CN117223790B - 一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法 - Google Patents

一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法，涉及发酵饲料技术领域。本发明的生物发酵饲料由发酵基料和发酵菌液发酵制备得到；所述发酵基料包括棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶；所述发酵菌液由植物乳杆菌或凝结魏茨曼氏菌中的至少一种菌种发酵得到；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌GLM101；所述凝结魏茨曼氏菌为凝结魏茨曼氏菌GLM336。本发明采用植物乳杆菌和凝结魏茨曼氏菌发酵制备得到的生物发酵饲料，通过对发酵菌株的选择，提高生物发酵饲料的蛋白、总酸和活菌含量，降低发酵原料中的抗营养因子，能够提高断奶仔猪的免疫力，改善仔猪的健康状况；本发明的生物发酵饲料可耐受高温的影响，具有较长的保质期。

Description

一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵饲料技术领域，具体涉及一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法。
背景技术
随着现代集约化和规模化养殖业的发展，畜禽及水产动物感染各种疾病的危险性增加。为了预防动物疾病，大量抗生素等药物被用作饲料添加剂。伴随着长期、大量的使用抗生素类添加剂，其负面效应也日益明显地暴露出来。主要是长期使用抗生素所引起的耐药菌株问题、内源性感染问题等始终困扰着养殖者，抗感染形势的严峻性对人们寻找与现有抗生素抗菌机理完全不同的新型抗生素提出了前所未有的紧迫要求。益生菌及益生菌发酵原料可动物改善胃肠道菌群落结构，提高动物生产性能，补充营养，改善消化功能，提高机体免疫力及抗病力。
目前用于发酵饲料生产的微生物主要包括：芽孢杆菌、酵母菌、曲霉类真菌以及乳酸菌。乳酸菌是在发酵饲料中一方面能产生抗菌素抑制和杀灭有害菌使其不能生长繁殖，减少或杀灭有害物质使内毒素含量降低从而增强使原宿主抗异能力增强在竞争中占优势，另一方面可以提高饲料的营养价值，将糖类分解改善物料风味和适口性。然而，现有的乳酸菌中兼具产酸能力和抑菌特性的菌株较少，加上饲料发酵通常为混菌体系，外源引入的乳酸菌易打破发酵饲料中的混合微生物平衡，使发酵饲料的营养价值提高程度有限、保质期不长。
凝结魏茨曼氏菌由于其兼具乳酸菌和芽孢杆菌的特点，近年来逐渐开始受到人们的重视，已经成为国内外研究的一个重点，菌剂产品中的凝结魏茨曼氏菌需要处在芽孢状态才能有高抗逆性，因此如何获得高浓度高活性的芽孢是制约凝结魏茨曼氏菌制剂生产的关键因素。凝结魏茨曼氏菌发酵过程中会产生大量乳酸降低环境pH值，pH值降低到一定程度时会抑制其自身生长；且其芽孢的形成条件也极为苛刻，受营养条件和环境因素如温度、pH和溶氧水平等多方面因素影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料由发酵基料和发酵菌液发酵制备得到；所述发酵基料包括棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶；所述发酵菌液由植物乳杆菌或凝结魏茨曼氏菌中的至少一种菌种发酵得到；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌GLM101；所述凝结魏茨曼氏菌为凝结魏茨曼氏菌GLM336。本发明采用植物乳杆菌或凝结魏茨曼氏菌发酵制备生物发酵饲料，制备得到的生物发酵饲料营养成分高，能够降低发酵原料中的抗营养因子，增强仔猪的免疫力。所述凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)GLM336，已于2023年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.63548。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GLM101，已于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.11156。
作为本发明所述生物发酵饲料的优选实施方式，所述复合酶包括甘露聚糖酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶。
作为本发明所述生物发酵饲料的优选实施方式，所述棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶的质量比为棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝(38-42)：(38-42)：(16-20)：(0.5-2)：(0.5-2)。
作为本发明所述生物发酵饲料的优选实施方式，按发酵基料的质量计，所述发酵菌液的添加量为1％～10％。
本发明还提供所述的生物发酵饲料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将发酵菌接种于MRS液体培养基中，得发酵菌液；
(2)按重量比称取棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶，混合均匀得发酵基料；
(3)将发酵菌液接种于发酵基料，发酵得所述生物发酵饲料。
作为本发明所述生物发酵饲料的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)的发酵具体为在温度35-40℃下厌氧发酵72h。
本发明还提供所述的生物发酵饲料作为添加剂在饲料中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述生物发酵饲料应用于断奶仔猪的饲料中。
本发明的有益效果：一种生物发酵饲料及其液固双相发酵方法。本发明采用植物乳杆菌和凝结魏茨曼氏菌发酵制备得到的生物发酵饲料，通过对发酵菌株的选择，提高生物发酵饲料的蛋白、总酸和活菌含量，降低发酵原料中的抗营养因子，能够提高断奶仔猪的免疫力，改善仔猪的健康状况；本发明的生物发酵饲料可耐受高温的影响，具有较长的保质期。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明实施例中：
凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)GLM336，已于2023年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.63548；
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GLM101，已于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.11156。
实施例1
本实施例提供一种凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)GLM336的分离、筛选、鉴定，具体如下：
1、菌株的分离、筛选、鉴定及保存
(1)菌株的分离：取健康仔猪粪便样品，用无菌水分别进行10、100、1000倍稀释，取200μL涂布于改良MRS固体培养基(改良MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6)，于45℃培养48小时，挑取菌落，划线改良MRS培养基，经4次纯化后，挑取单菌落至改良MRS肉汤中培养至对数期，加入终浓度20％甘油，-80℃下保存备用。
(2)菌株形态学特征及生理生化特征：取上述纯化菌株的单菌落，转接到改良MRS固体培养基(琼脂)上，于45℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，该菌株在改良MRS固体培养基上菌落形态为不透明白色，呈圆形，表面突出。根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对分离菌株进行生理生化初步鉴定，生理生化结果如表1所示。
表1生化鉴定结果
项目 结果 项目 结果
革兰氏染色 + V-P测定 +
55℃生长 + 接触酶 +
厌氧生长 + 吲哚试验 -
D-葡萄糖 + 明胶液化 -
甲基红 + 酪氨酸水解 +
淀粉水解 + 7％氯化钠生长 -
(3)菌株的分子生物学鉴定
利用细菌基因组提取试剂盒提取上述菌株的基因组DNA。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株16S rDNA片段。如上所述的引物对序列为：1492R：TACCTTGTTACGACTT，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。菌株的16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO:1所示。综合该菌株有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，结果为凝结芽孢杆菌，将上述菌株进行保藏。发明人已于2023年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，并命名为凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)GLM336，获得的保藏号为GDMCC NO:63548。
2、耐酸性试验
(1)实验选取前期从健康仔猪肠道、土壤、市售同类产品等来源分离纯化到乳酸菌菌株作为对照，经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16S rDNA测序等鉴定，这些乳酸菌菌株同属于分别属于凝结魏茨曼氏菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌株。16S rDNA测序比对分析结果见下表2。
表2相关分离所得乳酸菌菌株的鉴定结果
(2)具体实验方法：用HCl调节液体培养基至pH 2.0。将菌种以的5％(V/V)的接种量分别接种上述各处理，45℃静置培养。在接种初始及接种后120min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表3。
表3GLM336与其它分离菌株耐酸实验对比结果
由表3可知，所分离的菌株在pH 2.0条件下时的存活率分别为21.2％～87.6％，其中菌株GLM336的存活率最高，达到87.6％。
(3)进一步对菌株GLM336进行耐酸性检测，实验方法为：设4个不同pH值处理，分别用HCl调节液体培养基至pH值为1.5、2.5、3.5、4.5。将菌种以的5％(V/V)的接种量分别接种上述各处理，45℃静置培养。在接种初始及接种后30、60、90、120、150min取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH 6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH6.0的菌液活菌数×100％。实验结果见表4。
表4菌株GLM336耐酸实验结果
pH 活菌数(CFU/g) 存活率(120min)
1.5 0.3 5.6％
2.5 9.5 90.3％
3.5 12.5 92.0％
4.5 13.5 98.2％
6.0 14.2 ----
由表4可知，所分离的菌株在pH 1.5、2.5、3.5、4.5时的存活率分别为5.6％、90.3％、92.0％、98.2％，说明该菌具有较强的耐酸性，最低可以耐受pH范围为1.5～2.5。
3、抑菌试验
具体实验方法：实验菌株选取实验室前期分离自仔猪肠道、土壤、市售同类产品等来源的凝结魏茨曼氏菌，指示菌株选取大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC(B)50071、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)ATCC 27562和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9027、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)GLM006和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)GLM008。采用牛津杯法，每杯加入0.2mL培养24h的培养液，恒温培养箱中培养，观察培养结果，测定平皿内抑菌圈直径大小，实验结果如表5所示。
表5菌株GLM336抑菌实验对比结果直径(mm)
注：实验重复3次，结果为三次平均值。
由实验结果可知，所分离的菌株对常见致病指示菌有良好的抑制作用，其中菌株GLM336对指示菌的抑菌能力高于其它来源的凝结魏茨曼氏菌。
4、胆盐耐受试验
具体实验方法：实验菌株选取实验室前期分离自仔猪肠道、土壤、市售同类产品等来源的乳酸菌菌株(表1)，菌株培养16h后，在4℃12000g离心4分钟后收集菌体，用PBS溶液冲洗2次。加入含有胆盐0.7％(w/v)的PBS溶液中，45℃培养4h后，稀释至10-4和10-5浓度涂布改良MRS平板(改良MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6)，45℃厌氧培养48h后，观察改良MRS平板上菌落生长情况。
结果如表6所示，在所有的实验平板中，菌株GLM336的存活量最高，达到4.5*108CFU/ml。
表6各菌株经胆盐0.7％(w/v)处理4h后的存活菌量
注：----表示存活乳酸菌菌落数≦1.0*106CFU/ml。
5、高温耐受试验
具体实验方法：实验菌株选取实验室前期分离自仔猪肠道、土壤、市售同类产品等来源的凝结魏茨曼氏菌发酵液为试验对象，测定85-100℃水浴条件下、10-30min加热后凝结芽孢杆菌的存活情况。各实验菌株发酵液初始芽孢数调整为1.6×1010CFU/mL。采用平板涂布法梯度稀释测定芽孢数，并计算存活率，结果见表7。所用培养基为改良MRS平板，45℃厌氧培养48h后，观察改良MRS平板上菌落生长情况。改良MRS培养基主要成分是蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。
表7不同加热温度对各菌株芽孢存活率的影响
由表7可知，85℃下水浴处理10-20min，菌株GLM336存活率100％；85℃下水浴处理30min，菌株GLM336存活率99.6％；100℃处理30min，菌株GLM336存活率89.2％。说明菌株GLM336的耐热性好。
实施例2
本实施例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌GLM101接种于MRS液体培养基中，25-37℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量5％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量5％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于25-37℃静置培养18-24h，得植物乳杆菌发酵液；
(2)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(3)按发酵基料的质量计，将2％的植物乳杆菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
实施例3
本实施例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将凝结魏茨曼氏菌GLM336接种于改良MRS液体培养基中，35-40℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量3％-10％(v/v)再次转接入新的改良MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量3％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于35-40℃静置培养18-24h，得凝结魏茨曼氏菌发酵液；改良MRS培养基主包括蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6；
(2)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(3)按发酵基料的质量计，将2％的凝结魏茨曼氏菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
实施例4
本实施例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌GLM101接种于MRS液体培养基中，25-37℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量5％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量5％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于25-37℃静置培养18-24h，得植物乳杆菌发酵液；
(2)将凝结魏茨曼氏菌GLM336接种于改良MRS液体培养基中，35-40℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量3％-10％(v/v)再次转接入新的改良MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量3％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于35-40℃静置培养18-24h，得凝结魏茨曼氏菌发酵液；改良MRS培养基包括蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6；
(3)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(4)按发酵基料的质量计，将1％的植物乳杆菌发酵液和1％的凝结魏茨曼氏菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
对比例1
本对比例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌(市售)接种于MRS液体培养基中，25-37℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量5％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量5％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于25-37℃静置培养18-24h，得植物乳杆菌发酵液；
(2)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(3)按发酵基料的质量计，将2％的植物乳杆菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
对比例2
本对比例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将凝结魏茨曼氏菌(市售)在改良MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于改良MRS液体试管，45℃培养24h后，以2％接种量转接于MRS液体培养基，培养24后得凝结魏茨曼氏菌发酵液；改良MRS培养基包括蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6；
(2)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(3)按发酵基料的质量计，将2％的凝结魏茨曼氏菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
对比例3
本对比例的一种生物发酵饲料，所述生物发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌(市售)接种于MRS液体培养基中，25-37℃静置培养18-24h，得到一级种子液；将一级种子液按接种量5％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，静置18-24h后获得二级种子液；将二级种子液按照接种量5％-10％(v/v)单独接入到发酵罐培养基中，于25-37℃静置培养18-24h，得植物乳杆菌发酵液；改良MRS培养基包括蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6；
(2)将凝结魏茨曼氏菌(市售)在改良MRS琼脂平板活化，挑取单菌落接种于改良MRS液体试管，45℃培养24h后，以2％接种量转接于MRS液体培养基，培养24后得凝结魏茨曼氏菌发酵液；
(3)将棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵、复合酶按照重量份数比：棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶＝40:40:18:1:1，混合均匀得到发酵基料；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶；
(4)按发酵基料的质量计，将1％的植物乳杆菌发酵液和1％的凝结魏茨曼氏菌发酵液接种于发酵基料，于35-40℃条件下厌氧发酵72h，得所述生物发酵饲料。
效果例
1、对实施例2～4、对比例1～3制备得到的生物发酵饲料的蛋白、酸溶蛋白、总酸、活菌含量和经85℃处理30min后的活菌含量进行检测，结果如表8所示。
表8生物发酵饲料发酵后的营养指标
2、生物发酵饲料对仔猪健康状况的改善作用
具体试验方法：
(1)实验动物与分组：选取同批30日龄的断奶仔猪700头，随机分为7组，每组100头(组内大小、体重接近，均匀度良好)，分组及称重情况如表9所示。
表9试验仔猪群分组与称重情况
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(2)仔猪从试验开始当天，空白对照组使用商品全价饲料，试验各组分别添加5％比例的不同发酵饲料，连用30天，试验过程中每日检测仔猪的生长性能，结果如表10所示。
表10生物发酵饲料对仔猪生长指标影响试验结果
(3)第30天喂养结束后，每个组别随机选取5头仔猪，前腔静脉采血10ml置于未加抗凝剂的试管中，放置30min后，4000r/min离心10min，分离血清，分装成5份，测定血清免疫指标、血清免疫因子。血清免疫指标包括：血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白白M(IgM)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及总抗氧化能力(T-AOC)，均使用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照说明书检测方法测定，结果如表11所示。血清免疫因子包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-8(IL-8)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书检测，结果如表12所示。
表11不同生物发酵饲料对断奶仔猪血清免疫指标的影响
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表12不同生物发酵饲料对断奶仔猪血清细胞因子的影响
项目 对照组 实施例2 实施例3 实施例4
IL-2(pg/ml) 166.38±22.65 192.36±24.39 185.45±15.63 198.53±18.52
IL-4(pg/ml) 76.63±12.51 79.16±14.23 80.82±14.52 82.53±18.22
IL-8(pg/ml) 45.38±6.35 50.69±10.28 54.35±14.33 57.82±16.27
TNF-α(pg/ml) 142.35±8.26 175.62±9.62 165.28±12.22 189.63±9.64
由表11可知，实施例2～4的仔猪的IgA、IgG、IgM均显著高于对照组，且同时添加凝结魏茨曼氏菌GLM336与植物乳杆菌GLM101进行发酵得到的生物发酵饲料的实施例4的IgA、IgG、IgM高于仅添加凝结魏茨曼氏菌GLM336或植物乳杆菌GLM101中的一种的实施例3或4；在仔猪生长阶段，血清IgG、IgM和IgA的含量提高，在一定程度上反映仔猪免疫力增强，由此说明采用凝结魏茨曼氏菌GLM336与植物乳杆菌GLM101进行发酵得到的生物发酵饲料能够提升断奶仔猪免疫性能。其次，仔猪在早期断奶过程中，体内原有的氧化平衡被打破，机体抗氧化能力下降，从而产生氧化应激。由表11可知，实施例2～4的仔猪的SOD活性、GSH-Px活性、总抗氧化能力均显著高于对照组，而MDA含量显著降低，说明本发明的生物发酵饲料能够提高仔猪的抗氧化能力。在仔猪断奶应激条件下，细胞因子含量的提高可起到有效的抗炎作用，由表12可知，实施例2～4的仔猪的TNF-α、IL-2、IL-4、IL-8高于对照组，说明本发明的生物发酵饲料具有抗炎作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种生物发酵饲料，其特征在于，所述生物发酵饲料由发酵基料和发酵菌液发酵制备得到；所述发酵基料包括棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶；所述发酵菌液由植物乳杆菌和凝结魏茨曼氏菌发酵得到；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌GLM101；所述凝结魏茨曼氏菌为凝结魏茨曼氏菌GLM336；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌GLM101的保藏编号为CGMCCNo. 11156；所述凝结魏茨曼氏菌GLM336的保藏编号为GDMCC No.63548；所述棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶的质量比为棕榈粕：豆粕：玉米粉：硫酸铵：复合酶=（38-42）：（38-42）：（16-20）：（0.5-2）：（0.5-2）；按发酵基料的质量计，所述发酵菌液的添加量为1%~10%；所述复合酶包括100000U/g甘露聚糖酶、20000U/g中性蛋白酶、20000U/g酸性蛋白酶、8000U/g纤维素酶、40000U/g木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将发酵菌接种于MRS液体培养基中，得发酵菌液；
（2）按重量比称取棕榈粕、豆粕、玉米粉、硫酸铵和复合酶，混合均匀得发酵基料；
（3）将发酵菌液接种于发酵基料，发酵得所述生物发酵饲料。
3.根据权利要求2所述的生物发酵饲料的制备方法，所述步骤（3）的发酵具体为在温度35-40℃下厌氧发酵72h。
4.权利要求1所述的生物发酵饲料作为添加剂在饲料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述生物发酵饲料应用于断奶仔猪的饲料中。
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