CN113430140B - 一株植物乳杆菌NHE-LpB6401及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NHE‑LpB6401，该菌分离自樱桃谷肉鸭肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22645，保藏日期为2021年5月31日。该菌株具有繁殖速度快、耐人工胃肠液、发酵性能强、抑菌性能强、产酸性和发酵性能强。能提高动物健康状态，改善生长性能，降低生产成本，提高经济效益，具有良好的应用前景。

Description

一株植物乳杆菌NHE-LpB6401及应用
技术领域
本发明涉及畜牧饲用益生菌，，特别涉及一株益生植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NHE-LpB6401及应用。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，是乳酸菌的一种，最适生长温度为30～35,厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。其生物特性如下：圆端直杆菌，通常为0.9～1.2vtm×3.0～8.0μm，单个、成对或短链状。通常缺乏鞭毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢。兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。属化能异养菌，生长需要营养丰富的培养基，需要泛酸钙和烟酸，但不需要硫胺素、吡哆醛或吡哆胺、叶酸、维生素B12。能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85％以上是乳酸。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。能产生DL一乳酸，有1，6～二磷酸果糖醛缩酶和单磷酸己糖途径的活性，能在葡萄酸盐中生长，并产C02。发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。15℃能生长，通常最适生长温度为30～35℃。
目前已报道的植物乳杆菌的工业应用常见于食品发酵，例如，发酵乳生产，同时也可应用于重金属降解，由于其繁殖过程中产生的乳酸杆菌素可做为天然防腐剂，该类菌也可用于生产养殖领域。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有益生作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NHE-LpB6401及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NHE-LpB6401是从健康樱桃谷肉鸭肠道内容物中分离的植物乳杆菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为植物乳杆菌，其16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。该菌株具有繁殖速度快、耐人工胃肠液、发酵性能强、抑菌性能强、产酸性和发酵性能强。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NHE-LpB6401，已于2021年5月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为CGMCC No.22645。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NHE-LpB6401具有以下微生物学特征：植物乳杆菌NHE-LpB6401是革兰氏阳性杆菌，在MRS琼脂培养基上生长良好，培养18h，菌落直径3-4mm，圆形，乳白色，表面光滑，中间凸起，边缘整齐，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈段直杆状，兼性厌氧生长，经革兰氏染色后菌株形态如图2；植物乳杆菌NHE-LpB6401生长适宜温度范围：10℃-60℃，最适生长温度：25℃-38℃；生长适宜pH3.5-8，最适pH值为5-7。部分生理生化特性如表1。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401的液体菌剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401制备的微生态制剂及动物饲料。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401的动物饮水用饲料添加剂。
饲料添加剂中植物乳杆菌NHE-LpB6401的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中植物乳杆菌NHE-LpB6401的活菌数为1×106CFU/g。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401或含有其的菌剂在制备抗菌微生物制剂中的应用。
所述主要包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌。
另外，本发明进一步提供了上述植物乳杆菌NHE-LpB6401在樱桃谷肉鸭生产中的应用。
本发明中所述植物乳杆菌NHE-LpB6401的培养方法如下：
取植物乳杆菌NHE-LpB6401(保藏编号为CGMCC No.22645)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)3mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行发酵罐发酵培养，取300mL摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，50L发酵罐装液量为35L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为3.4×1010CFU/mL。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖0.5-4％，葡萄糖0.5-2.5％，酵母浸粉0.5-3.0％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，氯化镁0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，余量为水。
优选为：蔗糖1.2％，葡萄糖0.8％，酵母浸粉0.5％，大豆蛋白胨1.2％，氯化镁0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.04％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量1％(体积比)，发酵温度为35℃、pH5.8、200r/min，发酵时间6h。
所述50L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：绵白糖1.0-4.0％，葡萄糖0.2-2.0％，酵母膏0.5-3.5％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，玉米将干粉0.5-2.5％，氯化镁0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1.0％，葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，大豆蛋白胨0.8％，玉米将干粉1％，氯化镁0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.1％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：50L发酵罐装液量为35L培养基，控制罐压0.05-0.06MPa，接种量为300mL，发酵温度为35℃，发酵时间11h，pH值5.8，搅拌转速200r/min。
本发明中所述植物乳杆菌NHE-LpB6401繁殖代时检测方法如下：
将植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液按1％(v/v)的接种量接至无菌的MRS肉汤培养基中，装液量300mL/1000mL，37℃180r/min振荡培养，每个半小时测定MRS肉汤培养基中乳酸菌活菌数，绘制生长曲线，得出乳酸菌对数生长期的活菌数变化，然后按照公式计算繁殖代时，植物乳杆菌NHE-LpB6401繁殖代时为18min/代。
所述世代时间按照如下公式计算：其中X1为对数期开始时(T1)菌数；X2为对数期后期(T2)菌数；G为世代时间，即为繁殖代时。
本发明中所述植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂制备方法如下：
将植物乳杆菌NHE-LpB6401(保藏编号为CGMCC No.22645)发酵液于13000r/min离心10min得植物乳杆菌NHE-LpB6401活性菌泥，然后将植物乳杆菌活性菌泥和水按1:2的重量比例混合均匀，获得高浓度菌体悬液。将植物乳杆菌NHE-LpB6401菌体悬液和保护剂按1:2.2的重量比例混合均匀，制成微囊湿粉，通过制粒机制备成湿颗粒，然后与包被剂溶液混合均匀，投入流化干燥床，进行干燥包衣，获得NHE-LpB6401微生态制剂的制备，有效活菌数达5.0×1010CFU/g。
所述保护剂为：玉米淀粉10-70％，羧甲基纤维素钠1-5％，葡聚糖1-8％，菊糖0.5-8％，脱脂奶粉5-20％，糊化变性淀粉5-20％，蔗糖0.5-5％，蛋白胨0.5-5％，海藻糖0.1-2.5％，甘油1-10％，微晶纤维素1-10％，余量为水。
优选为：玉米淀粉40％，羧甲基纤维素钠2％，葡聚糖2％、菊糖2.4％，脱脂奶粉15％，糊化变性淀粉10％、蔗糖5％，蛋白胨2％，海藻糖2％，甘油5％，微晶纤维素5％，余量为水。
所述包被剂溶液为：海藻酸钠2-20％，羟甲基纤维素10-25％，壳聚糖10-30％，甘露聚糖1-10％，余量为水。
优选为：海藻酸钠10％，羟甲基纤维素6.5％，壳聚糖8.5％，甘露聚糖4％，余量为水。
本发明植物乳杆菌NHE-LpB6401的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
本发明植物乳杆菌NHE-LpB6401的抗逆性检验方法如下：
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
2、耐人工肠液性能测定
取1mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
本发明植物乳杆菌NHE-LpB6401预防和治疗腹泻的检验方法：
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加植物乳杆菌发酵液，添加浓度为1×106CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加植物乳杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×106CFU/mL浓度的植物乳杆菌NHE-LpB6401发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的植物乳杆菌NHE-LpB6401繁殖速度快、产酸能力强、抑菌性能强、抗逆性强；经发酵培养基和工艺优化，35℃发酵11h，发酵液活菌数可达到3.4×1010CFU/mL，更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展，可生产微生态制剂，并在动物生产中应用，由于繁殖速度快，可大大降低生产成本、提高经济效益，为以后发展奠定了坚实的菌种基础。
(2)本发明的植物乳杆菌NHE-LpB6401可制备动物微生态制剂，并且发酵成本大大降低，能有效的降低其使用成本，为大范围使用奠定基础。
(3)本发明中的植物乳杆菌NHE-LpB6401可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠攻毒试验，试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组(P<0.05)；沙门氏菌攻毒后，试验组小鼠精神状态和存活率明显高于负对照组。表明饲喂植物乳杆菌NHE-LpB6401菌液可有效预防和治疗小鼠腹泻，提高小鼠受病原菌攻毒的存活率，并能够促进小鼠生长。
(4)本发明植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂应用于樱桃谷肉鸭生产，在日粮中添加后，明显改善生长性能，可显著降低(P<0.05)料肉比，提高日增重和采食量，改善死淘率，降低生产成本，而提高养殖效益。
附图说明
图1是植物乳杆菌NHE-LpB6401在MRS培养基上的菌落形态图。
图2是植物乳杆菌NHE-LpB6401菌株的革兰氏染色图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1植物乳杆菌NHE-LpB6401的分离、筛选及鉴定
1、乳酸菌的分离纯化：
将健康樱桃谷肉鸭屠宰取肠道后迅速在无菌条件下采集肠道内容物2.5克，置于盛有22.5mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于改良的MRS琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养48h，用接种环挑取溶钙圈明显且大于5mm的疑似乳酸菌的菌落在MRS琼脂平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于MRS琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于-80℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察：
根据步骤1中溶钙圈大小，初步筛选出产酸能力强的菌株可初步确定为乳酸菌，共256株。将步骤1保存的甘油管菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的不产芽胞细菌作为备用。
3、乳酸菌菌悬液和发酵液制备
将步骤1获得的乳酸菌在MRS琼脂平板上划线37℃培养48h，从平板上挑取单菌落于100mL MRS液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养24h，获得乳酸菌菌悬液备用；继续37℃，180r/min震荡培养96h，获得乳酸菌发酵液备用。
4、乳酸菌产酸能力的筛选：
将步骤3种获得的乳酸菌菌悬液按1％(体积比)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h，筛选出12h将发酵液pH将至4.2以下的乳酸菌，共获得56株乳酸菌。
5、抑菌性乳酸菌的筛选：
取致病菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的营养琼脂培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个(致病菌产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)。在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似乳酸菌菌株发酵液(步骤3获得)于牛津杯中，于37℃下恒温培养24h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有9株，并分别标号为B802、B3601、B4401、B5202、B6401、B6802、B7201、B7202、B8003。
6、乳酸菌繁殖性能的筛选：
将步骤3制备的乳酸菌菌悬液按1％(v/v)的接种量接至无菌的MRS肉汤培养基中，装液量300mL/1000mL，37℃180r/min振荡培养，每个半小时测定MRS肉汤培养基中乳酸菌活菌数，绘制生长曲线，得出乳酸菌对数生长期的活菌数变化，然后按照公式计算繁殖代时，获得繁殖性能强的乳酸菌4株，分别为B3601、B6401、B7202、B8003，其繁殖代时小于25分钟。
所述世代时间按照如下公式计算：其中X1为对数期开始时(T1)菌数；X2为对数期后期(T2)菌数；G为世代时间，即为繁殖代时。
7、乳酸菌耐温性能筛选：
将步骤3种获得的乳酸菌菌悬液10mL于无菌试管中，然后放入55、65、75℃水浴锅中处理30min，然后测定处理后乳酸菌活菌数，根据处理前的活菌数计算存活率。获得耐温性能最佳的乳酸菌B6401，在75℃水浴锅中处理30min，存活率达到92.23％，将其作为下一步研究的菌种。
8、菌株属的鉴定：
对菌株B6401进行了形态和生理生化鉴定，B6401在MRS琼脂平板上生长24h后，形成直径2-3mm圆形菌落，呈乳白色，表面光滑，不透明，隆起，边缘整齐，易挑起，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈杆状，无芽孢，不运动，兼性厌氧，生长适宜温度范围为4℃-65℃，最佳生长温度为15℃-45℃，生长pH为3.5-8.5，最适pH为4.5-7.5。通过对菌株B6401进行生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株的种属。结果显示菌株B6401为乳杆菌属。
表1菌株B6401的部分生理生化特征
项目 B6401 项目 B6401
有氧生长 + 甘露醇 +
厌氧生长 + 甘露糖 +
接触酶 - 山梨糖 +
精氨酸产氨 - 蔗糖 +
水舒糖 - 乳糖 +
半乳糖 + 麦芽糖 +
蜜二糖 + 纤维二糖 +
葡萄糖 + 海藻糖 +
果糖 + 阿拉伯糖 +
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
9、16S rDNA测序测定：
采用细菌DNA提取的试剂盒提取B6401菌株基因组DNA。通过引物F和R对B6401菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株B6401与植物乳杆菌的同源性达到100％。通过菌株B6401的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株B6401为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并正式标号为NHE-LpB6401。
10、菌株保藏：
上述经分离、纯化、筛选得到的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NHE-LpB6401已于2021年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22645，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
所述改良MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO4 0.025％，琼脂1.8％，碳酸钙1％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，琼脂1.8％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS肉汤培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基组成为：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
实施例2植物乳杆菌NHE-LpB6401发酵液的制备
取植物乳杆菌NHE-LpB6401(保藏编号为CGMCC No.22645)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)3mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行发酵罐发酵培养，取300mL摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，50L发酵罐装液量为35L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为3.4×1010CFU/mL。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖0.5-4％，葡萄糖0.5-2.5％，酵母浸粉0.5-3.0％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，氯化镁0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，余量为水。
优选为：蔗糖1.2％，葡萄糖0.8％，酵母浸粉0.5％，大豆蛋白胨1.2％，氯化镁0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.04％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量1％(体积比)，发酵温度为35℃、pH5.8、200r/min，发酵时间6h。
所述50L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：绵白糖1.0-4.0％，葡萄糖0.2-2.0％，酵母膏0.5-3.5％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，玉米将干粉0.5-2.5％，氯化镁0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1.0％，葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，大豆蛋白胨0.8％，玉米将干粉1％，氯化镁0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.1％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：50L发酵罐装液量为35L培养基，控制罐压0.05-0.06MPa，接种量为300mL，发酵温度为35℃，发酵时间11h，pH值5.8，搅拌转速200r/min。
实施例3植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂的制备
将植物乳杆菌NHE-LpB6401(保藏编号为CGMCC No.22645)按实施例2方法制备NHE-LpB6401发酵液，将该发酵液于13000r/min离心10min得植物乳杆菌NHE-LpB6401活性菌泥，然后将植物乳杆菌活性菌泥和水按1:2的重量比例混合均匀，获得高浓度菌体悬液。将植物乳杆菌NHE-LpB6401菌体悬液和保护剂按1:2.2的重量比例混合均匀，制成微囊湿粉，通过制粒机制备成湿颗粒，然后与包被剂溶液混合均匀，投入流化干燥床，进行干燥包衣，获得NHE-LpB6401微生态制剂的制备，有效活菌数达5.0×1010CFU/g。
所述保护剂为：玉米淀粉40％，羧甲基纤维素钠2％，葡聚糖2％、菊糖2.4％，脱脂奶粉15％，糊化变性淀粉10％、蔗糖5％，蛋白胨2％，海藻糖2％，甘油5％，微晶纤维素5％，余量为水。
所述包被剂溶液为：海藻酸钠10％，羟甲基纤维素6.5％，壳聚糖8.5％，甘露聚糖4％，余量为水。
实施例4植物乳杆菌NHE-LpB6401益生性验证
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
表2植物乳杆菌NHE-LpB6401对病原菌的抑菌效果
病原菌 抑菌直径(mm)
肠道致病大肠杆菌Escherichia coli 18.22
金黄色葡萄球菌StBphylococcus Bureus 31.23
伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 21.15
沙门氏菌Salmonella 25.67
志贺氏菌属Shigella Castellani 14.23
产气荚膜梭菌Clostridium perfringen 16.75
实施例5植物乳杆菌NHE-LpB6401抗逆性验证
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表3所示。从表3中可以看出，植物乳杆菌NHE-LpB6401在pH1.5、pH2.0、pH2.5的人工胃液(含酶)中分别处理3h存活率均在99％以上，表明该菌株NHE-LpB6401具有较高的耐酸性，可以耐受胃酸，能顺利到达肠道发挥作用。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
表3植物乳杆菌NHE-LpB6401在人工胃液中处理后3h的存活情况
处理 pH1.5 pH2.0 pH2.5
初始活性CFU/mL <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]>
处理后活性CFU/mL <![CDATA[8.09×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]>
处理后存活率％ 99.02 100 100
2、耐人工肠液性能测定
取1mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果显示，植物乳杆菌NHE-LpB6401在人工肠液中活性不减少，存活率100％，表明该菌株能很好在肠液中生存并保存活力，从而发挥其益生作用。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL植物乳杆菌NHE-LpB6401菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表4所示。植物乳杆菌NHE-LpB6401在0.3％胆盐溶度的溶液中处理2小时，存活率为95.23％，表明该菌株具有较高的耐胆盐性，可以耐受十二指肠液中的胆盐，使菌株能到达肠道去发挥作用。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
表4植物乳杆菌NHE-LpB6401在不同浓度胆盐溶液中处理2h后的存活情况
处理 0.15％ 0.3％ 1％ 1.5％
初始活性CFU/mL <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]>
处理后活性CFU/mL <![CDATA[8.17×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[7.78×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[7.01×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[6.92×10<sup>9</sup>]]>
处理后存活率％ 100 95.23 85.80 84.70
实施例6小鼠攻毒试验
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加植物乳杆菌发酵液，添加浓度为1×106CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加植物乳杆菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×106CFU/mL浓度的植物乳杆菌NHE-LpB6401发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
所述植物乳杆菌发酵液为实施例2制备的发酵液，然后通过离心收集菌体，收集获得的菌体用生理盐水洗涤3-5次除去发酵液。
第一阶段生长性能显示饲喂植物乳杆菌NHE-LpB6401的小鼠增重明显，表明植物乳杆菌NHE-LpB6401促进消化吸收，提高饲料效率。
沙门氏菌攻毒后，通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出，发病严重小鼠眼睛带血，不能睁开。攻毒后，第1天，负对照组开始有发病症状，且死亡4只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。试验组在第1天和第2天各死亡1只，其它小鼠3天内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常。
攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表6所示，试验组小鼠攻毒后中毒现象不严重，表明植物乳杆菌NHE-LpB6401对沙门氏菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受沙门氏菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。
表5小鼠增重情况
分组 平均始重(g/只) 平均末重(g/只) 平均增长率(％)
对照组 15.14±0.22 29.23±0.56 <![CDATA[93.06<sup>b</sup>]]>
负对照组 15.56±0.38 29.12±0.51 <![CDATA[87.15<sup>c</sup>]]>
试验组 15.66±0.32 39.74±0.56 <![CDATA[153.77<sup>a</sup>]]>
表6攻毒前、后的小鼠死亡情况
实施例7植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂对樱桃谷肉鸭生产性能的影响
本试验选用1日龄樱桃谷肉鸭4200只，随机分成两组，每组20个重复，每重复105只。以基础日粮作为对照组，不添加植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂，试验组是在基础日粮基础上添加本发明实施例3备的植物乳杆菌NHE-LpB6401微生态制剂(每千克饲料含1ⅹ106CFU植物乳杆菌NHE-LpB6401)。试验肉鸭每日饲喂两次(07:00和16:00)，自由采食和自由饮水，饲养至38日龄出栏。每天记录投料量、剩料量、死淘数以及死淘重，其他饲养管理如免疫等程序按常规规程执行。。
本试验结果表明，由表7知，与对照组相比，后期植物乳杆菌组肉鸭的料肉比显著降低(P<0.05)，而平均日增重和平均日采食量有提高的趋势。从全期来看，植物乳杆菌组肉鸭出栏体重显著高于对照组(P<0.05)，料肉比(1.74)低于对照组(1.77)，成活率(97.8％)也高于对照组(96.6)。从造肉成本看，植物乳杆菌组(4.38)比竞品组(4.62)低0.24元/kg。。本试验表明在樱桃谷肉鸭饲料中添加植物乳杆均微生态制剂能够提高肉鸭的生长性能，同时可以提高肉鸭成活率，降低造肉成本。
表7植物乳杆菌微生态制剂对樱桃谷肉鸭生长性能影响
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新希望六和股份有限公司
四川新希望畜牧科技有限公司
成都枫澜科技有限公司
<120> 一株植物乳杆菌NHE-LpB6401及应用
<130> 2029
<141> 2021-05-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60
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gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1260
attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaaccag ccgc 1434

Claims (1)

1.一种含有保藏编号为CGMCC No.22645的植物乳杆菌NHE-LpB6401或含有其的菌剂在制备抗菌微生物制剂中的应用，其特征在于所述抗菌微生物制剂同时抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属和产气荚膜杆菌。
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