CN106721523B - 一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂 - Google Patents

一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及饲料添加剂领域，公开了一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂。本发明所述微生态制剂包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母或嗜酸乳杆菌。该微生态制剂在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中应用。本发明所述复合微生态制剂可以制成兽药、饲料添加剂单独使用，也可拌于大菱鲆养殖饲料中直接喂食，应用效果显著，具有良好的经济和社会效益。

Description

一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂
技术领域
本发明涉及饲料添加剂领域，具体涉及一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂。
背景技术
大菱鲆，俗称“多宝鱼”，是世界公认的优质比目鱼之一。大菱鲆胶质蛋白含量高，味道鲜美，营养丰富，具有补肾健脑、助阳提神和美容养颜的功效，长期食用，可以滋补健身，提高人的抗病能力，是一种名贵的食用鱼，1992年由中国黄海水产研究所从英国引进，1999年大规模生产获得成功后，成为北方海水养殖的重要对象。
随着大菱鲆养殖热潮的到来，大菱鲆的养殖问题也得到了人们的广泛关注。2006年，上海大菱鲆硝基呋喃等抗生素药残过量事件，造成了人们对大菱鲆食品安全的信任危机。药残超标风波，造成山东省约5000万尾大菱鲆囤积，经济损失近20亿元。目前，10年过去了，药残阴影还未消除，消费者对大菱鲆的信誉一直没有重新建立，抗生素的残留问题严重影响了大菱鲆养殖业的发展。
如何针对大菱鲆的养殖过程，寻找绿色、高效饲料添加剂成为挽救大菱鲆产业的关键。目前，有研究者在大菱鲆养殖中添加中草药进行大菱鲆养殖过程中疾病的预防和治疗，但长期和大量的使用中草药物，会带来大菱鲆免疫力低和生长迟缓的问题，没有能从根本上解决大菱鲆养殖的问题。使用益生菌类饲料添加剂，调节大菱鲆的肠道，提高摄食及消化，提高大菱鲆的免疫力，可以从根本上解决大菱鲆养殖过程中的用药问题。目前，市场上大量的益生菌饲料添加剂产品存在效果差的问题，究其原因主要是菌种差，菌株搭配不合理。所以选择优良的菌种及获得不同菌株之间的有效配方是成功解决大菱鲆养殖问题的关键。
嗜酸乳杆菌是一种主要调节动物肠道菌群平衡的一种益生菌，可以在动物的肠道内分离乳酸、乙酸和肽类抗菌素，抑制不良微生物的增殖，对致病菌具有拮抗作用，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，具有很好的营养保健作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂，其特征是包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母或嗜酸乳杆菌。
本发明的微生态制剂，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(DH077)，保藏编号CGMCC No.11783。
本发明的微生态制剂，所述地衣芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌(DH136)，保藏编号CGMCC No.11784。
本发明的微生态制剂，所述酿酒酵母包括酿酒酵母(DH219)，保藏编号CGMCCNo.11785。
本发明的微生态制剂，所述嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(DH276)，保藏编号CGMCCNo.12838。
本发明的枯草芽孢杆菌(DH077)从健康大菱鲆肠道内分离获得。根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH077的菌株为枯草芽孢杆菌；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌落形态
显微镜观察：长2-3微米，宽0.7-0.8微米，菌体杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，中生或近中生。
平板形态：菌落扁平，边缘不整齐，表面粗糙褶皱，颜色淡黄，表面无光泽。
2、生理生化鉴定
吲哚：－；明胶液化：+；卵黄反应：－；V-P试验：+；接触酶：+；是否需氧：需氧性。
3、糖酵解实验鉴定
阿拉伯糖：－；葡萄糖：+；木糖：－；甘露糖：－。
枯草芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g，调pH 7.2，121℃，灭菌15分钟。
枯草芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022 g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸钠0.0016g，磷酸氢二钾0.008g，调pH7.4，121℃，灭菌15分钟。
本发明的地衣芽孢杆菌(DH136)从健康大菱鲆肠道内分离获得。根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH136的菌株为地衣芽孢杆菌；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌体或菌落形态
显微镜观察：菌体长1.5-3微米，宽0.6-0.8微米，革兰氏染色阳性，芽孢呈椭圆型或柱状，中生或偏中生。
平板形态：菌落不透明、白色、湿润有光泽。
2、生理生化鉴定
吲哚：－；明胶液化：+；硝酸盐还原：+；卵黄反应：－；V-P试验：+。
3、糖酵解实验鉴定
阿拉伯糖：+；葡萄糖：+；木糖：+；甘露糖：+。
地衣芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂25.0g，调pH 7.2，121℃，灭菌15分钟。
地衣芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸钠0.0016g，磷酸氢二钾0.008g，调pH7.4，121℃，灭菌15分钟。
本发明的酿酒酵母(DH219)从健康大菱鲆肠道内分离获得。根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH219的菌株为酿酒酵母；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌体或菌落形态
显微镜观察：菌体长4-12微米，宽2-3.6微米，细胞圆形，单个。
平板形态：菌落乳白色，光滑，圆形，边缘光滑。
2、生理生化鉴定
放线菌酮生长试验：－。
3、糖酵解实验鉴定
蔗糖：+；葡萄糖：+；半乳糖：+；乳糖：－。
酿酒酵母菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，琼脂25.0g，调pH 7.4，115℃,灭菌15分钟
酿酒酵母菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1L，葡萄糖20g，蛋白胨7.5g，酵母粉7.5g，磷酸氢二钾0.156g，七水硫酸镁0.496g，调pH 6.5，121℃，灭菌15分钟。
本发明的嗜酸乳杆菌(DH276)从健康大菱鲆肠道内分离获得。根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH276的菌株为嗜酸乳杆菌；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌体或菌落形态
菌体形态：菌体在显微镜下呈短杆状，两端为圆形，长1.5-6微米，宽0.6-0.9微米，以单个、成双或短链排列。不运动，无鞭毛，无芽孢，革兰氏染色阳性。
菌落形态：固体培养基上菌落形态通常较粗糙，用显微镜观察显示为缠绕或微毛丝状物，从菌堆中心放射出来，深层菌落呈放射或分枝的不规则形状，无色素。
2、生理生化特征：
最适生长温度为35-38℃，兼性厌氧，耐NaCl浓度10％(质量分数)。菌株的最适生长pH值5.5-6.0。不具有致病性，不产毒素。
碳源：多数寡糖；
氮源：蛋白胨、肽类和氨基酸；矿物元素：磷、硫、钠、钾、钙、镁、锰、铁和锌；需要叶酸、泛酸钙、箊酸、吡哆醛或吡哆胺、核黄素，不需要外源硫胺素和胸腺嘧啶核苷。
能发酵葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、水杨苷、苦杏仁苷、葡萄糖酸、甘露糖、核糖，不发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、木糖、鼠李糖；精氨酸水解不产NH3，发酵葡萄糖不产气，接触酶阴性。
在一些实施方案中，本发明以饲喂基础日粮作为对照，对饲喂含有本发明所述枯草芽孢杆菌(DH077)的基础日粮，大菱鲆养殖30天体重增重率、饲料系数和攻毒死亡率进行检测，结果显示饲喂含有本发明所述枯草芽孢杆菌(DH077)的基础日粮后，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
在一些实施方案中，本发明以饲喂基础日粮作为对照，对饲喂含有本发明所述地衣芽孢杆菌(DH136)的基础日粮，大菱鲆养殖30天体重增重率、饲料系数和攻毒死亡率进行检测，结果显示饲喂含有本发明所述地衣芽孢杆菌(DH136)的基础日粮后，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
在一些实施方案中，本发明以饲喂基础日粮作为对照，对饲喂含有本发明所述酿酒酵母(DH219)的基础日粮，大菱鲆养殖30天体重增重率、饲料系数和攻毒死亡率进行检测，结果显示饲喂含有本发明所述酿酒酵母(DH219)的基础日粮后，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
在一些实施方案中，本发明以饲喂基础日粮作为对照，对饲喂含有本发明所述嗜酸乳杆菌(DH276)的基础日粮，大菱鲆养殖30天体重增重率、饲料系数和攻毒死亡率进行检测，结果显示饲喂含有本发明所述嗜酸乳杆菌(DH276)的基础日粮后，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
在一些实施方案中，本发明以饲喂基础日粮作为对照，对饲喂含有本发明所述微生态制剂的基础日粮，大菱鲆养殖30天体重增重率、饲料系数和攻毒死亡率进行检测，结果显示饲喂含有本发明所述微生态制剂的基础日粮后，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
本发明的微生态制剂，在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中应用。也可以添加本发明以外的活性物质，联合应用。
本领域技术人员可以理解，本发明所述益生菌均为具有生物活性的微生物。本发明所述复合微生态制剂可以制成兽药、饲料添加剂单独使用，也可拌于水产动物饲料中直接喂食。
本发明还提供了一种微生物制剂包括上述复合微生态制剂。
本发明所述微生物制剂可以为固体制剂或液态制剂。所述的固体制剂中枯草芽孢杆菌活菌数≥1.0×108cfu/g，地衣芽孢杆菌活菌数≥1.0×108cfu/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×107cfu/g，嗜酸乳杆菌活菌数≥1.0×108cfu/g。所述的液体制剂中枯草芽孢杆菌活菌数≥1.0×108cfu/mL，地衣芽孢杆菌活菌数≥1.0×108cfu/mL，酿酒酵母活菌数≥1.0×107cfu/mL，嗜酸乳杆菌活菌数≥1.0×108cfu/mL。
其中所述微生物固体制剂为益生菌菌粉和载体混合制成的粉末制剂或颗粒制剂。所述载体可以为沸石粉、麦饭石、凹凸棒石(粉)。
所述的液体制剂为益生菌菌液。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂。本发明所述微生态制剂包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母或嗜酸乳杆菌。该微生态制剂在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中应用。本发明所述复合微生态制剂可以制成兽药、饲料添加剂单独使用，也可拌于大菱鲆养殖饲料中直接喂食，应用效果显著，具有良好的经济和社会效应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：枯草芽孢杆菌(DH077)的分离与菌种鉴定
在实验室无菌操作台内，取健康大菱鲆肠道，进行菌种分离。将大菱鲆肠道剪碎匀浆。用适量生理盐水悬浮混匀，离心5min收集上清浊液，再加入适量生理盐水，8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。吸取1ml上浊液加入一支装有9ml生理盐水的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取大菱鲆肠道原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1ml涂布于枯草芽孢杆菌分离平板上，置于37℃培养24小时。在分离培养基上，枯草芽孢杆菌的菌落特征较为典型，菌落扁平，边缘不整齐，表面粗糙褶皱，颜色淡黄，表面无光泽。挑取具有以上特征的疑似菌落于枯草芽孢杆菌液体增菌培养基中，37℃培养24h后，对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行生理生化和糖酵解实验，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。经鉴定为枯草芽孢杆菌DH077。
实施例2：枯草芽孢杆菌(DH077)在大菱鲆养殖中的应用
枯草芽孢杆菌(DH077)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。枯草芽孢杆菌(DH074，青岛东海药业有限公司分离获得)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。枯草芽孢杆菌(市面上购买)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。
将以上3种枯草芽孢杆菌菌粉按1:100的质量比例添加到大菱鲆基础日粮中，进行大菱鲆养殖试验。
将240条大菱鲆随机分为4组，每组3个重复。Ⅰ组为基础日粮(对照组)；Ⅱ组为基础日粮中添加1％本发明的枯草芽孢杆菌(DH077)菌粉。Ⅲ组为基础日粮中添加1％枯草芽孢杆菌(DH074)菌粉。Ⅳ组为基础日粮中添加1％枯草芽孢杆菌(市面上购买)菌粉。试验使用的水族箱体积为0.05m×0.04m×0.03m，每箱投20条体重为390g±11g的大菱鲆。
养殖方法：大菱鲆适应性养殖14天后，随机分组。按上述处理饲喂不同饲料进行试验性养殖。适应性养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂基础日粮，试验养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂上述4组处理的饲料，每天8:00，12:00，15:00换水排污，换水量50％，并尽量将缸底的污物吸出。大菱鲆一天喂3次，8:00，12:00，18:00。适应性养殖及试验性养殖期间保持水温15℃±2℃。
试验处理方法：试验养殖30天，每天记录每组试验组的饲料投喂量。试验开始前，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆初始总重量。试验结束后，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆末总重量。体重增长率＝[末均重(g)－初均重(g)]/初均重×100％；饲料系数＝总摄食量(g)/[总末重(g)+死亡大菱鲆重量－总初重(g)]。将大菱鲆养殖处理30天后，对每组试验的大菱鲆分别注射鳗弧菌菌液。观察各组大菱鲆14天攻毒死亡率。攻毒死亡率＝死亡条数/起始养殖条数×100％。试验结果如表1。
表1枯草芽孢杆菌应用于大菱鲆30天养殖试验结果统计
Figure BDA0001159890530000071
表1结果，与对照组相比，各处理组大菱鲆30天养殖体重增长率均显著高于对照组(P<0.05)、饲料系数均显著低于对照组(P<0.05)、攻毒死亡率均显著低于对照组(P<0.05)。其中实验Ⅱ组大菱鲆30天养殖体重增长率显著高于实验Ⅲ组(P<0.05)，极显著高于实验Ⅳ组(P<0.01)；实验Ⅱ组饲料系数显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)；实验Ⅱ组攻毒死亡率显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)。说明实验Ⅱ组效果最优。通过实验结果可以说明本发明的枯草芽孢杆菌(DH077)在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
实施例3：地衣芽孢杆菌(DH136)的分离与菌种鉴定
在实验室无菌操作台内，取健康大菱鲆肠道，进行菌种分离。将大菱鲆肠道剪碎匀浆。用适量生理盐水悬浮混匀，离心5min收集上清浊液，再加入适量生理盐水，8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。吸取1ml上浊液加入一支装有9ml生理盐水的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取大菱鲆肠道原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1ml涂布于地衣芽孢杆菌分离平板上，置于37℃培养24小时。在分离培养基上，地衣芽孢杆菌的菌落特征较为典型，菌落不透明、白色、湿润有光泽。挑取具有以上特征的疑似菌落于地衣芽孢杆菌液体增菌培养基中，37℃培养24h后，对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行生理生化和糖酵解实验，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。经鉴定为地衣芽孢杆菌DH136。
实施例4：地衣芽孢杆菌(DH136)在大菱鲆养殖中的应用
地衣芽孢杆菌(DH136)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。地衣芽孢杆菌(DH140，青岛东海药业有限公司分离获得)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。地衣芽孢杆菌(市面上购买)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。
将以上地衣芽孢杆菌菌粉按1:100的质量比例添加到大菱鲆基础日粮中，进行大菱鲆养殖试验。
将240条大菱鲆随机分为4组，每组3个重复。Ⅰ组为基础日粮(对照组)；Ⅱ组为基础日粮中添加1％本发明的地衣芽孢杆菌(DH136)菌粉。Ⅲ组为基础日粮中添加1％地衣芽孢杆菌(DH140)菌粉。Ⅳ组为基础日粮中添加1％地衣芽孢杆菌(市面上购买)菌粉。试验使用的水族箱体积为0.05m×0.04m×0.03m，每箱投20条体重为390g±11g的大菱鲆。
养殖方法：大菱鲆适应性养殖14天后，随机分组。按上述处理饲喂不同饲料进行试验性养殖。适应性养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂基础日粮，试验养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂上述2组处理的饲料，每天8:00，12:00，15:00换水排污，换水量50％，并尽量将缸底的污物吸出。大菱鲆一天喂3次，8:00，12:00，18:00。适应性养殖及试验性养殖期间保持水温15℃±2℃。
试验处理方法：试验养殖30天，每天记录每组试验组的饲料投喂量。试验开始前，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆初始总重量。试验结束后，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆末总重量。体重增长率＝[末均重(g)－初均重(g)]/初均重×100％；饲料系数＝总摄食量(g)/[总末重(g)+死亡大菱鲆重量－总初重(g)]。将大菱鲆养殖处理30天后，对每组试验的大菱鲆分别注射鳗弧菌菌液。观察各组大菱鲆14天攻毒死亡率。攻毒死亡率＝死亡条数/起始养殖条数×100％。试验结果如表2。
表2地衣芽孢杆菌应用于大菱鲆30天养殖试验结果统计
Figure BDA0001159890530000091
表2结果，与对照组相比，各处理组大菱鲆30天养殖体重增长率均显著高于对照组(P<0.05)、饲料系数均显著低于对照组(P<0.05)、攻毒死亡率均显著低于对照组(P<0.05)。其中实验Ⅱ组大菱鲆30天养殖体重增长率极显著高于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.01)；实验Ⅱ组饲料系数显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)；实验Ⅱ组攻毒死亡率显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)。说明实验Ⅱ组效果最优。通过实验结果可以说明本发明的地衣芽孢杆菌(DH136)在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
实施例5：酿酒酵母(DH219)的分离与菌种鉴定
在实验室无菌操作台内，取健康大菱鲆肠道，进行菌种分离。将大菱鲆肠道剪碎匀浆。用适量生理盐水悬浮混匀，离心5min收集上清浊液，再加入适量生理盐水，8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。吸取1ml上浊液加入一支装有9ml生理盐水的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取大菱鲆肠道原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1ml涂布于酿酒酵母分离平板上，置于28℃培养48小时。在分离培养基上，酿酒酵母菌的菌落特征较为典型，菌落乳白色，光滑，圆形，边缘光滑。挑取具有以上特征的疑似菌落于酿酒酵母液体增菌培养基中，28℃培养24h后，对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行生理生化和糖酵解实验，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。经鉴定为酿酒酵母DH219。
实施例6：酿酒酵母(DH219)在大菱鲆养殖中的应用
酿酒酵母(DH219)菌粉，活菌数1.0×107cfu/g以上。酿酒酵母(DH240，青岛东海药业有限公司分离获得)菌粉，活菌数1.0×107cfu/g以上。酿酒酵母(市面上购买)菌粉，活菌数1.0×107cfu/g以上。
将以上酿酒酵母菌粉按1:100的质量比例添加到大菱鲆基础日粮中，进行大菱鲆养殖试验。
将240条大菱鲆随机分为4组，每组3个重复。Ⅰ组为基础日粮(对照组)；Ⅱ组为基础日粮中添加1％本发明的酿酒酵母(DH219)菌粉。Ⅲ组为基础日粮中添加1％酿酒酵母(DH240)菌粉。Ⅳ组为基础日粮中添加1％酿酒酵母(市面上购买)菌粉。试验使用的水族箱体积为0.05m×0.04m×0.03m，每箱投20条体重为390g±11g的大菱鲆。
养殖方法：大菱鲆适应性养殖14天后，随机分组。按上述处理饲喂不同饲料进行试验性养殖。适应性养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂基础日粮，试验养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂上述2组处理的饲料，每天8:00，12:00，15:00换水排污，换水量50％，并尽量将缸底的污物吸出。大菱鲆一天喂3次，8:00，12:00，18:00。适应性养殖及试验性养殖期间保持水温15℃±2℃。
试验处理方法：试验养殖30天，每天记录每组试验组的饲料投喂量。试验开始前，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆初始总重量。试验结束后，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆末总重量。体重增长率＝[末均重(g)－初均重(g)]/初均重×100％；饲料系数＝总摄食量(g)/[总末重(g)+死亡大菱鲆重量－总初重(g)]。将大菱鲆养殖处理30天后，对每组试验的大菱鲆分别注射鳗弧菌菌液。观察各组大菱鲆14天攻毒死亡率。攻毒死亡率＝死亡条数/起始养殖条数×100％。试验结果如表3。
表3酿酒酵母应用于大菱鲆30天养殖试验结果统计
Figure BDA0001159890530000101
表3结果，与对照组相比，各处理组大菱鲆30天养殖体重增长率均显著高于对照组(P<0.05)、饲料系数均显著低于对照组(P<0.05)、攻毒死亡率均显著低于对照组(P<0.05)。其中实验Ⅱ组大菱鲆30天养殖体重增长率显著高于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)；实验Ⅱ组饲料系数显著低于实验Ⅲ组(P<0.05)，低于实验Ⅳ组，但差异不显著；实验Ⅱ组攻毒死亡率极显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.01)。说明实验Ⅱ组效果最优。通过实验结果可以说明本发明的酿酒酵母(DH219)在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
实施例7：嗜酸乳杆菌(DH276)的分离与菌种鉴定
在实验室无菌厌氧操作台内，取健康大菱鲆肠道，进行菌种分离。将大菱鲆肠道剪碎匀浆。用适量PBS缓冲液悬浮混匀，离心5min收集上清浊液，再加入适量PBS缓冲液，8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。吸取1ml上浊液加入一支装有9ml PBS稀释液(含有5‰L-半胱氨酸)的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取大菱鲆肠道原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1ml涂布于MRS平板上，置于厌氧罐中37℃厌氧培养48小时。在MRS培养基上，乳酸菌的菌落特征较为典型，易与其它细菌分离开来：菌落光滑、凸圆，边缘完整，颜色呈乳褐色或乳白，菌落直径0.6-1.8mm。挑取具有以上特征的疑似菌落于MRS液体增菌培养基中，37℃培养24h后，对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行接触酶实验及凝乳实验，去除接触酶阳性及无凝乳现象之菌株，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。经鉴定为嗜酸乳杆菌DH276。
实施例8：嗜酸乳杆菌(DH276)在大菱鲆养殖中的应用
嗜酸乳杆菌(DH276)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。嗜酸乳杆菌(DH274，青岛东海药业有限公司分离获得)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。嗜酸乳杆菌(市面上购买)菌粉，活菌数1.0×108cfu/g以上。
将以上嗜酸乳杆菌菌粉按1:100的质量比例添加到大菱鲆基础日粮中，进行大菱鲆养殖试验。
将240条大菱鲆随机分为4组，每组3个重复。Ⅰ组为基础日粮(对照组)；Ⅱ组为基础日粮中添加1％本发明的嗜酸乳杆菌(DH276)菌粉。Ⅲ组为基础日粮中添加1％嗜酸乳杆菌(DH274)菌粉。Ⅳ组为基础日粮中添加1％嗜酸乳杆菌(市面上购买)菌粉。试验使用的水族箱体积为0.05m×0.04m×0.03m，每箱投20条体重为390g±11g的大菱鲆。
养殖方法：大菱鲆适应性养殖14天后，随机分组。按上述处理饲喂不同饲料进行试验性养殖。适应性养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂基础日粮，试验养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂上述2组处理的饲料，每天8:00，12:00，15:00换水排污，换水量50％，并尽量将缸底的污物吸出。大菱鲆一天喂3次，8:00，12:00，18:00。适应性养殖及试验性养殖期间保持水温15℃±2℃。
试验处理方法：试验养殖30天，每天记录每组试验组的饲料投喂量。试验开始前，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆初始总重量。试验结束后，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆末总重量。体重增长率＝[末均重(g)－初均重(g)]/初均重×100％；饲料系数＝总摄食量(g)/[总末重(g)+死亡大菱鲆重量－总初重(g)]。将大菱鲆养殖处理30天后，对每组试验的大菱鲆分别注射鳗弧菌菌液。观察各组大菱鲆14天攻毒死亡率。攻毒死亡率＝死亡条数/起始养殖条数×100％。试验结果如表4。
表4嗜酸乳杆菌应用于大菱鲆30天养殖试验结果统计
Figure BDA0001159890530000121
表4结果，与对照组相比，各处理组大菱鲆30天养殖体重增长率均显著高于对照组(P<0.05)、饲料系数均显著低于对照组(P<0.05)、攻毒死亡率均显著低于对照组(P<0.05)。其中实验Ⅱ组大菱鲆30天养殖体重增长率显著高于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.05)；实验Ⅱ组饲料系数极显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.01)；实验Ⅱ组攻毒死亡率极显著低于实验Ⅲ组和实验Ⅳ组(P<0.01)。说明实验Ⅱ组效果最优。通过实验结果可以说明本发明的嗜酸乳杆菌(DH276)在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
实施例9：微生态制剂在大菱鲆养殖中的应用
固体微生态制剂：枯草芽孢杆菌活菌数1.0×108cfu/g、地衣芽孢杆菌1.0×108cfu/g、酿酒酵母1.0×107cfu/g、嗜酸乳杆菌活菌数1.0×108cfu/g，以上成分与沸石粉混合均匀，得到固体微生态制剂。
将制备的固体微生态制剂，按1:100的质量比例添加到大菱鲆基础日粮中，进行大菱鲆养殖试验。
将120条大菱鲆随机分为2组，每组3个重复。Ⅰ组为基础日粮(对照组)；Ⅱ组为基础日粮中添加1％本发明的固体微生态制剂。试验使用的水族箱体积为0.05m×0.04m×0.03m，每箱投20条体重为390g±11g的大菱鲆。
养殖方法：大菱鲆适应性养殖14天后，随机分组。按上述处理饲喂不同饲料进行试验性养殖。适应性养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂基础日粮，试验养殖期间按照大菱鲆体重的1％投喂上述2组处理的饲料，每天8:00，12:00，15:00换水排污，换水量50％，并尽量将缸底的污物吸出。大菱鲆一天喂3次，8:00，12:00，18:00。适应性养殖及试验性养殖期间保持水温15℃±2℃。
试验处理方法：试验养殖30天，每天记录每组试验组的饲料投喂量。试验开始前，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆初始总重量。试验结束后，试验大菱鲆饥饿处理24h，称重，记录每组大菱鲆末总重量。体重增长率＝[末均重(g)－初均重(g)]/初均重×100％；饲料系数＝总摄食量(g)/[总末重(g)+死亡大菱鲆重量－总初重(g)]。将大菱鲆养殖处理30天后，对每组试验的大菱鲆分别注射鳗弧菌菌液。观察各组大菱鲆14天攻毒死亡率。攻毒死亡率＝死亡条数/起始养殖条数×100％。试验结果如表5。
表5微生态制剂应用于大菱鲆30天养殖试验结果统计
组别 处理 体重增长率 饲料系数 攻毒死亡率
Ⅰ组 基础日粮 5±1％ 1.47±0.11 70±5％
Ⅱ组 基础日粮+1％固体微生态制剂 19±2％ 1.01±0.08 10±5％
由表5结果可知，与对照组相比，实验Ⅱ组大菱鲆30天养殖体重增长率明显增高(P<0.05)、饲料系数均显著降低(P<0.01)、攻毒死亡率显著降低(P<0.01)。通过实验结果可以说明本发明的微生态制剂在提高大菱鲆生长率，降低大菱鲆饲料系数，提高大菱鲆养殖成活率中效果显著。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年12月04日、2016年8月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏，共4个下述微生物菌种。
(1)分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号CGMCC No. 11783。
(2)分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏编号CGMCC No.11784。
(3)分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号CGMCC No. 11785。
(4)分类命名：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号CGMCC No.12838。
上述4个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。

Claims (3)

1.一种应用于大菱鲆养殖的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中的益生菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)组成；其中：枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌DH077，保藏编号CGMCCNo.11783；地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌DH136，保藏编号CGMCCNo.11784；酿酒酵母为酿酒酵母DH219，保藏编号CGMCCNo.11785；嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌DH276，保藏编号CGMCCNo.12838；
该微生态制剂为固体制剂，由以下菌粉与常用辅料混合得到：
枯草芽孢杆菌菌粉，活菌数≥1.0×108cfu/g，
地衣芽孢杆菌菌粉，活菌数≥1.0×108cfu/g，
酿酒酵母菌粉，活菌数≥1.0×107cfu/g，
嗜酸乳杆菌菌粉，活菌数≥1.0×108cfu/g。
2.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌均指活的生物个体。
3.权利要求1或2所述的微生态制剂在提高大菱鲆生长率、降低大菱鲆饲料系数、提高大菱鲆养殖成活率中的 应用。
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