CN116200313A - 一株唾液乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株唾液乳杆菌及其应用，所述唾液乳杆菌命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS‑23‑1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。本发明唾液乳杆菌（lactobacillus salivarius）RS‑23‑1可提高动物的免疫力、增强仔猪肠道的抗炎能力，从而减少诱发仔猪肠道炎症的发生。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其是涉及一株唾液乳杆菌及其应用。
背景技术
近年来，仔猪腹泻越来越普遍。30kg以下的仔猪年平均发病率为46.5％，死亡率为10.3％，是养猪业的一大危害。仔猪拉稀腹泻对养猪业的发展有很大的阻碍，导致饲料收益低，仔猪成活率降低，生产缓慢，给养猪业带来很大的经济损失。因此，防治仔猪腹泻已成为广大养猪人关注的问题。
引起仔猪腹泻的主要原因是大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌，目前对于细菌性仔猪腹泻，通常我们选择抗菌药物、抗生素例如庆大霉素和阿莫西林等等进行治疗，但是长期使用这些药物会产生耐药性，导致使用这些抗生素药物治疗肠道疾病的效果并不好。
乳酸杆菌是动物体内的有益菌之一，研究表明，乳酸菌具有抑菌作用，虽然目前国内外对乳酸杆菌的研究报道很多，但是对于使用猪源乳酸杆菌用于治疗仔猪肠道炎症的报道还很少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株唾液乳杆菌及其应用。本发明唾液乳杆菌可提高动物的免疫力、增强仔猪肠道的抗炎能力，从而减少诱发仔猪肠道炎症的发生。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
第一个方面，本发明提供一株唾液乳杆菌，所述唾液乳杆菌命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。
进一步地，所述唾液乳杆菌RS-23-1的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
第二个方面，本发明提供上述第一个方面所述唾液乳杆菌RS-23-1在制备益生菌剂上的应用。
第三个方面，本发明提供一种益生菌剂，含有上述第一个方面所述的唾液乳杆菌RS-23-1。
优选地，所述唾液乳杆菌RS-23-1的活菌数为1×1010CFU/g。
第四个方面，本发明提供一种益生菌剂的制备方法，包括以下步骤：将唾液乳杆菌RS-23-1涂布接种在MRS培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养，将菌种继续发酵制备菌悬液，调整菌悬液中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×1010CFU/g。
优选地，继续传代培养的代数为三代。
优选地，菌种继续发酵的条件是：温度为37℃，pH=5.0～5.5，时间为24h。
第五个方面，本发明提供上述第一个方面所述的唾液乳杆菌或上述第三个方面所述的益生菌剂或按照上述第四个方面所述的方法制备的益生菌剂在制备用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症产品中的应用。
第六个方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症的药物，包括上述第一个方面所述的唾液乳杆菌或上述第三个方面所述的益生菌剂或按照上述第四个方面所述的方法制备的益生菌剂或唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物。
优选地，所述产品在基础饲粮中的添加量为饲粮中唾液乳杆菌活菌数为1×107CFU/g。
本发明所具有的优点和有益效果是：
本发明猪源唾液乳杆菌RS-23-1经16SrRNA基因序列进行鉴定，鉴定为唾液乳杆菌（lactobacillus salivarius），命名为唾液乳杆菌（lactobacillus salivarius）RS-23-1，本发明唾液乳杆菌（lactobacillus salivarius）RS-23-1可提高动物的免疫力、增强仔猪肠道的抗炎能力，从而减少诱发仔猪肠道炎症的发生。
本发明的唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1的保藏信息如下：
保藏编号：CGMCC No.26619；
分类命名：唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius；
保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；
保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2023年2月21日。
附图说明
图1为候选菌抑菌圈效果图，其中：A为大肠杆菌；B为金色葡萄球菌；C为沙门氏菌；1为RS-23-1；3为RS-23-3；5为RS-23-5；7为RS-23-7；15为RS-23-15；
图2为本申请中猪源乳酸杆菌的生长状态示意图；
图3为不同处理下RAW 264.7细胞形态变化（400×），其中：A为对照组，B为LPS组；C为乳杆菌组；D为LPS+乳杆菌组；
图4为 猪源乳酸杆菌RS-23-1生长曲线；
图5为 RS-23-1对细胞No分泌量的影响，其中：*表示差异极显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在下述实施例中：
MRS固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，MgSO4·7H20 0.58g，MnSO4·4H20 0.25g,琼脂 15-20g,蒸馏水1000mL。
LB 琼脂培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂 15-20g。
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，MgSO4·7H20 0.58g，MnSO4·4H20 0.25g,蒸馏水1000mL。
DMEM完全培养液：二水合氯化钙 265.00mg/L,九水合硝酸铁 0.10 mg/L，氯化钾400.00mg/L，无水硫酸镁 97.67mg/L，氯化钠 6400.00mg/L，无水磷酸镁 109.00mg/L，丁二酸 75.00mg/L，丁二酸钠100.00mg/L，L-盐酸精氨酸 84.00 mg/L，L-盐酸胱氨酸63.00 mg/L，甘氨酸 30.00mg/L，L-盐酸组氨酸42.00mg/L，L-异亮氨酸105.00mg/L，L-亮氨酸105.00mg/L，L-盐酸赖氨酸146.00mg/L，L-甲硫氨酸30.00mg/L，L-苯丙氨酸66.00mg/L。
实施例1
本实施例提供一种益生菌剂的制备方法，步骤如下：
将猪源唾液乳杆菌RS-23-1涂布接种100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，然后接种至20 L自动发酵罐中（37℃，pH=5.0～5.5，24h）制备成益生菌液，应用平板计数法计算所生产菌液的活菌数，样品中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×1010CFU/g。本实施例中MRS固体培养基的用量是在10mm的培养板里面铺3mm厚的MRS固体培养基。
实施例2
本实施提供一种唾液乳杆菌无细胞提取物的制备方法，步骤如下：
将活化后的保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌RS-23-1按 2％（v/v）接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，8000 g离心10 min，4 ℃，收集菌体，所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于 PBS，调整密度为1×109CFU／mL，得到唾液乳杆菌菌悬液；
将唾液乳杆菌菌悬液在冰浴条件下超声破碎，离心，收集上清液，得到无细胞提取物。所述超声破碎的条件为250 W，超声5 s，间隔10 s，共10 min。
实施例3
本实施例提供一种用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症的药物，该药物包括保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌或含有该唾液乳杆菌的益生菌剂或该唾液乳杆菌无细胞提取物。所述药物还可以包括药用辅料。所述药物的剂型可以是粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
实施例4
本实施例提供一种用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症的饲料添加剂，该添加剂包括保藏编号为CGMCC No.26619的唾液乳杆菌或含有该唾液乳杆菌的益生菌剂或该唾液乳杆菌无细胞提取物。
实验例1：猪源唾液乳杆菌RS-23-1的筛选与鉴定
1、猪源唾液乳杆菌RS-23-1的分离筛选:
以四川绵阳本地猪的新鲜猪粪为样本，无菌称取猪粪便0.1g加入到装有 0.9 mL无菌 PBS缓冲液 的1.5 mL 离心管，涡旋混匀后三层纱布过滤，取滤液，用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释至 10-3、10-4、10-5，取各梯度稀释液均匀涂布于含碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒温培养24 h，挑取不同形态、色泽且有溶钙圈的单一菌落划线接种至MRS固体培养基中，37℃恒温培养24 h，如此纯化3次直至得到纯菌株。初步筛选分离到20株革兰阳性的猪源乳酸菌， 编号分别为 RS-23-1 至RS-23-20。
制备猪源乳酸菌悬液：
将初步筛选分离到的编号为 RS-23-1 至RS-23-20的20株革兰阳性的乳酸菌分别涂布接种在100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，分别将菌种继续接种至20 L自动发酵罐中（37℃，pH=5.0～5.5，24h）制备成浓度为 1×109cfu/mL的菌悬液。其中MRS固体培养基的用量是在10mm的培养板里面铺了3mm厚的MRS固体培养基。
2．猪源唾液乳杆菌拮抗病原菌特性筛选
在已制备好的无菌 LB 琼脂培养基上分别滴加菌液浓度为 1×109cfu/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌各1 mL，用一次性涂布棒将菌液均匀铺开覆盖于培养基表面；静置 1 min 后用移液枪吸出多余菌液，然后用直径7 mm的无菌打孔器打孔，火焰下封板；待凝固后往孔中加入100 μL 浓度为 1×109cfu/mL 的各猪源乳酸菌悬液，37 ℃恒温培养24 h，每种益生菌做3个平行，用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm），用抑菌圈直径的大小表示益生菌抑菌活性。
抑制病原菌试验，通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的抑制，初筛得到抑菌效果良好的乳酸菌2株，分别为RS-23-1、RS-23-15，其中RS-23-1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，抑菌结果如表1、图1所示。将通过抑菌试验所得优势菌株保存，进行下一步耐受消化道环境的复筛。
表1候选菌抑菌试验结果
3．猪源唾液乳杆菌耐酸耐胆盐筛选
为进一步对候选菌株耐受消化道环境的复筛，进行了耐酸耐胆盐的试验，实验步骤如下：
耐胆盐实验：1. 将过夜培养的菌株（根据生长曲线确定菌液浓度和培养时间）按5% （v/v）接种于不同胆盐水平( 体积浓度分别为0. 15 % 和 0. 3 % ) 的 MRS液体培养基中，37 ℃放置 2 h；
2. 分别在 0 和 2 h 取 100 μL 菌液逐级稀释（根据初始浓度判定稀释浓度），稀释液涂布MRS固体培养基，37℃培养24或48h，菌落计数；
3. 计算成活率。每个样品3个重复。
存活率（%）=“2 h”菌落数/“0 h”菌落数 ×100%
耐酸实验：1. 将过夜培养的菌液按5 %（v/v）接种到 pH 为 2 和 3的 MRS 液体培养基中，37 ℃放置2 h；
2. 分别在0 和2 h取 100 μL 菌液逐级稀释（10-3、10-5、10-7），稀释液涂布MRS平板，37℃培养24或48h，菌落计数；
3. 计算成活率。每个样品3个重复。
存活率（%）=“2 h”菌落数/“0 h”菌落数 ×100%。
试验结果如表2。在PH在2和3的环境下，RS-23-1的存活率均最高，综上表明RS-23-1的耐酸性最佳。在0.15%胆盐的环境下，两株菌均有一定耐受力；而在0.3%胆盐的环境下，RS-23-1的耐受力最佳。综合耐酸耐胆盐的结果，RS-23-1具有良好的耐酸耐胆盐特性，并确定为目标菌株。
表2 两株筛选菌株的酸和胆盐耐受力
4、猪源唾液乳杆菌RS-23-1的鉴定：
在分离出纯净的乳酸杆菌的单个菌落之后,对该菌落进行鉴定。本申请中猪源唾液乳杆菌RS-23-1的鉴定过程可以为：根据分离纯化后得到的乳酸杆菌的菌落进行处理，通过对分离纯化得到的乳酸杆菌的细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列进行鉴定，鉴定为唾液乳杆菌，命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）RS-23-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。鉴定数据如下：
4.1 形态学鉴定
图2为本申请乳酸杆菌RS-23-1的生长状态示意图，其菌落形态如表3所示。
表3 RS-23-1菌落形态
4.2 生理生化特性鉴定
分离菌株的生理生化特征见表4。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》进行对照分析，初步判定RS-23-1为产乳酸乳杆菌属细菌。
表4 RS-23-1生理生化鉴定结果
注: +表示阳性；-表示阴性
4.3 猪源唾液乳杆菌的分子鉴定：
采用细菌鉴定 16S rDNA 通用引物 27F及1492R 进行PCR扩增，引物序列如表5所示，引物由上海生工生物科技有限责任公司合成。
表 5 16S rDNA 引物序列
PCR 扩增模板为活化后的新鲜菌液，体系为 50μL，详见表6。
表 6 PCR 反应体系
PCR 扩增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 45 s；55℃ 45 s；72℃ 1 min；重复 35个循环；72℃ 8 min。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后于上海生工生物有限公司测序，在GenBank进行BLAST比对分析。
猪源唾液乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
5．猪源唾液乳杆菌RS-23-1的生物学特性分析
图4 所示为猪源唾液乳杆菌RS-23-1在37℃、有氧条件下的生长曲线，通过对猪源唾液乳杆菌RS-23-1生长曲线的测定，可以发现RS-23-1在8 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定期。
实验例2：菌液制备及体外抗炎活性检测
（1）样品菌液的提取
将活化后的唾液乳杆菌按 2％（v/v）接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h，8000g离心10 min，4 ℃，分别收集上清液和菌体，所得的菌体用无菌水洗涤2～3次，重悬于 PBS缓冲液，调整密度为1×109CFU／mL，在冰浴条件下超声破碎（250 W，超声5 s，间隔10 s，共10 min)，8000 g离心10 min，收集上清液，得到唾液乳杆菌无细胞提取物。
（2）RAW264.7细胞的培养
用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养液(含10000U／mL青霉素和10000μg／mL链霉素)，在5％CO2、37℃恒温培养箱进行培养。每日观察细胞状态并及时换液。换液时先弃去旧液，用37℃的PBS缓冲液洗三次，再加入新鲜的完全培养液。
本实验使用脂多糖（LPS）处理RAW264.7细胞进行炎症模型的构建。细胞处理分组分别为，空白对照组、LPS组、乳杆菌组和LPS+乳杆菌组。空白对照组使用DMEM完全培养液进行培养；LPS组中加入含有1 μg/mL LPS的培养基进行培养；乳杆菌组中，先将10%（v/v）唾液乳杆菌无细胞提取物（步骤（1）中制备好的）处理2 h后，换DMEM完全培养液进行培养；LPS+乳杆菌组中，先加入10%（v/v）唾液乳杆菌无细胞提取物处理2 h，加入LPS终浓度为1μg/mL的培养液。细胞处理24 h后进行后续检测。
（3）RAw264.7细胞形态的光学显微镜观察
LPS成功诱导RAW264.7细胞产生炎症后，细胞形态会呈现出一定变化，而该申请菌株发挥抗炎效果后可使细胞恢复正常状态。因此以光学显微镜对RAW264.7细胞形态进行观察，有助于判断出申请菌株的抗炎作用。在细胞培养24h后，通过光学显微镜下对空白对照组、LPS组、乳杆菌组、LPS+乳杆菌组细胞进行观察，调整视野，放大400倍比较细胞形态差异。
如图3A、3C所示，显微镜下见巨噬细胞RAW 264.7细胞呈贴壁生长，形态相似并呈类圆形，增殖速度较快。 如图3B所示，1 μg/L LPS处理24 h后，细胞体积增大，多数细胞有伪足伸出，触角分明，细胞形态不规则。如图3D所示，猪源唾液乳杆菌无细胞提取物与LPS共处理后，梭形细胞明显减少，大部分细胞形态为圆形或椭圆形，恢复正常形态。由此可见，1μg/L LPS可成功诱导RAW264.7细胞产生炎症，细胞形态有明显分化，而该菌株提取物处理后可有效抑制细胞分化，缓解炎症反应，表明该菌株在体外具有一定的抗炎活性。
（4）猪源唾液乳杆菌对细胞NO分泌量的影响
在96孔板中加入 8×1 03个/孔对数期生长的RAW 264.7细胞，37℃，5% CO2条件下孵育过夜。按步骤（2）中的细胞处理方法分别对细胞进行处理，培养结束后，4 ℃、1 000 r/min 离心 5 min，收集上清液，参照一氧化氮(NO)试剂盒（上海碧云天生物技术限公司）说明书，在 96 孔板中加入 50μL上清液后，加入 50 μL Griess A，震荡 1min，加入 GriessB继续反应 1 0 min，于 540 nm 处测定吸光度值，用 NaNO2建立标准曲线，计算样品中亚硝酸钠浓度，从而推算各组细胞培养液中 NO 含量。
一氧化氮（NO）在炎症和免疫应答中起着关键调节作用，细胞分泌NO含量可反应炎症反应的进程。540nm处测定吸光值，带入NO标准曲线计算RAW264.7细胞的NO浓度，结果如表7、图5所示。与对照组相比，LPS刺激RAW264.7细胞后，巨噬细胞的NO分泌量极显著增加(P<0.01)。与LPS组相比，菌株提取物与LPS共作用后RAW264.7细胞的NO分泌量有所降低。因此，结果表明本申请猪源乳酸杆菌可降低炎症细胞NO分泌量，具有一定的抗炎活性。本申请猪源乳酸杆菌可以用于制备用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症药物。
表7 RAW264.7细胞分泌的NO浓度
实验例3：猪源唾液乳杆菌RS-23-1应用到动物中后的抗炎能力的检测
将猪源乳酸杆菌菌剂用于断奶仔猪的饲喂，整个饲养过程中，观察仔猪腹泻情况，分析其腹泻指数。饲喂结束后对仔猪结肠组织炎症相关基因（IL-10、IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB）的转录水平进行检测。
1、猪源唾液乳杆菌RS-23-1益生菌剂的制备方法，步骤如下：
将取上述筛选的乳酸杆菌RS-23-1涂布接种100μL在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养三代，将菌种继续接种至20 L自动发酵罐中（37℃，pH=5.0～5.5，24h）制备菌悬液，应用平板计数法计算所生产菌悬液的活菌数，调整菌悬液中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×1010CFU/g。其中MRS固体培养基的用量是10mm的培养板里铺3mm厚的MRS固体培养基培养基。
2、动物实验处理
选用18头健康、平均体重为6.9-7.1 kg的28日龄断奶仔猪。根据体重相近公、母比例一致的原则，随机将试验仔猪分成3个组，每组设1个圈，每圈6头，公母各半。对照组饲喂基础饲粮，阳性对照组（某厂家乳酸菌组）在基础饲粮中添加的某厂家乳酸菌（沧州市益宏生物科技有限公司，畜禽用乳酸菌）调整至饲料中活菌数为1×107CFU/g，试验组（RS-23-1组）在基础饲粮中添加乳酸杆菌调整至饲料中活菌数为1×107CFU/g，预饲期3天，正式试验期28天。供试猪均按照猪场常规饲养管理，试验期间免疫、驱虫和消毒程序均按猪场正常程序进行。试验饲喂结束，每组前腔静脉采血5 mL，置于血清管中促凝，3000r/min离心10min，分离血清后-20℃保存待测。断奶仔猪基础饲粮配方组成见表8。
表8 断奶仔猪基础饲粮配方组成
预混料为每千克饲粮提供：VA 4800 IU，VD3880 IU， VE 30 IU, VK32.4 mg，VB12.0 mg，VB28 mg,VB61.2 mg，VB20.03 mg，叶酸 2.0 mg，生物素 0.2 mg，烟酸 40mg，泛酸25 mg，Cu 14.4 mg，Fe 120mg, Zn 125 mg，Mn 50 mg，Co 0.4 mg，Se 0. 3mg，I 0.3 mg。
3、腹泻指数的观察
仔猪腹泻指数计算方法为在试验期间（1-60d）密切监测粪便健康外观和腹泻评分。腹泻的严重程度按以下标准进行评分：1分，硬而成形的颗粒；2分，未成形的颗粒；3分，粪便软；4分，非常软，含有少量水样粪便；5分，半固体，含有一半以上的水样粪便；6分，水样粪便。5分或6分被认为是严重腹泻。选择试验，14，28d的记录结果运用spss软件进行统计学分析
4、结肠组织炎症相关基因转录水平检测
采用Trizol法提取仔猪结肠总RNA，按反转录试剂盒方法将RNA反转录合成cDNA作为PCR扩增模板，设计炎症相关基因的对应引物进行PCR 扩增，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，炎症相关基因引物序列如表9所示。PCR扩增条件：95℃ 10 min；94℃ 15s，60℃60 s，40个循环；95℃ 15ｓ。以 GAPDH为内参，２-ΔΔt法计算结肠中IL-10、IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB mRNA的转录水平。
表9 炎症相关基因引物序列
5、实验结果
5．1猪源唾液乳杆菌RS-23-1对仔猪腹泻指数的影响
表10为各组仔猪腹泻指数。由表10可见，试验1d时组间没有差别，各组仔猪状况基本相同。在其他各统计日期，RS-23-1组、某厂家乳酸菌组的腹泻指数均出现明显改善，整体均出现下降，而本申请RS-23-1组和某厂家乳酸菌组的腹泻指数差距不大。结果表明添加本申请菌株可明显减少仔猪腹泻，能达到商用益生乳酸菌的效果。
表10 仔猪腹泻指数
5.2猪源唾液乳杆菌RS-23-1对仔猪结肠组织炎症相关基因转录水平的影响
炎症相关基因的转录水平结果如表11所示，RS-23-1组、某厂家乳酸菌组中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB转录水平均显著低于对照组（p＜0.05），而抗炎因子IL-10的转录水平则均显著高于对照组（p＜0.05）。结果表明本申请RS-23-1可增强仔猪肠道的抗炎能力，且达到了商用益生乳酸菌的效果。
表11 RS-23-1对仔猪免疫能力能力的影响
注：同一列不同字母代表差异显著(p<0．05)。
根据上述实验结果可知，本发明唾液乳杆菌（lactobacillus salivarius）RS-23-1可提高动物的免疫力、增强仔猪肠道的抗炎能力，从而减少诱发仔猪肠道炎症的发生。可以用于制备用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一株唾液乳杆菌，其特征在于：所述唾液乳杆菌命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius ）RS-23-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.26619，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年2月21日。
2.根据权利要求1所述的唾液乳杆菌RS-23-1，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述唾液乳杆菌RS-23-1在制备益生菌剂上的应用。
4.一种益生菌剂，其特征在于：含有权利要求1或2所述的唾液乳杆菌RS-23-1。
5.根据权利要求4所述的一种益生菌剂，其特征在于所述益生菌剂中所述唾液乳杆菌RS-23-1的活菌数为1×1010 CFU/g。
6.根据权利要求4或5所述的一种益生菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将唾液乳杆菌RS-23-1涂布接种在MRS固体培养基中，37℃有氧培养24h，继续传代培养，将菌种继续发酵制备菌悬液，调整菌悬液中乳杆菌RS-23-1活菌数为1×1010 CFU/g。
7.根据权利要求6所述的一种益生菌剂的制备方法，其特征在于继续传代培养三代。
8.根据权利要求6所述的一种益生菌剂的制备方法，其特征在于：菌种继续发酵的条件是：温度为37℃，pH=5.0～5.5，时间为24h。
9.权利要求1-2任一项所述的唾液乳杆菌RS-23-1或权利要求4-5任一项所述的益生菌剂或按照权利要求6-8任一项所述的方法制备的益生菌剂在制备用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症产品中的应用。
10.一种用于预防和/或治疗仔猪肠道炎症的药物，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的唾液乳杆菌RS-23-1或权利要求4-5任一项所述的益生菌剂或按照权利要求6-8任一项所述的方法制备的益生菌剂或唾液乳杆菌RS-23-1无细胞提取物。
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