CN111676158B - 一株乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

一株乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新型乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用。所述乳酸片球菌筛选自加州鲈肠道，保藏编号为CCTCC NO:M2020094，能够显著改善水产动物周围环境水质，耐受水产动物胃部酸性环境，稳定性好，提高水产动物的免疫力和抗病力，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。

Description

一株乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用。
背景技术
随着水产品需求量的增加及水产品贸易的国际化发展，水产养殖业近年来发展突飞猛进。但是，水产养殖的集约化和高密度规模日益扩大，养殖环境的恶化和疾病的危害给水产养殖业带来了巨大的经济损失。
加州鲈(Micropterus salmoides)是一种肉质鲜美、无肌间刺、生长快、易起捕、适温较广的肉食性鱼类，在我国水产养殖业中占有很大的比例。随着时间推移，加州鲈养殖病害问题也越来越显现。现在加州鲈发病的时间越来越长，治疗成本越来越高；加州鲈病害日益严重，抗生素成为传统的首选解决途径。然而，使用过量的抗生素不仅会对加州鲈肠道的正常菌群结构产生破坏作用，而且容易导致病原菌产生耐药性，耐药菌株经过水体或鱼体进入人体，最终危害人体健康，破坏周围水环境的微生态平衡，这些现象已引起人们的高度关注。因此寻找抗生素替代品成为必然。
益生菌能够参与动物体内微生物平衡，在水生生物体内既不会出现耐药性也不会产生残留，许多学者将有活性的益生菌作为添加剂添加到饲料中，通过维持肠道菌群平衡来提高动物免疫力，进而达到防病抗病的目的。研究表明，在饲料中添加益生菌不仅可以促进水生动物快速生长，提高存活率，而且可以通过增强水生动物的免疫力来降低疾病的发生率，并能改善其周围环境水质。益生菌通过在有机体肠道内建立微生物群系，保护有机体免疫系统，进而提高有机体免疫力，增强有机体消化吸收能力。益生菌能够直接通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作用，提高动物饲料的转化率。因此，筛选出优异的益生菌成为本领域内的研究热点，也对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株新型乳酸片球菌及其在水产养殖中的应用。所述乳酸片球菌筛选自加州鲈肠道，能够显著改善水产动物周围环境水质，耐受水产动物胃部酸性环境，稳定性好，提高水产动物的免疫力和抗病力，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。
本发明一方面提供了一株乳酸片球菌MST02(Pediococcus acidilacticiMST02)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020094。
本发明一方面提供了所述乳酸片球菌在水质净化中的应用。
本发明一方面提供了所述乳酸片球菌在水产饲料中的应用。
本发明还提供了一种微生态制剂，包含所述乳酸片球菌。
所述微生态制剂还包含地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、双歧杆菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌中的任意一种或两种或多种的组合。
所述微生态制剂中乳酸片球菌的活菌量不低于109CFU/g。
本发明还提供了所述微生物制剂在水产养殖中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的乳酸片球菌MST02能显著改善水产动物周围环境水质，可以有效降解水体中的亚硝态氮，处理48h后，养殖池塘水体中亚硝态氮的去除率高达86.86％。。
所述乳酸片球菌耐酸性好，能够耐受消化道环境，尤其有利于其在有胃水产动物体内发挥益生作用，在pH2.5条件下处理2h后，乳酸片球菌MST02的存活率高达95％，在pH1.5条件下处理2h后，存活率仍超过80％，效果显著。
所述乳酸片球菌能有效抑制副溶血弧菌、灿烂弧菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长，增强免疫力。加州鲈饲喂实验结果显示，通过在饲料中添加乳酸片球菌MST02，益生菌组加州鲈的特定生长率比对照组提高了36.0％，饵料系数降低了19.7％；代表免疫力的各个指标也都得到了明显提高，其中总抗氧化力以及血清中的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活力分别提高了148.7％、45.8％、107.3％、13.0％；此外，注射病原菌灿烂弧菌后2周，益生菌组加州鲈的累计死亡率降低了56.3％，效果非常显著。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
其中实施例中选用的培养基，具体配方如下：
DM培养基：亚硝酸钠1g，碳酸钠1g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.03g，七水合硫酸亚铁0.4g，蒸馏水1000ml，琼脂粉12g，ph7.6-7.8。
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐温-80lml，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.15g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.4，121℃灭菌20min。
MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐温-80lml，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.15g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.4，加入15-20g的琼脂以配制固体培养基，121℃灭菌20min。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1：菌株的分离、筛选与鉴定
1、样品：
采集于青岛胶州市某市场购买的活体加州鲈肠道，无菌操作摘取健康、活力强的加州鲈肠道，待后续分离。
2、筛选方法
(1)富集培养
取肠道样品放入研磨器，放入生理盐水，匀浆，低速离心，使样品中细菌充分散布于上层生理盐水中，10倍梯度稀释。将以上细菌悬液以10％接种量转接于液体MRS培养基，30℃培养24h-48h，得到富集的细菌悬液。
(2)分离
采用10倍稀释法将0.2ml的细菌悬液涂布于DM固体培养基平板中，于30℃恒温箱培养；待平板长出单菌落挑选长势良好的单菌落重复在DM平板划线得到纯化的单菌落。
(3)初筛
选取分离纯化后均匀清晰、长势良好的单菌落，依此命名为A1、A2、A3……、A30。将上述单菌落在MRS液体培养基扩大培养48h。
(4)复筛
将初筛的上述疑似活化菌株接入改良后的MRS(加入30mg/L亚硝酸钠)液体培养基中，30℃培养，定时12h取样，连续取样72h。测定不同时间点发酵液中亚硝酸盐的浓度。申请人共筛选到5株菌株对亚硝酸盐均有不同程度的降解作用，在不同时间点所述5株菌发酵液中亚硝酸盐的浓度详见表1。
表1潜在目标菌株降解亚硝态氮情况
Figure BDA0002528712300000031
Figure BDA0002528712300000041
从表1的数据可以看出，本发明筛选到的5株菌株中A12对亚硝态氮的降解能力最强。发酵48h后，A12菌株发酵液中亚硝态氮的含量降低了93％，72h后，发酵液中的亚硝态氮几乎全部被降解，取得了意料不到的技术效果。
3、菌株鉴定
(1)菌落形态特征：上述A12菌株的菌落小，呈白色，革兰氏阳性，细胞圆球状，在直角两个平面交替分裂形成四联状，可以初步确定是乳酸片球菌；
(2)提取A12菌株的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrRNA序列，通过测序BLAST比对分析，其与已公布的多株乳酸片球菌的16S rRNA序列相似度高达96％，鉴定证实A12菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，与生化鉴定结果一致。
(3)将A12菌株命名为乳酸片球菌MST02(Pediococcus acidilactici MST02)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020094。
实施例2乳酸片球菌MST02在净化养殖水体中的应用
1、菌粉的制备
将乳酸片球菌MST02进行活化，扩大培养，经液态发酵、离心、浓缩、冻干，制成活菌含量约为1010CFU/g的菌粉。
2、实验地点
江苏盐城某加州鲈养殖厂。
3、实验过程
选择6个大小和水质相近的池塘，对照组和实验组各3个平行，分别检测各水体中的亚硝态氮含量。然后向实验组水体中添加10ppm的乳酸片球菌粉剂，对照组不添加。实验水温为28～30℃，实验期间使用相同设备往水体内不间断曝气。48h后分别测定水体中亚硝态氮含量，将3个平行组的检测值取平均值，用于计算亚硝态氮的去除率，具体结果见表2。
去除率(％)＝(初始亚硝态氮含量-终止亚硝态氮含量/初始亚硝态氮含量×100％。
表2处理48h后养殖池塘水体中亚硝态氮的去除情况
组别 初始亚硝态氮含量(mg/L) 终止亚硝态氮含量(mg/L) 去除率％
对照组 1.38±0.05 1.30±0.04 5.79％
实验组 1.37±0.03 0.18±0.02 86.86％
从表2的数据可以看出，本发明提供的乳酸片球菌MST02能有效降解水体中亚硝态氮，处理48h后，养殖池塘水体中亚硝态氮的去除率高达86.86％。因为亚硝态氮能严重影响水产动物的生理代谢，亚硝态氮的降解难题成为水产养殖的一个难题。本发明所述的乳酸片球菌MST02对水体亚硝态氮的降解效果显著，可以用于解决水产养殖水体中亚硝态氮过高的问题，应用前景广阔。
实施例3乳酸片球菌MST02耐胃酸实验
模拟胃液成分为：胰蛋白胨8.5g，葡萄糖3.5g，氯化钠2.05g，氯化钙0.13g，氯化钾0.42g，磷酸二氢钾0.55g，牛胆盐0.05g，溶菌酶0.11g，胃蛋白酶13.5g，蒸馏水1000ml，盐酸分别调节pH为1.5和2.5，115℃灭菌20分钟。
实验对照组选用另一株乳酸片球菌AS1.2696，菌株来自中国科学院微生物研究所。
将乳酸片球菌MST02和乳酸片球菌AS1.2696在同样条件下活化，然后按照0.6％接种量转接入100ml MRS液体培养基，30℃培养24h，将两种菌液分别加入制备的无菌模拟胃液，分别于0h和2h后用平板计数法检测活菌数量，计算菌株的存活率，具体结果见表3。
存活率(％)＝2h时的活菌量/0h时的活菌量×100％。
表3乳酸片球菌在不同酸性条件下的存活情况
Figure BDA0002528712300000051
由表3的数据可知，本发明提供的乳酸片球菌MST02对模拟胃液的耐受性比乳酸片球菌AS1.2696更好，在pH2.5条件下2h后，乳酸片球菌MST02的存活率高达95％，在pH1.5条件下2h后，存活率仍超过80％，效果显著。耐酸性好有利于乳酸片球菌MST02高效的通过有胃鱼类(如加州鲈)的胃，从而更好地在鱼类肠道中改善微环境和促进机体生长，发挥优异的益生功能。
实施例4乳酸片球菌MST02对致病菌的拮抗作用
以副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)为指示菌，采用平板拮抗法检测乳酸片球菌MST02对致病菌的拮抗作用。在涂有指示菌的平板上点种筛选的细菌MST02菌液，空白对照组点种纯水，并设置乳酸片球菌AS1.2696对照组。28℃恒温培养，48h内观察点种区周围是否出现抑菌透明区或覆盖区。具体结果如表4所示。
表4乳酸片球菌抑菌情况
Figure BDA0002528712300000061
从表4的数据可以看出，本发明提供的乳酸片球菌MST02能有效抑制副溶血弧菌和灿烂弧菌两种病原菌的生长，抑菌效果显著优于乳酸片球菌AS1.2696。
实施例5乳酸片球菌MST02对加州鲈生长、免疫性能以及抗病力的影响
本实验设对照组和益生菌组，每组分别设置三个平行，每个平行40尾加州鲈。以加州鲈的商业膨化饲料为基础饲料。其中，对照组饲喂基础饲料，益生菌组饲喂含有108CFU/g乳酸片球菌MST02的饲料。养殖实验持续60天，每日按加州鲈体重的3～5％投喂，根据摄食量情况随时对投饵量进行调整，每天早晚各投喂一次，吸底排污一次。实验期间溶氧≥7mg/l，温度28±l℃，盐度5～8‰，pH 8.0±0.4。养殖实验结束后，对加州鲈进行计数并称重，计算其特定生长率等。尾静脉取血，测定总抗氧化力、血清碱性磷酸酶、血清酸性磷酸酶、血清超氧化物歧化酶活力等指标。以灿烂弧菌为病原菌，腹腔注射加州鲈，进行2周的观察，统计累积死亡率。具体结果见表5。
表5乳酸片球菌MST02对加州鲈生长和免疫性能的影响
Figure BDA0002528712300000062
Figure BDA0002528712300000071
注：不同的字母表示差异显著(P＜0.05)。
从表5的数据可知，与对照组相比，添加了乳酸片球菌MST02的益生菌组加州鲈的存活生长以及饲料利用率都得到了显著提升，其中特定生长率提高了36.0％，饵料系数降低了19.7％；代表免疫力的各个指标也都得到了明显提高，其中总抗氧化力以及血清中的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活力分别提高了148.7％、45.8％、107.3％、13.0％；此外，注射病原菌灿烂弧菌后2周，益生菌组加州鲈的累计死亡率降低了56.3％，效果非常显著。从而说明，本发明提供的乳酸片球菌MST02能有效促进加州鲈的存活生长，增强加州鲈免疫力和抗病能力，进而有利于增加加州鲈的产量和质量，提高加州鲈的养殖效益。
综上，本发明提供的乳酸片球菌MST02既能有效解决水产养殖水体中亚硝态氮过高的问题，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，改善水产动物(包含有胃动物)消化道微环境，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进养殖动物生长，增强养殖动物的免疫力和抗病能力，从而有助于提高养殖户的经济效益。此外，乳酸片球菌MST02能有效抑制水体中病原菌，应用前景广阔。

Claims (6)

1.一种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），其特征在于，所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC NO: M 2020094。
2.权利要求1所述的乳酸片球菌在净化水体中的应用。
3.一种微生态制剂，其特征在于，所述的微生态制剂中包含权利要求1所述的乳酸片球菌。
4.如权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述的微生态制剂还包含地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、双歧杆菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌中的任意一种或两种或多种的组合。
5.如权利要求3或4所述的微生态制剂，其特征在于，所述的微生态制剂中乳酸片球菌的活菌量不低于109CFU/g。
6.权利要求3-5任一所述的微生态制剂在净化水体中的应用。
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