CN111165651A

CN111165651A - 一种添加剂预混合饲料及其应用

Info

Publication number: CN111165651A
Application number: CN202010035435.5A
Authority: CN
Inventors: 陶雪莹; 魏华; 詹晖; 田林林; 杨琴; 何瑶; 裘梁
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明涉及了一种添加剂预混合饲料，属于农业微生物饲料添加剂领域。所述饲料添加剂中含有植物乳杆菌WLPL01及其发酵艾草后的培养物。植物乳杆菌WLPL01发酵培养物对大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌具有抗菌作用。本发明饲料添加剂在对动物无危害的前提下，不仅能改善饲料品质，提高饲料利用率，而且可有效的增强动物免疫力，预防鼠伤寒沙门氏菌的感染，对促进养殖业的可持续发展及保障产品质量安全具有重要意义。

Description

一种添加剂预混合饲料及其应用

技术领域

本发明涉及一种添加剂预混合饲料，属于农业微生物饲料添加剂领域。具体涉及一种由植物乳杆菌WLPL01发酵后的添加剂预混合饲料及其制备方法。

背景技术

随着科学技术的发展，养殖业越来越朝着集约化和规模化方向发展，但在其发展过程中也产生了一系列的问题，如家禽沙门氏菌感染的爆发扩散使养殖户遭受了巨大的紧急损失。而饲料添加剂的应用帮助养殖者快速高效的解决该问题，提高经济效应。饲料添加剂是一类为了满足饲养动物的需要，向饲料中添加的少量或微量的物质；具有提高饲料转化率、改善饲料的适口性和畜禽健康状况、促进动物的正常发育和生长、提高动物的繁殖力和生产性能、便于饲料的贮藏与保存以及改善饲料的加工性能等多种作用。但目前采用的添加剂多为化学合成药物、抗生素和激素，过度的使用造成了养殖动物的抗病性降低，致病菌的耐药性增强，产品中药品残留等问题，严重制约了养殖业的发展。因此开发新型无毒害、无残留的抑菌添加剂成为畜牧业进一步发展的重要课题，同时对于我国食品安全环境的建立有深远的现实影响。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)泛指产生乳酸等有机酸的细菌的总称。作为其重要组成部分，乳酸杆菌(Lactobacillus)普遍存在于乳制品、腌制肉类及酸面包等食物及工业发酵产品中，同时，也存在于在人类呼吸道、皮肤、胃肠道及泌尿系统中。而植物源乳酸菌由于其高稳定性和高活力的生物功效越来越引起人们的关注。其中，野菜中分离制备的高浓度乳酸菌菌剂能明显提高仔猪的消化率，弥补仔猪胃酸分泌不足。植物乳杆菌KCCM 11613P发酵生姜后能明显增强产品的抗氧化性。所以，从植物中筛选开发有益生功能的乳酸菌对于工业、农业、畜牧业、养殖业、环保、医学及人们的日常生活的发展和进步有重大意义。而中草药饲料添加剂由于其具有来源广，经济有效，安全低毒，耐药性不显著和功能多样性等优点，而被作为饲料添加剂的优良选择。有研究表明，在日粮中添加一定比例以白术、当归、大蒜、红辣椒、山楂、金樱子和泽泻混合的中草药饲料添加剂能够在一定程度上促进肉鸭肠道内益生菌的繁殖，改善肉鸭的生产性能。Hashemi实验发现2g/kg飞扬草添加在饲料中能减少沙门氏菌在肉用仔鸡胃肠道中的定植。由于考虑到中草药饲料添加剂和微生物饲料剂在使用中的单一性和弊端，复合型饲料添加剂越来越受到人们关注。其中，利用益生菌与草本植物的协同作用，中草药促进益生菌增值，益生菌代谢中草药使中草药内的成分由无活性的前体物质转化成具有治疗作用的有效成分，增强活性，降低副作用，改善气味，有效提高益生菌产品功能性。

借此，本发明选择植源性植物乳酸菌WLPL01发酵艾草，以结合中草药和益生菌的特异功能、功效和协同增效原理来生产复合型添加剂预混合饲料，应用于畜禽养殖，为养殖产业的健康可持续发展提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种添加剂预混合饲料，该添加剂中含有植物乳杆菌WLPL01及其发酵艾草后的混合物，经验证，此产品对大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌具有显著的抗菌作用，且可提高养殖小鼠的免疫力及其抵抗疾病的作用。

本发明的主要技术方案为：

一种添加剂预混合饲料：包含植物乳杆菌WLPL01或其发酵艾草后的培养物，所述植物乳杆菌WLPL01 Lactobacillus plantarum WLPL01已于2019年2 月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2019067。

所述添加剂预混合饲料所用材料为艾草粉末，艾草粉末经粉碎机充分粉碎、过 80目筛网和去艾绒所得，艾草粉末占发酵体系总量的10％(w/v)，葡萄糖浓度为5％(w/v)，余量为蒸馏水，植物乳杆菌WLPL01发酵初始浓度添加量为10⁷ cfu/mL。

作为优选，所述的发酵体系，发酵的条件为37℃静置7天，发酵液即为添加剂预混合饲料。

所述的添加剂预混合饲料的应用：对大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌有显著的抑制作用，可以保持鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道的完整性，缓解小鼠的炎症。

本发明的添加剂预混合饲料为由保藏编号为CCTCC NO:M 2019067的植物乳杆菌WLPL01 Lactobacillus plantarum WLPL01发酵艾草后得到的混合培养物。

本发明的植物乳杆菌WLPL01是从由秦岭艾草嫩芽自然发酵的制品中分离，通过MRS培养基经过筛选得到。

本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WLPL01：杆状，革兰氏染色阳性，兼性厌氧生长；在MRS培养基上的菌落形态为菌落乳白色，圆形，湿润，凸起，表面光滑，有光泽，边缘整齐，不透明。可利用碳水化合物产乳酸，苹果酸和乙酸等，还可产生游离氨基酸甲硫氨酸、缬氨酸和赖氨酸等。对单核增生李斯特菌和大肠杆菌等有抑制作用。

本发明的有益效果

(1)本发明的添加剂预混合饲料可有效抑制大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长，延长食品或饲料储存时间及质量。

(2)本发明的添加剂预混合饲料在对动物及人体无危害的前提下，可有效提高食物利用率，增强动物的免疫力，保护肠道屏障，预防常见致病菌——鼠伤寒沙门氏菌的侵染。

(3)本发明提供的植物乳杆菌WLPL01及其发酵艾草后的混合物可作为饲料添加剂应用于饲料和养殖业，减少或替代抗生素的使用，促进动物生产性能，提高养殖效益。

附图说明

图1：添加剂预混合饲料的抑菌作用；

图2：添加剂预混合饲料对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠体重和一般健康指数的影响；

图3：添加剂预混合饲料对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量的影响；

图4：添加剂预混合饲料对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠回肠和结肠的影响；

图5：添加剂预混合饲料对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道通透性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方法对本发明进行详细说明。

实施例1

艾草发酵液的制备

将植物乳杆菌WLPL01菌体划线于MRS琼脂板，37℃厌氧培养24-48h，挑取单菌落接种于MRS液体厌氧培养基，37℃厌氧培养16h。用1×PBS清洗菌体2次，调整菌体浓度为10⁷cfu/mL，备用。使用粉碎机充分粉碎艾草，过80 目筛网，去艾绒，取艾草粉末。将艾草末(10％)和葡萄糖(5％)混合均匀混合后并加入相应体积的蒸馏水，投入10⁷cfu/mL植物乳杆菌WLPL01，于37℃ 静置发酵7天得到发酵产品。

实施例2

艾草发酵液的抗菌活性分析

使用E.coli O157:H7 CMCC 44828、C.albicans ATCC 14053、L. monocytogenesCMCC 54007，S.aureus CMCC 26003和S.Typhimurium ATCC 13311作为指示致病菌评价发酵产品的抑菌性能。

如实施例1，制备艾草发酵液，选择发酵第0，1，3和5天的艾草发酵液为实验样品。使用80％(v/v)乙醇分别提取L.plantarum WLPL01艾草发酵液和自然艾草发酵液，40℃超声处理1h后，蒸发浓缩，冻干成固体。取1mg样品溶于1mL双蒸水并取200μL添加至牛津杯中，并以1×PBS缓冲液作为阴性对照。将培养皿放置于37℃培养箱中有氧培养12h后，测量牛津杯抑菌圈大小。

相对于自然发酵，人工接种发酵具有发酵结果可控、风险低、时间短等优点。比较了L.plantarum WLPL01发酵与自然发酵艾草抑菌能力的变化，结果如图1 所示，相对于发酵前，L.plantarum WLPL01发酵和自然发酵均能使艾草对C. albicans，L.monocytogenes和S.Typhimurium的抑菌能力显著增强。

对于C.albicans和S.Typhimurium，L.plantarum WLPL01发酵和自然发酵在第3、5天时的抑菌圈显著增加(P<0.05)，并且第3天L.plantarum WLPL01 发酵的艾草液(23.50±1.50mm)对C.albicans的抑菌效果显著强于自然发酵的 (17.25±0.75mm)；类似地，在第5天，L.plantarum WLPL01发酵(26.00±0.82 mm)后抑制S.Typhimurium的效果优于自然发酵(19.75±0.25mm)的。此外， L.plantarum WLPL01发酵的艾草液对L.monocytogenes具有突出的抑制作用，第3天其抑菌圈值高达30.25±3.61mm。表明艾草发酵液具有广谱抑菌活性，对大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌具有抗菌作用。

实施例3

艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的干预效果

为了研究艾草发酵液作为添加剂预混合饲料的效果，挑选6-7周BALB/c雌性小鼠56只，饲养于20℃-25℃、12h光暗循环鼠笼环境中，自然饮水和食用标准鼠粮。适应环境7天后，随机分为7组，每组8只。包括：空白组(C)，鼠伤寒沙门氏菌感染模型组(ST)，50mg/mL艾草发酵液组(T)，艾草发酵液高剂量(50mg/mL)组(H)、中剂量(5mg/mL)组(M)、低剂量(0.5mg/mL) 组(L)以及植物乳杆菌WLPL01组(01)。

从实验第1天起，空白组C、模型组ST每天连续灌胃200μL生理盐水；50 mg/mL组T，干预组H、M和L每天灌胃200μL艾草发酵液；01组每天灌胃 200μL植物乳杆菌WLPL01菌悬液(5×10⁷cfu/mL)。持续7天，期间每天记录小鼠体重，并观察小鼠生长情况。

在第8天，给空白组小鼠灌胃200μL生理盐水，模型组ST、干预组(H、 M、L和01)灌胃200μL鼠伤寒沙门氏菌菌悬液(10⁸cfu/mL)。12h之后，干预组继续每天灌胃200μL不同浓度的艾草发酵液和植物乳杆菌WLPL01(5×10⁷ cfu/mL)，每天记录小鼠体重，并观察小鼠有无腹泻情况。

试验周期为15天，试验结束后，分别测定小鼠的体重变化、一般健康指数、器官鼠伤寒沙门氏菌易位、病理组织切片和小肠肠道通透性。

实施例4

艾草发酵液对小鼠体重变化和一般健康指数(GHSI)的影响

如实施例3操作，观察艾草发酵液对小鼠体重变化和GHSI的影响。GHSI 如表1所示：

表1：一般健康评分指数标准。

结果如图2所示，鼠伤寒沙门氏菌感染后，模型组ST小鼠的体重开始下降，于第14天开始出现显著性下降；艾草发酵液低剂量组L小鼠体重变化趋势与模型组相似；而高H、中剂量M艾草发酵液组小鼠的体重变化相对稳定。GHSI 与小鼠体重变化的趋势较为一致。模型组ST从感染第1天开始，小鼠活动力逐步下降，部分毛发竖起，精神状态疲软；而高、中剂量的艾草发酵液处理过后，感染的小鼠精神状态良好，且较活泼。说明艾草发酵液有利于保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏菌侵染。

实施例5

艾草发酵液对小鼠组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量的影响；

如实施例3操作，观察小鼠组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量的影响。

S.Typhimurium感染小鼠7天后，其在肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结的分布情况如图3所示。模型组ST小鼠肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结三个组织中的鼠伤寒沙门氏菌载量分别为5.61×10³，1.29×10⁵和3.87×10⁵cfu/g。高、中和低剂量艾草发酵液干预后对小鼠组织中的S.Typhimurium载量呈现不同的影响。在脾脏中，艾草发酵液与S.Typhimurium的菌体载量呈剂量依赖性，即随着艾草发酵液浓度的增高，载量呈显著下降趋势，其中高剂量(H)处理组能从1.29×10⁵ cfu/g降至2.2×10³cfu/g；在肠系膜淋巴结中，高、中剂量(H、M)艾草发酵液也能有效降低S.Typhimurium的转移量。说明艾草发酵液可减少鼠伤寒沙门氏菌在小鼠中的易位。

实施例6

艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道组织的影响。

如实施例3操作，观察艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道组织的影响。

为了解不同剂量艾草发酵液干预鼠伤寒沙门氏菌感染对小鼠肠道组织的影响，取小鼠的结肠和回肠组织进行切片H&E染色分析，结果如图4所示。与空白组C相比，模型组ST小鼠整体肠道组织出现一定程度的损伤，具体表现为结肠组织杯状细胞显著减少，隐窝萎缩且表面不规则，以及粘膜层严重受损；而回肠明显皱缩呈无规则形态(图4C 40×和图3ST 40×)，部分绒毛低矮，分布稀疏，固有层炎性细胞大量浸润(白色星号所指)，以及小肠粘膜糜烂。艾草发酵液高剂量组H与中剂量组M小鼠组织整体形态完整，绒毛紧凑，有相对完整的隐窝结构和黏液层，无明显的炎性细胞浸润；而低剂量组L小鼠回肠形态相对完整，杯状细胞较多，部分炎性细胞浸润，结肠中出现隐窝上移(L图红色双向箭头所指)和黏液层受损的现象。说明艾草发酵液能降低鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠引起的炎症反应。

实施例7

艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道通道性的影响；

如实施例3操作，观察艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道通道性的影响。

艾草发酵液对S.Typhimurium感染小鼠肠道通透性的影响可通过测定血清中的FITC-dextran荧光强度来反映，结果如图5所示。与健康成年小鼠相比，感染组ST小鼠血清中的FITC-dextran含量增加2.79倍，高达2.26±0.35μg/mL。而高剂量H艾草发酵液预处理小鼠血清中的FITC-dextran含量相对感染组(ST) 显著降低，高、中、低剂量的艾草发酵液处理小鼠与空白组(C)水平相比，均无显著差异。类似地，50mg/mL组(T)与空白组(C)相比，亦无显著差异。说明艾草发酵液对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的小肠具有保护作用。

本发明添加剂预混合饲料在对动物及人体无危害的前提下，能替代外源性激素类添加剂，增强动物的免疫力，抵抗鼠伤寒沙门氏菌的感染且效果明显。

Claims

1.一种添加剂预混合饲料，其特征在于：包含植物乳杆菌WLPL01或其发酵艾草后的培养物，所述植物乳杆菌WLPL01已于2019年2月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019067。

2.根据权利要求1所述的添加剂预混合饲料，其特征在于：所述添加剂预混合饲料所用材料为艾草粉末，艾草粉末经粉碎机充分粉碎、过80目筛网和去艾绒所得，艾草粉末占发酵体系总量的10％(w/v)，葡萄糖浓度为5％(w/v)，余量为蒸馏水，植物乳杆菌WLPL01发酵初始浓度添加量为10⁷cfu/mL。

3.根据权利要求2所述的发酵体系，其特征在于：发酵的条件为37℃静置7天，发酵液即为添加剂预混合饲料。

4.权利要求1-3任意一项所述的添加剂预混合饲料的应用，其特征在于：对大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠伤寒沙门氏菌有显著的抑制作用，可以保持鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠肠道的完整性，缓解小鼠的炎症。