CN101948784A - 一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用 - Google Patents

一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用 Download PDF

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蔡俊鹏
陈小红
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华南理工大学
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Abstract

本发明公开了一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用。发酵方法包括以下步骤:(1)宿主菌悬液的制备;(2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备;(3)蛭弧菌制剂的制备。本发明所述的发酵方法中采用的宿主菌均为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌,既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革兰氏阴性菌的能力,用该方法制得的蛭弧菌制剂对致病菌的裂解能力有了一定的提高;所制得的蛭弧菌制剂又可以直接使用,无需经过更多的发酵后处理,该制剂的使用范围也大大的增加。本发明在得到高浓度蛭弧菌菌液的同时,相对也缩短了发酵周期,这样有效的解决了发酵时间过长而导致的能源消耗过大,生产成本过高的问题,得到的蛭弧菌制剂不仅成本低,而且活性高。

Description

一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及发酵技术领域,具体涉及一种蛭弧菌制剂及其发酵方法与应用。 背景技术
[0002] 目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理和/或化学的方法,包括各种抗 生素的使用。物理和/或化学的方法都存在着明显的弊端,首先,抗生素大量滥用,会导致 一些副作用的产生,如病原菌的抗药性、抑制有益菌群等。其次,酸碱处理的方法虽可达到 一定的灭菌/杀菌效果,但在有害菌形成生物膜后,这些方法的效果就极不理想。最后,物 理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节,而难以扩展到整个领 域的所有环节。生物防治的方法则可具有强大的优越性,极有可能使其服务于日常生活的 病害防治以及生物战和恐怖袭击中大规模的水源性、食源性污染的处理等。
[0003] 近年来微生物生态制剂的研究开发受到各方关注,特别是蛭弧菌的研究受到人们 的青睐。蛭弧菌自1963年被发现以来,因其是一种寄生菌,能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜 水气单胞菌、弧菌等革兰氏阴性致病菌且对人和动物无害,而备受关注。
[0004] 将蛭弧菌应用于防治致病菌的关键是获得浓度高、裂解能力强的蛭弧菌制剂。为 此,人们对蛭弧菌制剂的制备方法进行了不懈的研究,譬如专利申请号为93111749. 6、名称 为“生物制菌王及其生产方法”的国家发明专利申请提出用高温(70〜150°C )或化学药物 (氯仿等)将大肠杆菌杀死,制造灭活的宿主菌,接着用其培养蛭弧菌,得到蛭弧菌制剂;专 利申请号200810145709. 5、名称为“蛭弧菌微生态制剂的生产方法”提供了蛭弧菌微生态制 剂的生产方法,主要和传统方法不同的是将宿主大肠杆菌冻干成菌粉使用。上述两份专利 申请都采用活的大肠杆菌作为宿主菌,最终会影响生态环境。而本发明所用的宿主菌均为 有益菌或是对环境无害的菌,不会对环境构成威胁。专利申请号200810202809. 7、名称为 “双效蛭弧菌的发酵生产方法”的国家发明专利申请提供了一种双效蛭弧菌的发酵生产方 法,即先发酵制备宿主菌的混悬液,再加入宿主菌混悬液和蛭弧菌液到配制好的培养液中 进行发酵。虽然该生产方法生产出的蛭弧菌含量较高(5X108pfu/mL),但是其宿主菌选用 了致病性的嗜水气单胞菌,而且发酵时间较长(72〜120h),会导致其生产成本的增加。另 外,此技术也可能存在着所得的蛭弧菌裂解活性不高的问题。而本发明采用的是革兰氏阳 性菌为宿主,实验证明,以此宿主发酵制得的蛭弧菌能够维持,甚至提高对其他革兰氏阴性 菌和阳性菌的裂解能力。
发明内容
[0005] 为了克服现有方法所制备的蛭弧菌制剂含量低以及裂解活性低的问题,本发明的 首要目的在于提供一种蛭弧菌制剂的发酵方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种由上述发酵方法制备得到的蛭弧菌制剂。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制剂的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种蛭弧菌制剂的发酵方法,包括以下步骤:
[0009] (1)宿主菌悬液的制备
[0010] 将宿主菌培养至对数生长期,收集菌体,接着用磷酸盐缓冲液调整浓度,得到浓度 为1017〜1022cfu/mL的宿主菌悬浮液,然后置于2〜15°C中保存备用;
[0011] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0012] 在磷酸盐缓冲液中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液,调整宿主菌的浓度为 1010〜1015cfu/mL,再接入蛭弧菌斑,然后将此培养液在20〜40°C培养20〜60h,再在2〜 15°C,5000〜8000rpm离心15〜35min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在2〜15°C, 12000〜20000rpm离心15〜40min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀 中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为106〜109pfu/mL,得到蛭弧菌游泳体浓缩 液,置于2〜15°C保存备用;
[0013] (3)蛭弧菌制剂的制备:
[0014] 将氯化钠溶于溶剂中形成质量体积比浓度为0〜30g/L的氯化钠溶液,灭菌,得 到发酵培养基;在发酵培养基中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧 菌游泳体浓缩液,使宿主菌起始浓度为〜1015cfu/mL,蛭弧菌游泳体起始浓度为101〜 103pfu/mL,进行发酵;发酵温度控制在28〜30°C,pH值控制在7. 2〜7. 6 ;设置搅拌转速 与溶氧联动,使溶氧水平控制在20%〜30%;发酵过程中加1〜3次宿主菌悬浮液,每次加 入宿主菌悬浮液的间隔时间12〜18h,每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发 酵培养基中的浓度为101Q〜1015cfu/mL为准;发酵培养36〜48h即制成蛭弧菌制剂;所述 溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。
[0015] 步骤⑴所述宿主菌为有益的或对环境无害的革兰氏阳性菌,优选为枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、保力口禾丨J 亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcus acidilactici) > ?LStlillif (Streptococcus lactis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) lif (Lactobacillus lactis) (Lactobacillusplantarum) gJc 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus);
[0016]步骤(2)所述蛭弧菌为 BDF01、BDF02、BDF03、BDJO 1、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。
[0017] 所述BDF01于2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养 物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208008 ;所述BDF02于2008年1月13日保藏于中 国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208009;所述 BDF03于2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏 编号为CCTCC NO :M 208010 ;所述BDJ01于2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学 内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208011 ;所述BDJ02于2008年1 月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO: M208012 ;所述BDM01于2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物 保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208066 ;所述BDS01于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO =M 209169 ;所述BDS02 于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO =M 209170 ;所述BDSM08于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国 典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO =M 209171 Jy^iBDFMOS于2009年8月7日保 藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO :M 209172。
[0018] 步骤(1)所述收集菌体的方式优选为通过离心分离得到,离心条件为2〜15°C, 5000 〜8000rpm 离心 15 〜35min ;
[0019] 步骤⑴所述宿主菌悬浮液的浓度优选为IO17〜IO22CfuAiL ;
[0020] 步骤(2)所述蛭弧菌斑采用常规方法(根据申请号为200910042274. 6,名称为“一 种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请)进行分离得到。
[0021] 步骤(1)〜(3)任一项所述磷酸盐缓冲液优选为浓度是0. 1〜0. 3mol/L, pH是 7. 2〜7. 6的磷酸盐缓冲液;
[0022] 步骤(2)所述蛭弧菌游泳体浓缩液的浓度优选为IO6〜109pfu/mL ;
[0023] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于咸水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水,所 述氯化钠溶液的质量体积比浓度为25〜30g/L ;
[0024] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于咸淡水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水, 所述氯化钠溶液的质量体积比浓度为5〜10g/L ;
[0025] 步骤(3)所述蛭弧菌来源于淡水环境时,不加氯化钠;
[0026] 步骤(3)所述灭菌的条件优选为121°C灭菌20min ;
[0027] 步骤(3)所述蛭弧菌制剂的浓度为IO8〜1012pfu/mL ;
[0028] 步骤(3)所述DNB液体培养基是将营养肉汤0. Sg、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精 提物0. Ig溶于IOOOmL蒸馏水中,调节pH值至7. 2〜7. 6。
[0029] 一种蛭弧菌制剂,由所述的蛭弧菌制剂的发酵方法制备得到;
[0030] 所述蛭弧菌制剂可以通过裂解其它致病菌或潜在致病菌而达到防治病菌害的目 的。所述的蛭弧菌制剂不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体 制剂、蛭质体制剂以及它们的按比例混合的制剂。
[0031] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0032] (1)本发明所述的发酵方法中采用的宿主菌均为有益的或对环境无害的革兰氏阳 性菌。这样,一方面,可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革兰氏阴性菌的能力,而且实验证 明,用该方法制得的蛭弧菌制剂对致病菌的裂解能力有了一定的提高;另一方面,所制得的 蛭弧菌制剂可以直接使用,无需经过更多的发酵后处理;再者,因为宿主都是有益菌或是对 环境无害的菌株,该制剂的使用范围也大大的增加。
[0033] (2)本发明在得到高浓度蛭弧菌菌液的同时,相对也缩短了发酵周期,这样有效的 解决了发酵时间过长而导致的能源消耗过大,生产成本过高的问题,得到的蛭弧菌制剂不 仅成本低,而且活性高。
附图说明
[0034] 图1是以两种不同宿主(枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对鼠 伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的裂解能力_时间图。[0035] 图2是以两种不同宿主(纳豆芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对单 核增生李斯特菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解能力_时间图。
[0036] 图3是以两种不同宿主(两歧双歧杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制 剂对猪链球菌II型和乳房链球菌的裂解能力-时间图。
[0037] 图4是以两种不同宿主(粪肠球菌和猪霍乱沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对 表皮葡萄球菌和大肠杆菌的裂解能力_时间图。
[0038] 图5是以两种不同宿主(保加利亚乳杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对 类马链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解能力_时间图。
[0039] 图6是以两种不同宿主(乳酸片球菌和嗜水气单胞菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对 乳房链球菌和大肠杆菌的裂解能力_时间图。
[0040] 图7是以两种不同宿主(乳酸链球菌和猪链球II型)发酵制得的蛭弧菌制剂对 猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的裂解能力_时间图。
[0041] 图8是以两种不同宿主(屎肠球菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对鼠伤寒 沙门氏菌和单核增生李斯特菌的裂解能力_时间图。
[0042] 图9是以两种不同宿主(地衣芽孢杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对嗜 水气单胞菌和类马链球菌的裂解能力_时间图。
[0043] 图10是以两种不同宿主(嗜酸乳杆菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对金 黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解能力_时间图。
[0044] 图11是以两种不同宿主(干酪乳杆菌和嗜水气单胞菌)发酵制得的蛭弧菌制剂 对类马链球菌和大肠杆菌的裂解能力_时间图。
[0045] 图12是以两种不同宿主(乳酸乳杆菌和猪链球II型)发酵制得的蛭弧菌制剂对 表皮葡萄球菌和嗜水气单胞菌的裂解能力_时间图。
[0046] 图13是以两种不同宿主(植物乳杆菌和猪霍乱沙门氏菌)发酵制得的蛭弧菌制 剂对无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解能力_时间图。
[0047] 图14是以两种不同宿主(戊糖片球菌和大肠杆菌)发酵制得的蛭弧菌制剂对乳 房链球菌和链球菌II型的裂解能力-时间图。
具体实施方式
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限 于此。
[0049] 实施例1
[0050] 分别以枯草芽孢杆菌(菌种编号:GIM 1. 136,来源于广东省微生物菌种保藏中 心)和大肠杆菌(Escherichia coli,菌种编号:GIM 1. 137,来源于广东省微生物菌种保藏 中心)为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0051] (1)枯草芽孢杆菌悬液的制备
[0052] 将枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠 5g,pH 7. 4士0. 2),置于33°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件 下,5000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为 0. 2mol/L,pH 7. 6),得到浓度为1019cfu/mL的枯草芽孢杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0053] 同上方法,制备浓度为IO19CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0054] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0055] 在磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.6)中加入步骤(1)制备的大 肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCCNO :M 208012)斑,然后将此培养液在30°C培养48h,再在4°C,5000rpm离心35min,保 留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,13000rpm离心30min,保留沉淀弃去上清液,沉淀 为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸钠钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0056] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0057] 在DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的 2.5%,装入发酵罐,1211:灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤
(1)制备的枯草芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发酵培养基 中的枯草芽孢杆菌的起始浓度为1012cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发 酵各参数条件如下:温度控制在28°C ;加入枯草芽孢杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的 发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制 在28% ;培养过程中加两次枯草芽孢杆菌悬浮液,每次加入枯草芽孢杆菌悬浮液的间隔时 间15h,每次加入枯草芽孢杆菌悬浮液的量以新加入的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中的浓 度为IO12CfuAiL为准,发酵培养48h即制成浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂A。
[0058] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤
(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0059] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等 致病菌均有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,菌株编号:GIM1. 237,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阳 性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,菌株编号:GIM1. 142,来源于广东省微生物 菌种保藏中心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液,分别加入常规培 养方法得到鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的菌体沉淀,每种菌各有两瓶。调节4瓶缓 冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)。在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入 蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有金黄色葡萄球菌的缓冲体系中, 分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B lmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在Oh、 6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h这九个时刻分别取样,按10—1〜10—11的稀释倍数进行稀 释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图1所示。从图1可知,与用大肠杆菌发酵得到的蛭弧菌制剂B相比,用枯草芽孢杆 菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对 革兰氏为阳性的金黄色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B好。另外,由枯草芽孢杆菌 制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、 蛭质体制剂。
[0060] 实施例2
[0061] 以纳豆芽孢杆菌(菌种编号:CGMCC 1. 1086,来源于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如 下:
[0062] (1)纳豆芽孢杆菌悬液的制备
[0063] 将纳豆芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于35°C摇床中培养15h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 6000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. Imol/ L,pH 7. 4),得到浓度为IO18CfuAiL的纳豆芽孢杆菌悬浮液,然后置于2°C冰箱中保存备用;
[0064] 同上方法,制备浓度为IO18CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于2°C冰箱中保存备用;
[0065] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0066] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. lmol/L, pH 7.4)中加入步骤(1)制备的大肠 杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1013cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDF02(于 2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M208009)斑,然后将此培养液在30°C培养45h,再在4°C,6000rpm离心25min,保 留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,HOOOrpm离心28min,保留沉淀弃去上清液,沉淀 为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体 的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0067] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0068] 将DNB液体培养基装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发 酵培养基中加入步骤(1)制备的纳豆芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游 泳体浓缩液,发酵培养基中的纳豆芽孢杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为 102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在29°C;加入纳豆芽孢杆菌悬浮液和 蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 4;设置搅拌转速与溶氧 联动,使溶氧水平控制在28% ;培养过程中加两次纳豆芽孢杆菌悬浮液,每次加入纳豆芽孢 杆菌悬浮液的间隔时间16h,每次加入纳豆芽孢杆菌悬浮液的量为以新加入的纳豆芽孢杆 菌在发酵培养基中的浓度为IO13CfuAiL为准,发酵培养45h即制成浓度为lXliTpfu/mL的 蛭弧菌制剂A。
9[0069] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 1010pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0070] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌等 致病菌都有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌(Listeria monocytohenes,菌株编号:GIM1. 228,来源于广东省微生物菌种保藏中心)的裂解和对革 兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella enterica,菌株编号:GIM1. 244,来源于广东省 微生物菌种保藏中心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别 加入常规培养方法得到单核增生李斯特菌和猪霍乱沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌各两瓶, 调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(lCTcfu/mL)。在两瓶含有单核增生李斯特菌的缓冲体系 中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有猪霍乱沙门氏菌 的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B Im,于30°C,200rpm的摇床上 培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这八个时刻分别取样,按10-1〜10,的稀释倍 数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落 数。实验结果如图2所示。从图2可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用纳豆芽 孢杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍乱沙门氏菌有更强的裂解效果,而 且对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由纳豆 芽孢杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯 的游泳体、蛭质体制剂。
[0071] 实施例3
[0072] 分别以两歧双歧杆菌(菌种编号:GIM 1. 169,来源于广东省微生物菌种保藏中 心)和鼠伤寒沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0073] (1)两歧双歧杆菌悬液的制备
[0074] 将两歧双歧杆菌接种于PTYG培养基中,置于37°C摇床中培养24h,使其处于对数 生长期,培养液在8°C条件下,7000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷 酸钾盐缓冲液(浓度为0. 3mol/L,pH 7. 5),得到浓度为1022cfu/mL的两歧双歧杆菌悬浮液, 然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0075] 同上方法,用营养肉汤培养基制备浓度为IO22CfuAiL的鼠伤寒沙门氏菌悬液,置 于8°C冰箱中保存备用;
[0076] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0077] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 3mol/L, pH 7. 5)中加入步骤(1)制备的鼠伤寒沙 门氏菌悬浮液,调整鼠伤寒沙门氏菌的浓度为101(lCfU/mL,再接入用常规方法(根据申请号 为200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具 体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠 杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2, 琼脂粉3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母 精提物0. lg,蒸馏水lOOOmL,pH7.2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培 养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧菌 BDS02 (于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏 编号为CCTCC NO =M 209170)斑,然后将此培养液在30°C培养50h,再在8°C,7000rpm离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在8°C,16000rpm离心20min,保留沉淀弃去上 清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 3mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧 菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,置于15°C冰箱保存备用;
[0078] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0079] 在DNB液体培养基加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的 0.7%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤 (1)制备的两歧双歧杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,发酵培养基 中的两歧双歧杆菌的起始浓度为1015cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵;发 酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入两歧双歧杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的 发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制 在22% ;培养过程中加一次两歧双歧杆菌悬浮液,每次加入两歧双歧杆菌悬浮液的间隔时 间12h,每次加入两歧双歧杆菌悬浮液的量以新加入的两歧双歧杆菌在发酵培养基中的浓 度为1015Cfu/mL为准,发酵培养36h即制成浓度为5X IO11PfuAiL的蛭弧菌制剂A。
[0080] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液和 步骤(2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,制得浓度为5 X IO11PfuAiL的蛭弧菌制剂B。
[0081] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对乳房链球菌、沙门氏菌、猪链球菌等致病菌 均有裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的猪链球菌II型(Str印tococcus suis,菌株编 号:CVCC 3306,来源于国家兽医微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阳性的乳房链球菌 (Streptococcus uberis,菌株编号:700407,来源于上海三踏科技有限公司)的裂解为例。 配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别加入常规培养方法得到猪链球菌II型 和乳房链球菌的菌体沉淀,每种菌各两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)。 在两瓶含有猪链球菌II型的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL ;同样,在两瓶含有乳房链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌 制剂 B ImL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 这九 个时刻分别取样,按10—1〜10—11的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平 板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图3所示。从图3可知,与用鼠 伤寒沙门氏菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用两歧双歧杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰 氏为阴性的猪链球菌II型有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解 效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由两歧双歧杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制 成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0082] 实施例4
[0083] 分别以粪肠球菌(Enterococcus faecal is,菌种编号:CGMCC 1.131,来源于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)和猪霍乱沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制 剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0084] (1)粪肠球菌悬液的制备
[0085] 将粪肠球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH 7. 4士0. 2)中,置于30°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 4),得到浓度为102°cfu/mL的粪肠球菌悬浮液,然后置于2〜4°C冰箱中保存备用;
11[0086] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪霍乱沙门氏菌悬液,置于2〜4°C冰箱中保 存备用;
[0087] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0088] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙 门氏菌悬浮液,调整猪霍乱沙门氏菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号 为200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具 体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠 杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2, 琼脂粉3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵 母精提物0. lg,蒸馏水lOOOmL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温 培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧 菌BDFM05(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心, 保藏编号为CCTCC NO =M 209172)斑,然后将此培养液在30°C培养38h,再在4°C,6000rpm 离心20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,15000rpm离心22min,保留沉淀弃 去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸钠盐缓冲液,调整 蛭弧菌游泳体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备 用;
[0089] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0090] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L,pH 7. 6),装入发酵罐,121°C灭菌20min,得 到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的粪肠球菌悬浮液和步骤(2)制 备的蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,发酵培养基中的粪肠球菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭 弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C;加入粪肠球 菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 2 ;设置搅拌 转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在30% ;培养过程中加两次粪肠球菌悬浮液,每次加入粪 肠球菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入粪肠球菌悬浮液的量以新加入的粪肠球菌在发酵 培养基中的浓度为IO14CfuAiL为准,发酵培养48h即制成浓度为5 X 1010pfu/mL的蛭弧菌制 剂A。
[0091] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液和 步骤(2)制备的蛭弧菌BDFM05游泳体浓缩液,制得浓度为5X liTpfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0092] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分别以对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus印idermidis,菌株 编号:GIM1. 143,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阴性的大肠杆菌的裂 解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到表皮 葡萄球菌和大肠杆菌的菌体沉淀,每种菌两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO12Cfu/ mL)。在两瓶含有表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL ;同样,在两瓶含有大肠杆菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 Oh、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 这九个时刻 分别取样,按10—1〜10_12的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布, 30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图4所示。从图4可知,与用猪霍乱沙门氏菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用粪肠球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大 肠杆菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制 剂B更好。另外,由粪肠球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步 的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0093] 实施例5
[0094] 分别以保加利亚乳杆菌(菌种编号:GIM 1. 80,来源于广东省微生物菌种保藏中 心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0095] (1)保加利亚乳杆菌悬液的制备
[0096] 将保加利亚乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7.4 士 0.2)中,置于37°C摇床中培养20h,使其处于对数生长期,培养液在10°C条件下, 6000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 3mol/ L,pH 7. 3),得到浓度为IO17CfuAiL的保加利亚乳杆菌悬浮液,然后置于2〜4°C冰箱中保 存备用;
[0097] 同上的方法,制备浓度为IO17CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于2〜4°C冰箱中保存备 用;
[0098] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0099] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.3mol/L,pH 7.3)中加入步骤⑴制备的大肠 杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1013cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 208012)斑,然后将此培养液在30°C培养40h,再在10°C,6000rpm离心25min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在15°C,15000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液, 沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 3mol/L、pH 7. 3的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游 泳体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0100] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0101] 在蒸馏水中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为蒸馏水体积的2.8%,装入发酵罐, 121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的保加利亚 乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发酵培养基中的保加利亚乳 杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为10pfU/mL,进行发酵;发酵各参数条件如 下:温度控制在28°C ;加入保加利亚乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在 发酵过程中的PH值控制在7. 6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在21% ;培养 过程中加2次保加利亚乳杆菌悬浮液,每次加入保加利亚乳杆菌悬浮液的间隔时间18h,每 次加入保加利亚乳杆菌悬浮液的量以新加入的保加利亚乳杆菌在发酵培养基中的浓度为 1013Cfu/mL为准,发酵培养40h即制成浓度为1 X IO11PfuAiL的蛭弧菌制剂A。[0102] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为1 X IOllPfuAiL的蛭弧菌制剂B。
[0103] 本制剂对气单胞菌、沙门氏菌、类马链球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分别以 对革兰氏为阳性的类马链球菌(Str印tococcus equinus,菌株编号:cvcc 1925,来源于国 家兽医微生物菌种保藏中心)和对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶 各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到类马链球菌和鼠伤寒 沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌两瓶,调节两瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)t5在两瓶 含有类马链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样, 在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL菌,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分 别取样,按10—1〜10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布, 30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图5所示。从图5可知,与用大肠杆菌发 酵的蛭弧菌制剂B相比,用保加利亚乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠 伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的类马链球菌类马链球菌裂解效果 也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由保加利亚乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成 制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0104] 实施例6
[0105] 分别以乳酸片球菌(菌种编号:GIM 1. 263,来源于广东省微生物菌种保藏中心) 和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,菌种编号:GIM 1. 172,来源于广东省微生物菌种 保藏中心)为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0106] (1)乳酸片球菌悬液的制备
[0107] 将乳酸片球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于30°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在5°C条件下, 7000rpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. Imol/ L,pH 7. 4),得到浓度为IO22CfuAiL的乳酸片球菌悬浮液,然后置于15°C冰箱中保存备用;
[0108] 同上方法,制备浓度为IO22CfuAiL的嗜水气单胞菌悬液,置于15°C冰箱中保存备 用;
[0109] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0110] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步骤(1)制备的嗜水气单 胞菌悬浮液,调整嗜水气单胞菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000!^4!17.2,琼脂粉170中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDF03(于 2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 208010)斑,然后将此培养液在30°C培养54h,再在5°C,7000rpm离心20min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在5°C,15000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉
14淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液,置于10°C冰箱保存备用;
[0111] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0112] 将蒸馏水装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤(1)制备的乳酸片球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液, 发酵培养基中的乳酸片球菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为10pfU/mL,进行 发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸片球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓 缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 4 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水 平控制在24% ;培养过程中加两次乳酸片球菌悬浮液,每次加入乳酸片球菌悬浮液的间隔 时间15h,每次加入乳酸片球菌悬浮液的量以新加入的乳酸片球菌在发酵培养基中的浓度 为1014cfu/mL,发酵培养45h即制成浓度为5 X IO8的蛭弧菌制剂A。
[0113] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液和步 骤(2)制备的蛭弧菌BDF03游泳体浓缩液,制得浓度为5 X IO8的蛭弧菌制剂B。
[0114] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、乳房链球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分别以对乳房链球菌和大肠杆菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的 磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到乳房链球菌和大肠杆菌的菌体沉淀, 每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(lCTcfu/mL)。在两瓶含有乳房链球菌的缓冲 体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有大肠杆菌的 缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于30°C,200rpm的摇床上 培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811这九个时刻分别取样,按10-1 〜10,的稀 释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算 菌落数。实验结果如图6所示。从图6可知,与用嗜水气单胞菌发酵的蛭弧菌制剂B相比, 用乳酸片球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大肠杆菌有更强的裂解效果,而 且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由乳酸片球菌 制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、 蛭质体制剂。
[0115] 实施例7
[0116] 分别以乳酸链球菌(菌种编号:GIM 1. 156,来源于广东省微生物菌种保藏中心) 和猪链球菌II型为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0117] (1)乳酸链球菌悬液的制备
[0118] 将乳酸链球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于37°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 6000rpm离心27min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 5),得到浓度为102°cfu/mL的乳酸链球菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0119] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪链球菌II型悬液,置于4°C冰箱中保存备 用;
[0120] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0121] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步骤(1)制备的猪链球菌 II型悬浮液,调整猪链球菌II型的浓度为1015cfU/mL,再接入用常规方法(根据申请号为
15200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离土壤的蛭弧菌BDSM08(于 2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 209171)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心20min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,16000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉 淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0122] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0123] 在pH值为7. 2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培 养基体积的1.5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤(1)制备的乳酸链球菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液, 发酵培养基中的乳酸链球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行 发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸链球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓 缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 5 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水 平控制在27% ;培养过程中加2次乳酸链球菌悬浮液,每次加入乳酸链球菌悬浮液的间隔 时间14h,每次加入乳酸链球菌悬浮液的量以新加入的乳酸链球菌在发酵培养基中的浓度 为1013Cfu/mL为准,发酵培养42h即制成浓度为5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0124] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液和步 骤(2)制备的蛭弧菌BDSM08游泳体浓缩液,制得浓度为5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂B。
[0125] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分别以对猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL 的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到猪霍乱沙门氏菌和表皮葡萄球菌的 菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IOltlCfuAiL)。在两瓶含有猪霍 乱沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两 瓶含有表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B lmL,于 30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h这九个时刻分别取 样,按10—1〜IO-"1的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C 条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图7所示。从图7可知,与用猪链球菌II型 发酵的蛭弧菌制剂B相比,用乳酸链球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍 乱沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧 菌制剂B更好。另外,由乳酸链球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过 进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0126] 实施例8
[0127] 分别以屎肠球菌(菌种编号:CGMCC 1. 2136,来源于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0128] (1)屎肠球菌悬液的制备
[0129] 将屎肠球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH 7. 4士0. 2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 5),得到浓度为IO18CfuAiL的屎肠球菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0130] 同上方法,制备浓度为IO18CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0131] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0132] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.5)中加入步骤⑴制备的大肠 杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 208012)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心20min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,16000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉 淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为106pfu/mL,得到蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0133] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0134] 在pH值为7. 2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培 养基体积的2. 7%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤⑴制备的屎肠球菌悬浮液和步骤⑵制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,发 酵培养基中的屎肠球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行发酵; 发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入屎肠球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发 酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 3 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在 26% ;培养过程中加两次屎肠球菌悬浮液,每次加入屎肠球菌悬浮液的间隔时间14h,每次 加入屎肠球菌悬浮液的量以新加入的屎肠球菌在发酵培养基中的浓度为IO13CfuAiL为准, 发酵培养42h即制成浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂A。
[0135] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDJ02游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0136] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌等致病 菌均有裂解效果。分别以对单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各 装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到单核增生李斯特菌和鼠 伤寒沙门氏菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)t5在 两瓶含有单核增生李斯特菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL ;同样,在两瓶含有鼠伤寒沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭
17弧菌制剂 B ImL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h 这八 个时刻分别取样,按10—1〜10—11的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平 板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图8所示。从图8可知,与用大 肠杆菌发酵的蛭弧菌制剂B相比,用屎肠球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的 鼠伤寒沙门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的单核增生李斯特菌的裂解效果 也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由屎肠球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也 可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0137] 实施例9
[0138] 分别以地衣芽孢杆菌(菌种编号:GIM1. 182,来源于广东省微生物菌种保藏中心) 和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0139] (1)地衣芽孢杆菌悬液的制备
[0140] 将地衣芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠 5g,pH 7. 4士0. 2),置于33°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件 下,5000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为 0. 2mol/L,pH 7. 6),得到浓度为1019cfu/mL的地衣芽孢杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保 存备用;
[0141] 同上方法,制备浓度为IO19CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于4°C冰箱中保存备用;
[0142] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0143] 在磷酸钠钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.6)中加入步骤⑴制备的大 肠杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDMOl (于 2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCCNO :M 208066)斑,然后将此培养液在30°C培养48h,再在4°C,5000rpm离心30min,保 留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,13000rpm离心30min,保留沉淀弃去上清液,沉淀 为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸钠钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0144] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0145] 在DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培养基体积的 3.0%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤 (1)制备的地衣芽孢杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,发酵培养基 中的地衣芽孢杆菌的起始浓度为1012cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发 酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入地衣芽孢杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的 发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制 在28% ;培养过程中加两次地衣芽孢杆菌悬浮液,每次加入地衣芽孢杆菌悬浮液的间隔时
18间15h,每次加入地衣芽孢杆菌悬浮液的量以新加入的地衣芽孢杆菌在发酵培养基中的浓 度为IO12CfuAiL为准,发酵培养48h即制成浓度为1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌制剂A。
[0146] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDMOl游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0147] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌 均有很好的裂解效果。分别以对革兰氏为阴性的嗜水气单胞菌和对革兰氏为阳性的类马链 球菌(Sti^ptococcus equinus,菌株编号:CVCC 1925,来源于国家兽医微生物菌种保藏中 心)的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷酸钠钾盐缓冲液,分别加入常规培养方法得到 嗜水气单胞菌和类马链球菌的菌体沉淀,每种菌各有两瓶。调节4瓶缓冲液的菌体浓度一 致(liTcfu/mL)。在两瓶含有嗜水气单胞菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和 蛭弧菌制剂B ImL ;同样,在两瓶含有类马链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL 和蛭弧菌制剂 BlmL,于 30°C,200rpm 的摇床上培养。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、 42h、48h这九个时刻分别取样,按10—1〜10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释 液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图9所示。从图9 可知,与用大肠杆菌发酵得到的蛭弧菌制剂B相比,用地衣芽孢杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不 仅对革兰氏为阴性的嗜水气单胞菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的类马链球菌 的裂解效果也比蛭弧菌制剂B好。另外,由地衣芽孢杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直 接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0148] 实施例10
[0149] 分别以嗜酸乳杆菌(菌种编号:GIM1. 208,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和 大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0150] (1)嗜酸乳杆菌的制备
[0151] 将嗜酸乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 5),得到浓度为IO17CfuAiL的嗜酸乳杆菌悬浮液,然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0152] 同上方法,制备浓度为IO17CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于8°C冰箱中保存备用;
[0153] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0154] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.5)中加入步骤⑴制备的大肠 杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆 菌悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼 脂粉3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. 8g,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母 精提物0. lg,蒸馏水lOOOmL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培 养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自土壤的蛭弧菌 BDS02 (于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏 编号为CCTCC NO =M 209170)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在4°C,6000rpm离心 20min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在15°C,13000rpm离心20min,保留沉淀弃去上
19清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧 菌游泳体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,置于6°C冰箱保存备用;
[0155] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0156] 将pH值为7. 2的DNB液体培养基中装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养 基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜酸乳杆菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧 菌BDS02游泳体浓缩液,发酵培养基中的嗜酸乳杆菌的起始浓度为101(lCfU/mL,蛭弧菌起始 浓度为10pfU/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入嗜酸乳杆菌悬浮 液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 5 ;设置搅拌转速与 溶氧联动,使溶氧水平控制在20% ;培养过程中加两次嗜酸乳杆菌悬浮液,每次加入嗜酸乳 杆菌悬浮液的间隔时间14h,每次加入嗜酸乳杆菌悬浮液的量以新加入的嗜酸乳杆菌在发 酵培养基中的浓度为IO13CfuAiL为准,发酵培养42h即制成浓度为1 X 108pfU/mL的蛭弧菌 制剂A。
[0157] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDS02游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 108pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0158] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌 均有裂解效果。分别以对金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有 50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门 氏菌的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)t5在两瓶含有 金黄色葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样, 在两瓶含有猪霍乱沙门氏菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B lmL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分别 取样,按10—1〜10—11的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,300C 条件下培养24h后,计算菌落数。实验结果如图11所示。从图11可知,与用大肠杆菌发酵 的蛭弧菌制剂B相比,用嗜酸乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪霍乱沙 门氏菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的金黄色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌 制剂B更好。另外,由嗜酸乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进 一步的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0159] 实施例11
[0160] 分别以干酪乳杆菌(菌种编号:GIM1. 159,来源于广东省微生物菌种保藏中心)和 嗜水气单胞菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0161] (1)干酪乳杆菌的制备
[0162] 将干酪乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于30°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在5°C条件下, SOOOrpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. Imol/ L,pH 7. 4),得到浓度为IO22CfuAiL的干酪乳杆菌悬浮液,然后置于15°C冰箱中保存备用;
[0163] 同上方法,制备浓度为IO22CfuAiL的嗜水气单胞菌悬液,置于15°C冰箱中保存备 用;
[0164] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0165] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液,调整嗜水气单胞菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000!^4!17.2,琼脂粉170中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧菌BDF02(于 2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 208009)斑,然后将此培养液在30°C培养54h,再在5°C,7000rpm离心20min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在5°C,20000rpm离心15min,保留沉淀弃去上清液,沉 淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸钠盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为107pfu/mL,得到蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,置于2°C冰箱保存备用;
[0166] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0167] 将蒸馏水装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤⑴制备的干酪乳杆菌悬浮液和步骤⑵制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液, 发酵培养基中的干酪乳杆菌的起始浓度为1014cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行 发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在29°C ;加入干酪乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓 缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 2 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水 平控制在30% ;培养过程中加两次干酪乳杆菌悬浮液,每次加入干酪乳杆菌悬浮液的间隔 时间15h,每次加入干酪乳杆菌悬浮液的量以新加入的干酪乳杆菌在发酵培养基中的浓度 为IO14CfuAiL为准,发酵培养45h即制成浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂A。
[0168] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的嗜水气单胞菌悬浮液和步 骤(2)制备的蛭弧菌BDF02游泳体浓缩液,制得浓度为IX 109pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0169] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、类马链球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分别以对类马链球菌和大肠杆菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的 磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到类马链球菌和大肠杆菌的菌体沉淀, 每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(1012cfU/mL)。在两瓶含有类马链球菌的缓 冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有大肠杆菌 的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于30°C,200rpm的摇床 上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这八个时刻分别取样,按10-1〜10_12的稀释 倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后,计算菌 落数。实验结果如图12所示。从图12可知,与用嗜水气单胞菌发酵的蛭弧菌制剂B相比, 用干酪乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的大肠杆菌有更强的裂解效果,而 且对革兰氏为阳性的类马链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另外,由干酪乳杆菌 制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制成单纯的游泳体、 蛭质体制剂。
[0170] 实施例12
[0171] 分别以乳酸乳杆菌(菌种编号:ATCC12315,来源于American Type Culture Collection)和猪链球菌II型为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:[0172] (1)乳酸乳杆菌悬液的制备
[0173] 将乳酸乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于37°C摇床中培养18h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 5),得到浓度为102°cfu/mL的乳酸乳杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0174] 同上方法,制备浓度为102°cfu/mL的猪链球菌II型悬液,置于4°C冰箱中保存备 用;
[0175] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0176] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步骤(1)制备的猪链球菌 II型悬浮液,调整猪链球菌II型的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑。)培养出来的分离土壤的蛭弧菌BDSOl (于 2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 209169)斑,然后将此培养液在40°C培养20h,再在4°C,6000rpm离心20min, 保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,12000rpm离心40min,保留沉淀弃去上清液,沉 淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳 体的浓度为108pfu/mL,得到蛭弧菌BDSOl游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0177] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0178] 在pH值为7. 2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培 养基体积的0. 5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤⑴制备的乳酸乳杆菌悬浮液和步骤⑵制备的蛭弧菌BDSOl游泳体浓缩液, 发酵培养基中的乳酸乳杆菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行 发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入乳酸乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓 缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 2〜7. 6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使 溶氧水平控制在23% ;培养过程中加1次乳酸乳杆菌悬浮液,每次加入乳酸乳杆菌悬浮液 的间隔时间18h,每次加入乳酸乳杆菌悬浮液的量以新加入的乳酸乳杆菌在发酵培养基中 的浓度为IO13CfuAiL为准,发酵培养42h即制成浓度为5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制剂A。
[0179] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪链球菌II型悬浮液和步 骤(2)制备的蛭弧菌BDSOl游泳体浓缩液,制得浓度为5 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0180] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对气单胞菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分别以对嗜水气单胞菌和表皮葡萄球菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL 的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到嗜水气单胞菌和表皮葡萄球菌的菌 体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IO11CfuAiL)tj在两瓶含有嗜水气单 胞菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有 表皮葡萄球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h这九个时刻分别取样,按 ΙΟ"1〜10—11的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下 培养24h后,计算菌落数。实验结果如图13所示。从图13可知,与用猪链球菌II型发酵 的蛭弧菌制剂B相比,用乳酸乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的嗜水气单 胞菌有更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂 B更好。另外,由乳酸乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步 的离心,制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0181] 实施例13
[0182] 分别以植物乳杆菌(菌种编号:GIM 1. 140,来源于广东省微生物菌种保藏中心) 和猪霍乱沙门氏菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程如下:
[0183] (1)植物乳杆菌的制备
[0184] 将植物乳杆菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于30°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在8°C条件下, 6000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 4),得到浓度为102°cfu/mL的植物乳杆菌悬浮液,然后置于4°C冰箱中保存备用;
[0185] 同上方法,制备的浓度为102°cfu/mL猪霍乱沙门氏菌悬液,置于4°C冰箱中保存备 用;
[0186] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0187] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙 门氏菌悬浮液,调整猪霍乱沙门氏菌的浓度为1012cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号 为200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具 体为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠 杆菌悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2, 琼脂粉3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵 母精提物0. lg,蒸馏水lOOOmL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温 培养箱中培养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自淡水的蛭弧 菌BDF01 (于2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心, 保藏编号为CCTCC NO =M 208008)斑,然后将此培养液在30°C培养20h,再在2°C,8000rpm 离心15min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,15000rpm离心22min,保留沉淀弃 去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸钠盐缓冲液,调整 蛭弧菌游泳体的浓度为106pfu/mL,得到蛭弧菌BDF01游泳体浓缩液,置于15°C冰箱保存备 用;
[0188] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0189] 在磷酸钠盐缓冲液(浓度为0. 2mol/L,pH 7. 6),装入发酵罐,121°C灭菌20min,得 到发酵培养基;在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的植物乳杆菌悬浮液和步骤(2) 制备的蛭弧菌BDF01游泳体浓缩液,发酵培养基中的植物乳杆菌的起始浓度为101(lCfU/mL, 蛭弧菌起始浓度为102pfu/mL,进行发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C;加入植物 乳杆菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 4;设置 搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在30% ;培养过程中加两次植物乳杆菌悬浮液,每次
23加入植物乳杆菌悬浮液的间隔时间18h,每次加入植物乳杆菌悬浮液的量以新加入的植物 乳杆菌在发酵培养基中的浓度为101QCfU/mL为准,发酵培养48h即制成浓度为5 X101Qpfu/ mL的蛭弧菌制剂A。
[0190] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的猪霍乱沙门氏菌悬浮液和 步骤(2)制备的蛭弧菌BDFOl游泳体浓缩液,制得浓度为5 X IOuiPfuAiL的蛭弧菌制剂B。
[0191] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对大肠杆菌、沙门氏菌、无乳链球菌等致病菌均有 裂解效果。分别以对无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的裂解为例。配备4瓶各装有50mL的磷 酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到无乳链球菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌体沉 淀,每种菌两瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(liTcfu/mL)。在两瓶含有无乳链球菌的 缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶含有鼠伤寒沙 门氏菌的缓冲体系中,分别加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于30°C,200rpm的 摇床上培养。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211这九八个时刻分别取样,按10-1〜IO-10 的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下培养24h后, 计算菌落数。实验结果如图14所示。从图14可知,与用猪霍乱沙门氏菌发酵的蛭弧菌制 剂B相比,用植物乳杆菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的鼠伤寒沙门氏菌有更 强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的无乳链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。另 外,由植物乳杆菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心,制 成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0192] 实施例14
[0193] 分别以戊糖片球菌(菌种编号:CGMCC 1. 2695,来源于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心)和大肠杆菌为宿主菌制备蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B,具体过程 如下:
[0194] (1)戊糖片球菌的制备
[0195] 将戊糖片球菌接种于营养肉汤培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g, PH 7. 4士0.2)中,置于32°C摇床中培养24h,使其处于对数生长期,培养液在4°C条件下, 5000rpm离心20min,保留沉淀弃去上清液,往沉淀中加入磷酸钾盐缓冲液(浓度为0. 2mol/ L,pH 7. 5),得到浓度为IO18CfuAiL的戊糖片球菌悬浮液,然后置于8°C冰箱中保存备用;
[0196] 同上方法,制备浓度为IO18CfuAiL的大肠杆菌悬液,置于8°C冰箱中保存备用;
[0197] (2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:
[0198] 在磷酸钾盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH 7.5)中加入步骤⑴制备的大肠 杆菌悬浮液,调整大肠杆菌的浓度为1015cfu/mL,再接入用常规方法(根据申请号为 200910042274. 6,名称为“一种防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用”的专利申请,具体 为采用Stolp和Petzhold的双层平板法:取0. 5mL蛭弧菌游泳体浓缩液和0. 5mL大肠杆菌 悬浮液混合,此混合液再与3-3. 5mL 50°C的DNB上层培养基(蒸馏水500mL,pH7. 2,琼脂粉 3. 5g)混合均勻,倾注于DNB下层平板(营养肉汤0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g,酵母精提物 0. lg,蒸馏水1000mL,pH7. 2,琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28°C恒温培养箱中培 养,待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑)培养出来的分离自海水的蛭弧菌BDJOl (于 2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M208011)斑,然后将此培养液在30°C培养60h,再在8°C,5000rpm离心30min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在4°C,16000rpm离心25min,保留沉淀弃去上清液,沉淀 为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸钾盐缓冲液,调整蛭弧菌游泳体 的浓度为109pfu/mL,得到蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液,置于4°C冰箱保存备用;
[0199] (3)蛭弧菌制剂的制备
[0200] 在pH值为7. 2的DNB液体培养基中加入氯化钠,氯化钠的加入质量为DNB液体培 养基体积的2. 5%,装入发酵罐,121°C灭菌20min,得到发酵培养基;在30°C的发酵培养基 中加入步骤⑴制备的戊糖片球菌悬浮液和步骤⑵制备的蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液, 发酵培养基中的戊糖片球菌的起始浓度为1013cfu/mL,蛭弧菌起始浓度为103pfu/mL,进行 发酵;发酵各参数条件如下:温度控制在30°C ;加入戊糖片球菌悬浮液和蛭弧菌游泳体浓 缩液的发酵培养基在发酵过程中的PH值控制在7. 6 ;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水 平控制在25% ;培养过程中加3次戊糖片球菌悬浮液,每次加入戊糖片球菌悬浮液的间隔 时间12h,每次加入戊糖片球菌悬浮液的量以新加入的戊糖片球菌在发酵培养基中的浓度 为IO13CfuAiL为准,发酵培养48h即制成浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂A。
[0201] 同样方法,在30°C的发酵培养基中加入步骤(1)制备的大肠杆菌悬浮液和步骤 (2)制备的蛭弧菌BDJOl游泳体浓缩液,制得浓度为1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制剂B。
[0202] 本蛭弧菌制剂A和蛭弧菌制剂B对乳房链球菌、沙门氏菌、猪链球菌II型等致病 菌均有裂解效果。分别以对乳房链球菌和猪链球菌II型的裂解为例。配备4瓶各装有 50mL的磷酸钠钾盐缓冲液中,分别各加入常规培养方法得到乳房链球菌和猪链球菌II型 的菌体沉淀,每种菌2瓶,调节4瓶缓冲液的菌体浓度一致(IOltlCfuAiL)。在两瓶含有乳 房链球菌的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL;同样,在两瓶 含有猪链球菌II型的缓冲体系中,分别各加入蛭弧菌制剂A ImL和蛭弧菌制剂B ImL,于 30°C,200rpm的摇床上培养。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h这八个时刻分别取样,按 ΙΟ"1〜10,的稀释倍数进行稀释,再各取100 μ L的稀释液分别进行平板涂布,30°C条件下 培养24h后,计算菌落数。实验结果如图15所示。从图15可知,与用大肠杆菌发酵的蛭弧 菌制剂B相比,用戊糖片球菌发酵的蛭弧菌制剂A不仅对革兰氏为阴性的猪链球菌II型有 更强的裂解效果,而且对革兰氏为阳性的乳房链球菌的裂解效果也比蛭弧菌制剂B更好。 另外,由戊糖片球菌制得的蛭弧菌制剂A不仅可以直接制成制剂,也可通过进一步的离心, 制成单纯的游泳体、蛭质体制剂。
[0203] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化, 均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于包括以下步骤:(1)宿主菌悬液的制备:将宿主菌培养至对数生长期,收集菌体,用磷酸盐缓冲液调整浓度,得到浓度为1017~1022cfu/mL的宿主菌悬浮液,然后置于2~15℃中保存备用;(2)蛭弧菌游泳体浓缩液的制备:在磷酸盐缓冲液中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液,调整宿主菌的浓度为1010~1015cfu/mL,再接入蛭弧菌斑,然后将此培养液在20~40℃培养20~60h,再在2~15℃,5000~8000rpm离心15~35min,保留上清液弃去沉淀,然后将上清液在2~15℃,12000~20000rpm离心15~40min,保留沉淀弃去上清液,沉淀为蛭弧菌游泳体,在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为106~109pfu/mL,得到蛭弧菌游泳体浓缩液,置于2~15℃保存备用;(3)蛭弧菌制剂的制备:将氯化钠溶于溶剂中形成质量体积比浓度为0~30g/L的氯化钠溶液,灭菌,得到发酵培养基;在发酵培养基中加入步骤(1)制备的宿主菌悬浮液和步骤(2)制备的蛭弧菌游泳体浓缩液,使宿主菌起始浓度为1010~1015cfu/mL,蛭弧菌游泳体起始浓度为101~103pfu/mL,进行发酵;发酵温度控制在28~30℃,pH值控制在7.2~7.6;设置搅拌转速与溶氧联动,使溶氧水平控制在20%~30%;发酵过程中加1~3次宿主菌悬浮液,每次加入宿主菌悬浮液的间隔时间12~18h,每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发酵培养基中的浓度为1010~1015cfu/mL为准;发酵培养36~48h即制成蛭弧菌制剂;所述溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。
  2. 2.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(1)所述宿 主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)、两歧双歧 杆菌(Bifidobacterium bifidum)、獎肠球菌(Enterococcus faecalis)、{呆;!j口禾亚杆 菌(Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcusacidilactici) >lif (Streptococcus lactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus pi ant arum)或 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus);步骤(2)所述蛭弧菌为 BDF01、BDF02、BDF03、BDJ01、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。
  3. 3.根据权利要求2所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:所述BDF01于 2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO :M 208008 ;所述BDF02于2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国 典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208009 ;所述BDF03于2008年1月13日保 藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208010 ; 所述BDJ01于2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心, 保藏编号为CCTCC NO :M 208011 ;所述BDJ02于2008年1月14日保藏于中国武汉市武汉 大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 208012 ;所述BDM01于2008 年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO :M 208066 ;所述BDS01于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培 养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 209169 ;所述BDS02于2009年8月7日保藏于中 国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 209170;所述 BDSM08于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏 编号为CCTCC NO :M 209171 ;所述BDFM05于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学 内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO :M 209172。
  4. 4.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(1)所述 收集菌体的方式为通过离心分离得到,离心条件为2〜15°C,5000〜8000rpm离心15〜 35min ;所述宿主菌悬浮液的浓度为1017〜1022cfu/mL ;步骤(1)〜(3)任一项所述磷酸盐 缓冲液的浓度为0. 1〜0. 3mol/L, pH为7. 2〜7. 6 ;步骤(2)所述蛭弧菌游泳体浓缩液的 浓度为 108 〜1012pfu/mL。
  5. 5.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(3)所述蛭 弧菌来源于咸水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水,所述氯化钠溶液的质量体 积比浓度为25〜30g/L。
  6. 6.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(3)所述蛭 弧菌来源于咸淡水环境时,所述溶剂为DNB液体培养基或蒸馏水,所述氯化钠溶液的质量 体积比浓度为5〜10g/L。
  7. 7.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(3)所述蛭 弧菌来源于淡水环境时,不加氯化钠。
  8. 8.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法,其特征在于:步骤(3)所述灭 菌的条件为121°C灭菌20min ;所述蛭弧菌制剂的浓度为108〜1012pfu/mL ;所述DNB液体培 养基是将营养肉汤0. 8g、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精提物0. lg溶于1000mL蒸馏水中, 调节pH值至7. 2〜7.6。
  9. 9. 一种蛭弧菌制剂,由权利要求1〜8任一项所述方法制备得到。
  10. 10.根据权利要求9所述的蛭弧菌制剂应用于制备防治病菌害药物。
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