分别用1.5mL PBS(pH 7.4，浓度0.2mol/L)悬浮，剧烈震荡5min后，1000r/min离心3次，每次5min，收集上清至离心管。
2、分离纯化乳酸菌
取样品，加适量生理盐水研磨。将研磨液稀释不同浓度，取10-3、10-4、10-5梯度的菌液涂布CaCO3-MRS平板，37℃厌氧培养48h。挑取溶钙圈较大的菌落在MRS平板上划线分离，反复纯化。将纯化后的菌落进行革兰氏染色、镜检，挑出无芽孢、接触酶阴性的革兰氏阳性菌株，置于25％的甘油管中，-80℃保存备用，由此得到菌株SSRG1-2。
实施例2嗜酸乳杆菌SSRG1-2的16S rDNA鉴定
(1)形态学鉴定：将筛选获得的菌株SSRG1-2涂布于MRS平板上，37℃厌氧培养24h后，观察其菌落特征；取单菌落涂片，革兰氏染色，显微镜下观察其细胞形态，结果见图1。
(2)16S rRNA基因分子鉴定：
提取菌株SSRG1-2的基因组DNA，用细菌16S rDNA基因扩增通用引物27F/1492R(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)扩增得到PCR产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序后得到的16S rRNA序列长度为1426bp，序列见SEQ ID NO.1。将测序结果与NCBI及EzBioCloud数据库中的16SrDNA序列进行同源性比对分析，然后，选取菌株SSRG1-2及相近菌株使用MEGA 6.0、Kimura2-parameter模型、NJ算法建系统进化树(bootstrap重复1000次)，得到的进化树结果见图7。
结果分析表明菌株SSRG1-2与菌株Lactobacillus acidophilus的16S rDNA基因序列相似性最高(99.5％)。
将菌株SSRG1-2命名为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2。该菌株于2019年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60903。
实施例3盐度对嗜酸乳杆菌SSRG1-2生长适应性评估
(1)不同盐度梯度的MRS培养基配制：使用MRS作为基础培养基，每100mL基础培养基分别添加0g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g氯化钠，配成盐度分别为0％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％的培养基，调pH为7.2，121℃下高温高压灭菌。
(2)接种培养：将嗜酸乳杆菌SSRG1-2接种至不同盐度梯度的MRS培养基中，于37℃，恒温培养，在培养0、8、12、24、48h后取样，检测OD600值，结果见图3。
如图3所示，嗜酸乳杆菌SSRG1-2在一定盐度范围内有适应性，在盐度为0.5％的培养基中生长最好，培养15h时OD600值已经超过了0.8，培养39h后OD600值接近1.0。
实施例4嗜酸乳杆菌SSRG1-2抑菌效果测定
1、供试菌清液制备：将活化好的嗜酸乳杆菌SSRG1-2接到MRS液体培养基中，置于37℃、恒温培养24h；培养液过滤除菌，分为两部分，一部分置于4℃中备用；另外一部分置于121℃高压灭菌锅中加热20min后备用。
2、含菌平板制作：将培养好的供试菌株(如下表1)，用紫外分光光度计调节OD600值到0.1，然后分别吸取适量菌液加入到45℃左右熔融的相应培养基(能培养表1中相应菌株的培养基，这属于公知常识)中，充分摇匀后倒平板，待其自然凝固后，用打孔器分别在同一平皿上均匀打孔(孔径9mm)。
3、抑菌试验
吸取嗜酸乳杆菌SSRG1-2除菌后的过滤液100μL分别加入到各个含供试病原菌平板中，置于37℃(或30℃)培养箱中培养约48h后，观察抑菌效果(结果见图6)，并测量抑菌圈直径(结果见图4)。
表1.嗜酸乳杆菌SSRG1-2抑菌效果试验供试菌株
4、嗜酸乳杆菌SSRG1-2抗菌物质解析
1)对高温的稳定性测试
吸取嗜酸乳杆菌SSRG1-2在121℃高压灭菌锅中加热10min后的上清液100μL加入到含菌株GDMCC 1.1220平板中，置于30℃培养箱中培养约48h后，观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径，结果发现抑菌圈仍明显，直径与灭菌前略小，说明菌株SSRG1-2抗菌物质有良好的热稳定性。
2)对蛋白酶的稳定性测试
取2份经0.22μm孔径滤头过滤后的嗜酸乳杆菌SSRG1-2菌清液1mL，分别加入中性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶溶液30μL，对照组加入30μL生理盐水，同时用乳酸设置pH为嗜酸乳杆菌SSRG1-2发酵液相同pH的处理(pH 3.6)，实验组和对照组分别于37℃水浴处理1h。取100μL加入到含菌株GDMCC 1.1220、GDMCC 1.551、GDMCC 1.781的平板中，置于30℃培养箱中培养约48h后，观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径。结果见图2，与对照组相比，经蛋白酶处理的菌清液抑菌活性显著降低，但加蛋白酶处理仍然保留部分抑菌活性，表明该拮抗物质部分对蛋白酶敏感，由此判断该拮抗物质为蛋白类和非蛋白类物质复合物。
实施例5嗜酸乳杆菌SSRG1-2的室内养殖攻毒试验
1、菌剂准备
试验用菌剂为嗜酸乳杆菌SSRG1-2经过发酵形成的原液，具体活菌数为4.0*108cfu/mL。
发酵培养基：MRS培养基
2、实验设计
试验在广东省微生物研究所实验大楼实验室内小型循环养殖系统进行。养殖鱼种为淡水石斑鱼，鱼苗买来后用2.5％的食盐水进行浸泡消毒，正常饲养10天后，选取健康淡水石斑鱼分组实验。试验中所有组饲喂相同饲料(实验组饲料按质量比0.1％拌料嗜酸乳杆菌SSRG1-2菌剂(4×l08cfu/mL)，对照组拌清水)，每日投喂饲料两次(8:00，17:30)，日投饵量为体重的3％，饲料为市场购买的商品石斑鱼料。每天观察鱼的活动情况，试验期为12天。
淡水石斑鱼300尾，初始质量为(约20±1)g，随机分为3组，每组设2个重复均为独立循环系统，每个重复50尾鱼：对照组在水中不添加任何菌，处理组1每隔7天分别向水中添加万分之一的4×l08cfu/mL的SSRG1-2菌剂，同时饲料按质量比0.1％拌料SSRG1-2菌剂(4×l08cfu/mL)，处理组2和对照组拌清水。处理组1和2在养殖7天后接种广东省微生物研究所菌种保藏中心，嗜水气单胞菌GDIMCC 1.556，接种浓度为6*105cfu/ml。实验鱼在方形塑料水桶中饲养，养殖实际水体积为150L，每天循环处理30分钟，处理量约为总水量的20％，氧气泵连续增氧。试验期间水温基本维持在25～28℃。
3、嗜酸乳杆菌SSRG1-2对淡水石斑鱼免疫的影响
试验起始前和试验结束后的24h内均停止投食，每天观察记录各处理发病率情况，并采集鱼样品检测消化能力(淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活)及免疫指标(酸性磷酸酶ACP、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、丙二醛(MDA)等含量)，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。接种病原菌5天后，不接菌对照组共死亡2条鱼，嗜酸乳杆菌SSRG1-2处理组共死亡3条鱼，接种病原菌且无嗜酸乳杆菌SSRG1-2处理共死亡11条鱼；死亡率分别为4％、6％和22％。鱼体免疫指标结果见图5，嗜酸乳杆菌SSRG1-2能显著提高GSH-Px含量，有提高酸性磷酸酶量的趋势，且嗜酸乳杆菌SSRG1-2处理组丙二醛的产生量最小，表明鱼细胞膜质过氧化程度低，细胞膜受到的伤害较小。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
广东博沃特生物科技有限公司
<120> 一株对水产病原菌有广谱拮抗作用的嗜酸乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1426
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌SSRG1-2(Lactobacillus acidophilus)
<400> 1
tccttcccga aggttaggcc accggctttg ggcattgcag actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcgtgc tgatccgcga ttactagcga 120
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ccaacgtcat caccgaagtg aatctgttgg ttcagctcgc tcgact 1426
Claims (4)
1.嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SSRG1-2，其于2019年12月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：60903，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌SSRG1-2在制备水产养殖中防治病原菌药物中的应用，所述的水产养殖中防治病原菌药物是在水产养殖中防治迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的药物。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水产养殖是盐度为0～2.5％的水产养殖。
4.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌SSRG1-2在制备增强鱼体免疫能力的制剂中应用。
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Legal Events
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