CN113388550A - 一株唾液乳杆菌NHE-LsE33及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)NHE‑LsE33，该菌分离仔猪肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22510，保藏日期为2021年5月12日。本发明的唾液乳杆菌NHE‑LsE33具有显著的益生性，可有效抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖。本发明的唾液乳杆菌NHE‑LsE33可制备成微生态制剂应用于动物养殖，拓宽饲用微生态制剂菌种。

Description

一株唾液乳杆菌NHE-LsE33及应用
技术领域
本发明属于饲用益生菌领域，具体的说，特别涉及一株益生唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)NHE-LsE33及其应用。
背景技术
饲料发霉、霉变及霉变真菌产生的毒素直接影响着饲料储藏加工的质量和安全，严重地危害了畜禽和人类健康。饲料发霉或被霉菌污染后，大多数霉菌为非产毒性霉菌，这类霉菌降底了饲料的适口性以及饲料的营养价值；少部分霉菌为产毒素霉菌，可引起畜禽发生急性或慢性中毒，有的霉菌毒素还具有致癌、致畸和致突变等毒性作用。
目前，预防饲料及饲料原料发生霉变的方式主要是以降低原料含水量，加强生产和存储方面的管理以及添加甲酸、丙酸盐类、山梨酸等单一或复合防霉剂。这些方式在实际生产中效果往往不是很理想，未能从根本上抑制或杀灭霉菌。益生菌产生的次级代谢产物，具有高效、安全、无残留、无抗药性等多重优势，畜禽食入后能够调整或维持畜禽肠道内微生态平衡，促进乳酸菌等有益菌的增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的生长，可有效增强机体的免疫功能，促进营养物质的吸收和转化，从而达到防病治病、提高饲料转化率及畜禽生产性能的效果。
在中国专利申请CN-201911058478中公开了一种唾液乳杆菌358及其应用，尽管其是有效的，但和本发明完全不同。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有益生作用的唾液乳杆菌(Lactobaci//us sa/ivarius)NHE-LsE33及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)NHE-LsE33是从健康仔猪肠道内容物中分离的唾液乳杆菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为唾液乳杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株具有较强的广谱抑菌能力，耐酸性、耐胆盐性、存活能力强，产酸性和发酵性能强等。
本发明提供的唾液乳杆菌(Lactobaci//us sa/ivarius)NHE-LsE33，已于2021年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为唾液乳杆菌(Lactobaci//us sa/ivarius)，保藏编号为CGMCC No.22510。
本发明提供的唾液乳杆菌(Lactobaci//us sa/ivarius)NHE-LsE33具有以下微生物学特征：唾液乳杆菌NHE-LsE33是革兰氏阳性杆菌，在MRS琼脂培养基上生长良好，培养48h，形成圆形菌落，菌落直径1-2mm，呈乳白色，表明光滑，不透明，中间凸起，边缘整齐，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈杆状，无芽孢，兼性厌氧，生长适宜温度范围为25℃-50℃，最佳生长温度为30℃-40℃，生长pH为3.5-8.0，最适pH为4.5-7.5。部分生理生化特性如表1。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33的液体菌剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33的微生态制剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33的动物饮水用饲料添加剂。
饲料添加剂中唾液乳杆菌NHE-LsE33的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中唾液乳杆菌NHE-LsE33的活菌数为1×106CFU/g。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。
另外，本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂在断奶仔猪生产中的应用。
另外，本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂在生长育肥猪生产中的应用。
本发明中所述唾液乳杆菌NHE-LsE33的培养方法如下：
取唾液乳杆菌NHE-LsE33(保藏编号为CGMCC No.22510)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)2mL，接种于100mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行10L种子发酵罐培养，取100mL摇瓶发酵种子液接种到10L种子发酵罐中进行种子培养，10L发酵罐装液量为5L种子培养基。培养结束后，取5L种子液接种到100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-4％，葡萄糖0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，大豆蛋白胨0.5-2％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-800.05-0.2％，余量为水。
优选为：蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，酵母浸粉0.8％，大豆蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.02％，吐温-800.1％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量1-10％(体积比)，发酵温度为28-38℃、初始pH5.0-7.5、80-300r/min，发酵时间16-48h。
优选为：接种量2％(体积比)，发酵温度为37℃、初始pH7.0、180r/min，发酵时间24h。
所述100L发酵罐的培养基成分为：绵白糖0.5-4％，玉米浆干粉0.5-4％，乳酸菌营养素0.2-3％，大豆蛋白胨0.5-3％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-800.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1.5％，玉米浆干粉1％，乳酸菌营养素1％，大豆蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.02％，吐温-800.1％，余量为水。
所述100L发酵罐的培养基成分为：初始pH5.0-7.5，装液量为60-70L培养基，控制罐压0.03-0.06MPa，接种量为700mL-7L，发酵温度为30-40℃，发酵时间20-48h，搅拌转速80-300r/min。
优选为：初始pH7.0，控制pH5.5，装液量为70L培养基，控制罐压0.05MPa，接种量为5L，发酵温度为37℃，发酵时间24h，搅拌转速200r/min。
本发明中所述唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂制备方法如下：
将唾液乳杆菌NHE-LsE33(保藏编号为CGMCC No.22510)按实施例2方法制备NHE-LsE33发酵液，将该发酵液于13000r/min离心10min得植物乳杆菌NHE-LsE33活性菌泥，然后将植物乳杆菌活性菌泥和水按1：2的重量比例混合均匀，获得高浓度菌体悬液。将唾液乳杆菌NHE-LsE33菌体悬液和保护剂按1：1.5的重量比例混合均匀，制成微囊湿粉，通过制粒机制备成湿颗粒，然后与包被剂溶液混合均匀，投入流化干燥床，进行干燥包衣，获得NHE-LsE33微生态制剂，有效活菌数2.2×1010CFU/g。
所述保护剂为：食用玉米淀粉10-70％，羧甲基纤维素钠1-5％，葡聚糖1-8％，脱脂奶粉5-20％，糊化变性淀粉5-20％，蔗糖0.5-5％，蛋白胨0.5-5％，海藻糖0.1-2.5％，甘油1-10％，微晶纤维素1-10％，二氧化硅1-2.5％，余量为水。
优选为：食用玉米淀粉50％，羧甲基纤维素钠2％，葡聚糖2％，脱脂奶粉15％，糊化变性淀粉10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，海藻糖2％，甘油5％，微晶纤维素5％，二氧化硅1.8％，余量为水。
所述包被剂溶液为：海藻酸钠2-20％，羟甲基纤维素10-25％，壳聚糖10-30％，甘露聚糖1-10％，余量为水。
优选为：海藻酸钠10％，羟甲基纤维素6.5％，壳聚糖8.5％，甘露聚糖4％，余量为水。
本发明唾液乳杆菌NHE-LsE33的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
本发明唾液乳杆菌NHE-LsE33的抗逆性检验方法如下：
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
2、耐人工肠液性能测定
取1mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
本发明唾液乳杆菌NHE-LsE33预防和治疗腹泻的检验方法：
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加唾液乳杆菌发酵液，添加浓度为1×106CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加唾液乳杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×106CFU/mL浓度的唾液乳杆菌NHE-LsE33发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的唾液乳杆菌NHE-LsE33抑菌性能强、产酸能力强、抗逆性强、发酵力强；经发酵培养基和工艺优化，37℃发酵24h，发酵液活菌数可达到1.2×1010CFU/mL，适合饲用益生菌剂生产，为以后发展奠定了坚实的菌种基础。
(2)本发明的唾液乳杆菌NHE-LsE33具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，特别是对水产动物病原菌抑菌效果突出，具有广谱抑菌性。
(3)本发明中的唾液乳杆菌NHE-LsE33可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠攻毒试验，试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组(P＜0.05)；沙门氏菌攻毒后，试验组小鼠精神状态和存活率明显高于负对照组。表明饲喂唾液乳杆菌NHE-LsE33菌液可有效预防和治疗小鼠腹泻，提高小鼠受病原菌攻毒的存活率，并能够促进小鼠生长。
(4)本发明唾液乳杆菌NHE-LsE33制备的微生态制剂应用于断奶仔猪生产，试验组仔猪皮毛亮，形体健美，活泼好动。与对照组相比，饲料中添加微生态制剂后可显著提高试验组仔猪的日增重，显著降低料肉比0.11，显著降低腹泻率。促进断奶仔猪的生长和饲料转化率，从而提高养猪效益。
(5)本发明唾液乳杆菌NHE-LsE33制备的微生态制剂应用于生长育肥猪猪生产，试验组料肉比显著高于对照组(P＜0.05)提高饲料转化率，试验组猪肉肉色红度值显著高于对照组(P＜0.05)，滴水损失显著低于干料组(P＜0.05)，大理石纹评分显著优于对照组(P＜0.05)，改善育肥猪肉质，从而生产健康安全猪肉，保证人民食品安全。
附图说明
图1是唾液乳杆菌NHE-LsE33在MRS培养基上的菌落形态图。
图2是唾液乳杆菌NHE-LsE33菌株的革兰氏染色图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1唾液乳杆菌NHE-LsE33的分离、筛选及鉴定
1、乳酸菌的分离纯化：
将健康仔猪屠宰取肠道后迅速在无菌条件下采集肠道内容物2.5克，置于盛有22.5mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于改良的MRS琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养48h，用接种环挑取溶钙圈明显且大于5mm的疑似乳酸菌的菌落在MRS琼脂平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于MRS琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于-80℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察：
根据步骤1中溶钙圈大小，初步筛选出产酸能力强的菌株可初步确定为乳酸菌，共236株。将步骤1保存的甘油管菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的不产芽胞细菌作为备用。
3、乳酸菌菌悬液和发酵液制备
将步骤1获得的乳酸菌在MRS琼脂平板上划线37℃培养48h，从平板上挑取单菌落于100mL MRS液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养24h，获得乳酸菌菌悬液备用；继续37℃，180r/min震荡培养96h，获得乳酸菌发酵液备用。
4、抑菌性乳酸菌的筛选：
取致病菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的营养琼脂培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个(致病菌产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)。在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似乳酸菌菌株发酵液(步骤3获得)于牛津杯中，于37℃下恒温培养24h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有9株，并分别标号为E1、E7、E33、E36、E65、E78、E102、E156、E202。
5、产酸性能测定：
将步骤3种获得的乳酸菌菌悬液按1％(体积比)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，每小时测一次pH值，同时采用HPLC检测发酵液中乳酸含量，乳酸菌发酵过程中随着时间的延长pH逐渐下降，同时乳酸含量也随时间延长而逐渐增加，选择产酸能力最强的菌株E33，其在发酵18h时乳酸产量最高达18.92g/L，pH为4.01。
6、菌株属的鉴定：
对菌株E33进行了形态和生理生化鉴定，菌株E33在MRS平板上能良好生长，培养48h，形成圆形菌落，菌落直径1-2mm，呈乳白色，表明光滑，不透明，中间凸起，边缘整齐，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈杆状，无芽孢，兼性厌氧，生长适宜温度范围为25℃-50℃，最佳生长温度为30℃-40℃，生长pH为3.5-8.0，最适pH为4.5-7.5。通过对菌株E33进行生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株的种属。结果显示菌株E33为乳杆菌属。
表1菌株E33的部分生理生化特征
Figure BDA0003165706580000091
Figure BDA0003165706580000101
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
7、16S rDNA测序测定：
采用细菌DNA提取的试剂盒提取E33菌株基因组DNA。通过引物F和R对E33菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株E33与唾液乳杆菌的同源性达到99.93％。通过菌株E33的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株E33为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，并正式标号为NHE-LsE33。
8、菌株保藏：
上述经分离、纯化、筛选得到的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)NHE-LsE33已于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22510，分类命名为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)。
所述改良MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO4 0.025％，琼脂1.8％，碳酸钙1％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，琼脂1.8％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS肉汤培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCI 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基组成为：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
实施例2唾液乳杆菌NHE-LsE33发酵液的制备
取唾液乳杆菌NHE-LsE33(保藏编号为CGMCC No.22510)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)2mL，接种于100mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行10L种子发酵罐培养，取100mL摇瓶发酵种子液接种到10L种子发酵罐中进行种子培养，10L发酵罐装液量为5L种子培养基。培养结束后，取5L种子液接种到100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为1.2×1010CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-4％，葡萄糖0.5-2％，酵母浸粉0.5-2％，大豆蛋白胨0.5-2％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-800.05-0.2％，余量为水。
优选为：蔗糖1.5％，葡萄糖0.5％，酵母浸粉0.8％，大豆蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.02％，吐温-800.1％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量1-10％(体积比)，发酵温度为28-38℃、初始pH5.0-7.5、80-300r/min，发酵时间16-48h。
优选为：接种量2％(体积比)，发酵温度为37℃、初始pH7.0、180r/min，发酵时间24h。
所述100L发酵罐的培养基成分为：绵白糖0.5-4％，玉米浆干粉0.5-4％，乳酸菌营养素0.2-3％，大豆蛋白胨0.5-3％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1.5％，玉米浆干粉1％，乳酸菌营养素1％，大豆蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.02％，吐温-80 0.1％，余量为水。
所述100L发酵罐的培养基成分为：初始pH5.0-7.5，装液量为60-70L培养基，控制罐压0.03-0.06MPa，接种量为700mL-7L，发酵温度为30-40℃，发酵时间20-48h，搅拌转速80-300r/min。
优选为：初始pH7.0，控制pH5.5，装液量为70L培养基，控制罐压0.05MPa，接种量为5L，发酵温度为37℃，发酵时间24h，搅拌转速200r/min。
实施例3唾液乳杆菌NHE-LsE33益生性验证
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaGl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
表2唾液乳杆菌NHE-LsE33对病原菌的抑菌效果
Figure BDA0003165706580000121
Figure BDA0003165706580000131
实施例4唾液乳杆菌NHE-LsE33抗逆性验证
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表3所示。从表3中可以看出，唾液乳杆菌NHE-LsE33在pH2.0的人工胃液(含酶)中处理3h存活率90.34％，胃液刚分泌pH值为1.5，和胃中物质混合后在2-4之间，表明该菌株NHE-LsE33具有较高的耐酸性，可以耐受胃酸，能顺利到达肠道发挥作用。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
表3唾液乳杆菌NHE-LsE33在人工胃液中处理后3h的存活情况
处理 pH1.5 pH2.0 pH2.5
初始活性CFU/mL 4.35×10<sup>9</sup> 4.35×10<sup>9</sup> 4.35×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 3.61×10<sup>9</sup> 3.93×10<sup>9</sup> 4.21×10<sup>9</sup>
处理后存活率％ 82.99 90.34 96.78
2、耐人工肠液性能测定
取1mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果显示，唾液乳杆菌NHE-LsE33在人工肠液中活性不减少，存活率100％，表明该菌株能很好在肠液中生存并保存活力，从而发挥其益生作用。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表4所示。唾液乳杆菌NHE-LsE33在0.3％胆盐溶度的溶液中处理2小时，存活率为90.34％，表明该菌株具有较高的耐胆盐性，可以耐受十二指肠液中的胆盐，使菌株能到达肠道去发挥作用。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
表4唾液乳杆菌NHE-LsE33在不同浓度胆盐溶液中处理2h后的存活情况
处理 0.15％ 0.3％ 1％ 1.5％
初始活性CFU/mL 4.35×10<sup>9</sup> 4.35×10<sup>9</sup> 4.35×10<sup>9</sup> 4.35×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 4.13×10<sup>9</sup> 3.93×10<sup>9</sup> 3.14×10<sup>9</sup> 2.98×10<sup>9</sup>
处理后存活率％ 94.94 90.34 72.18 68.51
实施例5唾液乳杆菌NHE-LsE33急性毒性试验
唾液乳杆菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标GB15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分三次对小白鼠进行灌胃，0.25g/mL唾液乳杆菌NHE-LsE33菌液(相当于15000mg/kg体重)，连续灌服2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。
试验期间，小鼠精神状态良好，无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。
实施例6小鼠攻毒试验
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加唾液乳杆菌发酵液，添加浓度为1×106CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加唾液乳杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×106CFU/mL浓度的唾液乳杆菌NHE-LsE33发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
所述贝唾液乳杆菌发酵液为实施例2制备的发酵液，然后通过离心收集菌体，收集获得的菌体用生理盐水洗涤3-5次除去发酵液。
沙门氏菌攻毒后，通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出，发病严重小鼠眼睛带血，不能睁开。攻毒后，第1天，负对照组开始有发病症状，且死亡4只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。试验组在第1天死亡2只，其它小鼠3天内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常。
攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表6所示，试验组小鼠攻毒后中毒现象不严重，表明唾液乳杆菌NHE-LsE33对沙门氏菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受沙门氏菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。
表5小鼠增重情况
分组 平均始重(g/只) 平均末重(g/只) 平均增长率(％)
对照组 15.14±0.22 29.23±0.56 93.06<sup>b</sup>
负对照组 15.56±0.38 29.12±0.51 87.15°
试验组 15.12±0.34 37.33±1.21 146.89a
表6攻毒前、后的小鼠死亡情况
Figure BDA0003165706580000161
实施例7唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂制备
将唾液乳杆菌NHE-LsE33(保藏编号为CGMCC No.22510)按实施例2方法制备NHE-LsE33发酵液，将该发酵液于13000r/min离心10min得植物乳杆菌NHE-LsE33活性菌泥，然后将植物乳杆菌活性菌泥和水按1∶2的重量比例混合均匀，获得高浓度菌体悬液。将唾液乳杆菌NHE-LsE33菌体悬液和保护剂按1∶1.5的重量比例混合均匀，制成微囊湿粉，通过制粒机制备成湿颗粒，然后与包被剂溶液混合均匀，投入流化干燥床，进行干燥包衣，获得NHE-LsE33微生态制剂，有效活菌数2.2×1010CFU/g。
所述保护剂为：食用玉米淀粉10-70％，羧甲基纤维素钠1-5％，葡聚糖1-8％，脱脂奶粉5-20％，糊化变性淀粉5-20％，蔗糖0.5-5％，蛋白胨0.5-5％，海藻糖0.1-2.5％，甘油1-10％，微晶纤维素1-10％，二氧化硅1-2.5％，余量为水。
优选为：食用玉米淀粉50％，羧甲基纤维素钠2％，葡聚糖2％，脱脂奶粉15％，糊化变性淀粉10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，海藻糖2％，甘油5％，微晶纤维素5％，二氧化硅1.8％，余量为水。
所述包被剂溶液为：海藻酸钠2-20％，羟甲基纤维素10-25％，壳聚糖10-30％，甘露聚糖1-10％，余量为水。
优选为：海藻酸钠10％，羟甲基纤维素6.5％，壳聚糖8.5％，甘露聚糖4％，余量为水。
实施例8唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂对断奶仔猪生长性能影响
试验选用同胎次、体重相近(杜洛克×长白×大白)三元杂交断奶仔猪(公母各半，28天断奶)384头，随机分成两组(对照组和试验组)，每处理6栏，每栏32头，在相同环境下进行饲养试验。对照组饲粮为基础饲粮(参照中国猪饲养标准)，试验组饲粮中添加实施例7制备的微生态制剂，使每次饲喂前唾液乳杆菌NHE-LsE33在饲料中的活菌数达到≥1×106CFU/g。试验开始前，对猪舍进行全面的消毒。对照组猪群采用干料桶饲喂模式，试验猪群采用液态粥料机，均自由采食和饮水。每天记录投料量及健康状况，定期观察猪只皮毛亮度及粪便状况，其他饲养管理均相同。在试验过程中，试验组仔猪皮毛亮，形体健美，活泼好动。与对照组相比，饲料中添加微生态制剂后可显著提高试验组仔猪的日增重，显著降低料肉比0.11，显著降低腹泻率。(表7)
表7微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响
Figure BDA0003165706580000171
Figure BDA0003165706580000181
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
实施例9唾液乳杆菌NHE-LsE33微生态制剂对生长育肥猪的影响
选取健康、体重30kg左右、公母比例一致、日龄相近的(杜洛克×长白×大白)三元商品育肥猪240头，完全随机分成2组(对照组和试验组)，每组20个栏，每栏6头猪。对照组：试验饲粮为基础日粮(参照中国猪饲养标准)；试验组饲粮中添加实施例7制备的微生态制剂，使每次饲喂前唾液乳杆菌NHE-LsE33在饲料中的活菌数达到≥1×106CFU/g。试验猪采用封闭式圈舍，每日喂4次，自由采食和饮水，每日清扫圈舍至少3次，饲喂60天。饲养管理及其免疫程序与猪场日常管理相同，定期消毒，发现猪生病及时治疗。试验结果显示，试验组料肉比显著高于对照组(P＜0.05)，提高了生长性能(表8)。肉质结果显示(表9)，试验组猪肉肉色红度值显著高于对照组(P＜0.05)，滴水损失显著低于干料组(P＜0.05)，大理石纹评分显著优于对照组(P＜0.05)。
表8微生态制剂对育肥猪生长性能的影响
指标 对照组 试验组
初重(kg) 29.36±1.32 29.76±2.23
末重(kg) 97.45±8.12<sup>b</sup> 109.37±9.21<sup>a</sup>
平均日增重(kg/d) 1.13±0.03<sup>b</sup> 1.32±0.07<sup>a</sup>
平均日采食量(kg/d) 2.47±0.12<sup>b</sup> 2.62±0.09<sup>a</sup>
料肉比 2.19±0.21<sup>b</sup> 1.98±0.54<sup>b</sup>
表9微生态制剂对育肥猪肉品质的影响
Figure BDA0003165706580000182
Figure BDA0003165706580000191
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新希望六和股份有限公司
四川新希望畜牧科技有限公司
成都枫澜科技有限公司
<120> 一株唾液乳杆菌NHE-LsE33及应用
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<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> Lactobacillus salivarius
<400> 1
tgcagtcgaa cgaaactttc ttacaccgaa tgcttgcatt caccgtaaga agttgagtgg 60
cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctaaaagaa ggggataaca cttggaaaca 120
ggtgctaata ccgtatatct ctaaggatcg catgatcctt agatgaaaga tggttctgct 180
atcgctttta gatggacccg cggcgtatta actagttggt ggggtaacgg cctaccaagg 240
tgatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag acacggccca 300
aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca 360
acgccgcgtg agtgaagaag gtcttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacacg 420
agtgagagta actgttcatt cgatgacggt atctaaccag caagtcacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagg 540
gaacgcaggc ggtcttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agtagtgcat 600
tggaaactgg aagacttgag tgcagaagag gagagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaagcggct ctctggtctg taactgacgc 720
tgaggttcga aagcgtgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa cgcaataagc 840
attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960
atcctttgac cacctaagag attaggtttt cccttcgggg acaaagtgac aggtggtgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tgttgtcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggcgag actgccggtg acaaaccgga 1140
ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200
caatggacgg tacaacgagt cgcgagaccg cgaggtttag ctaatctctt aaagccgttc 1260
tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcga 1320
atcagcatgt cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380
gagtttgtaa cacccaaagc cggtggggta accgcaagga gccagccgtc taa 1433

Claims (10)

1.一株唾液乳杆菌NHE-LsE33，分类命名为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)NHE-LsE33，于2021年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22510，保藏地址为中国北京。
2.一种含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33的液体菌剂。
3.一种含有保藏编号为CGMCC No.22510的唾液乳杆菌NHE-LsE33的微生态制剂。
4.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33在动物饮水用饲料添加剂上的应用。
5.如权利要求4所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33在动物饮水用饲料添加剂上的应用，饲料添加剂中唾液乳杆菌NHE-LsE33的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中唾液乳杆菌NHE-LsE33的活菌数为1×106CFU/g。
6.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
7.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
8.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用，所述的广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
9.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在食品制造中的应用，优选地，所述的食品为动物用食品。
10.如权利要求1-3之一所述的唾液乳杆菌NHE-LsE33或含有其的菌剂在断奶仔猪生产中和在生长育肥猪生产中的应用。
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