CN107267408A - 一种唾液乳杆菌jm55及其应用 - Google Patents

一种唾液乳杆菌jm55及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种唾液乳杆菌JM55及其应用，所述JM55保藏于中国典型培养物微生物保藏中心，保藏编号为M2016593；制备方法包括：制备唾液乳杆菌JM55的种子液；制备发酵液，扩大培养，制备菌粉。本发明的唾液乳杆菌JM55可以较好地耐受胃肠道中不利于细菌生长的因素如酸、胆盐；对肠道致病菌大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄色葡萄球菌的生长均有很好的抑制作用；具有较好的可发酵性；对常用抗生素无抗性，不会对动物造成抗性传播，具有大量生产的潜力。本发明由唾液乳杆菌JM55制备成菌粉添加到肉鸡日粮中，可以显著提高肉鸡的生产性能。

Description

一种唾液乳杆菌JM55及其应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种唾液乳杆菌JM55及其应用。
背景技术
随着抗生素在畜牧生产中大量使用所带来的种种弊端的日益凸显，如导致动物肠道正常菌群失调，动物整体免疫低下，产生耐药性细菌甚至发生抗生素在畜禽产品中的残留，开发替代抗生素的新型环保安全高效的绿色饲料添加剂已成为必然趋势。
近年来，益生菌替代抗生素来促生长、预防和治疗炎症性肠病成为研究的热点，益生菌因其益生特性在畜牧生产中应用前景非常广阔，但不是所有菌株都可以作为益生菌，可作为益生菌的菌株应具有以下特征：(1)正确的益生菌菌株来源；已有研究表明，理想的益生菌菌株最好来自本源动物；(2)对动物健康无负面影响，很多细菌在代谢过程中会产生毒素或类毒素等，而这些有毒的物质会影响动物的健康，因此安全性是决定一株菌能否成为益生菌的必要条件；(3)对胃肠道酸、胆盐等抑制因素有较强的耐受性，因为益生菌的使用方式多为口服，先到达胃再安全到达肠道才能发挥作用，所以益生菌首先必须具有较强的耐酸、耐胆盐和耐胰蛋白酶的特性，保证到达后肠道前不被抑制或杀死，才能发挥有益作用；(4)具有良好的抑菌活性，可抑制肠道中常见病原微生物的生长和繁殖；(5)对肠上皮细胞具有较高的粘附性，对肠上皮细胞的粘附性是其长期发挥有益作用的前提；(6)能用于生产加工并保持较强活力，性能较好的益生菌不仅在经过饲料添加剂的各种加工程序之后仍具有较好活性，还能在储存和运输过程中保持活力等；(7)用于生产的菌株还要必需符合我国农业部规定的《饲料添加剂品种目录》。目前，乳酸菌是应用最早、最广泛的益生菌，是一类能在利用碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌的总称，通常为厌氧或兼性厌氧菌，在动物饲料中常用的有乳酸杆菌属、双歧杆菌属和肠球菌属。其中，肉鸡饲喂乳酸杆菌的研究越来越多，尤其乳酸菌制剂在肉鸡生产中得到广泛的应用，它作为一种活性制剂能够提高肉鸡生产性能和改善肠道环境。例如现有罗伊氏乳杆菌单一菌剂、卷曲乳杆菌单一菌剂及其它们的复合制剂，每克活菌含量仅为107cfu，肉鸡日增重均在50～52g；北京中农颖泰生物技术有限公司研制的高端乳酸菌微生态制剂，商品名康福特100，饲喂42天肉鸡日增重为51.97±4.75g；CN201010527172.6公开了一株植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄球菌等抑菌圈直径均在12.36～ 14.92之间，抑菌作用较小。同时由于饲养环境的差异，益生菌结果不一致性变得越来越复杂因此，寻找一种效果稳定、抑制效果良好、具有最佳肉鸡日增重特点、可制备活性制剂的优良乳酸菌菌种成为进一步研究的课题。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前益生菌结果不一致、稳定性差、抑制效果差、对肠上皮细胞粘附性差对肉鸡生产性能没有显著提高作用。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌JM55 及其应用。
本发明是这样实现的，一种唾液乳杆菌JM55，所述唾液乳杆菌JM55保藏编号为M2016593，保藏日期为2016年11月--3日。
本发明另一目的在于提供一种包含上述的唾液乳杆菌JM55的唾液乳杆菌 JM55菌粉。
本发明另一目的在于提供一种唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法，所述唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法包括以下步骤：
(1)制备唾液乳杆菌JM55的种子液；
(2)制备发酵液：将步骤(1)中制备的种子液转接到液体培养基中，在 36℃～38℃培养12h～24h，作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入液体培养基，119℃～125℃灭菌15min～ 30min；灭菌完成后降温降至36～38℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为0.5％～2％的比例接种到液体培养基中；在温度36℃～38℃，转速100rpm～ 300rpm，pH 6～7，连续发酵12h～24h，即得发酵菌液；
(4)制备菌粉：将步骤(3)中所得的发酵菌液用超高速离心机以转速 6000rpm/min～8000rpm/min，离心15min～25min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的8％～12％，然后搅拌均匀，冷冻干燥20h～ 30h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM55菌粉。
进一步，制备唾液乳杆菌JM55的种子液具体包括：从平板上挑唾液乳杆菌 JM52的单菌落接种到MRS液体培养基，在37℃培养箱培养16h；
制备发酵液中，将步骤(1)中制备的种子液以体积比为1％的比例转接到 MRS液体培养基中，优选37℃培养16h，作为发酵用菌种；
扩大培养中，在发酵罐中加入MRS液体培养基，优选121℃灭菌20min；灭菌完成后，优选降温降至37℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为1％的比例接种到MRS液体培养基中；优选在温度37℃，转速200rpm，pH 6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液；
制备菌粉中，优选用超高速离心机将发酵菌液以转速为8000rpm/min离心 20min，弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10％，然后搅拌均匀，冷冻干燥24h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM52菌粉。
进一步，所述保护剂为脱脂奶粉与甘油以比例5∶1的混合物。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述的唾液乳杆菌JM55制备的肉鸡日粮饲料。
进一步，每千克日粮中含109cfu所述唾液乳杆菌JM55。
本发明的唾液乳杆菌JM55可以较好地耐受胃肠道中不利于细菌生长的因素如酸、胆盐；对肠道致病菌大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄色葡萄球菌的生长均有很好的抑制作用；具有较好的可发酵性，具有大量生产的潜力。本发明由唾液乳杆菌JM55制备成菌粉添加到肉鸡日粮中，可以显著提高肉鸡的生产性能。
实验证明，本发明唾液乳杆菌JM55在pH 4、胆盐浓度为0.2％的MRS培养基中成活率分别为76.7％和89％；同时，本发明唾液乳杆菌JM52对肠道致病大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌以及金黄色葡萄球菌抑菌圈直径可达18～20mm。本发明唾液乳杆菌JM52在PH 6.5、温度37℃、转速 200rpm/min的条件下，可大量生长，发酵菌液经过低温高速离心得到菌体，经过24小时冷冻干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌数高达1010cfu。肉鸡日粮中添加本发明唾液乳杆菌菌粉可使肉鸡平均日增重可达59.2±0.9g，饲料转化率可达1.55±0.08。
附图说明
图1是本发明实施例提供的乳酸球菌JM55菌粉的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
本发明实施例提供的一种唾液乳杆菌JM55，所述唾液乳杆菌JM55保藏编号为M2016593，保藏日期为2016年11月3日。
本发明实施例中的唾液乳杆菌JM55由中国典型培养物保藏中心收入保藏，保藏日期：2016年11月3日，保藏编号CCTCC NO：M 2016593。保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名： Lactobacillus salivarius JM55。该培养物的存活性，保藏中心于2016年11 月3日检测完毕，结果为：存活。
本发明实施例提供的一种包含上述的唾液乳杆菌JM55的唾液乳杆菌JM55 菌粉。
如图1所示，本发明实施例提供的唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法，包括以下步骤：
S101：制备唾液乳杆菌JM55的种子液；
S102：制备发酵液：将S101中制备的种子液转接到液体培养基中，在36 ℃～38℃培养12h～24h，作为发酵用菌种；
S103：扩大培养：在发酵罐中加入液体培养基，119℃～125℃灭菌15min～ 30min；灭菌完成后降温降至36～38℃；将S102中制备的发酵液以体积比为 0.5％～2％的比例接种到液体培养基中；在温度36℃～38℃，转速100rpm～ 300rpm，pH 6～7，连续发酵12h～24h，即得发酵菌液；
S104：制备菌粉：将S103中所得的发酵菌液用超高速离心机以转速 6000rpm/min～8000rpm/min，离心15min～25min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的8％～12％，然后搅拌均匀，冷冻干燥20h～ 30h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM55菌粉。
进一步，制备唾液乳杆菌JM55的种子液具体包括：从平板上挑唾液乳杆菌 JM55的单菌落接种到MRS液体培养基，在37℃培养箱培养16h；
制备发酵液中，将步骤(1)中制备的种子液以体积比为1％的比例转接到 MRS液体培养基中，优选37℃培养16h，作为发酵用菌种；
扩大培养中，在发酵罐中加入MRS液体培养基，优选121℃灭菌20min；灭菌完成后，优选降温降至37℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为1％的比例接种到MRS液体培养基中；优选在温度37℃，转速200rpm，pH 6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液；
制备菌粉中，优选用超高速离心机将发酵菌液以转速为8000rpm/min离心 20min，弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10％，然后搅拌均匀，冷冻干燥24h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM55菌粉。
进一步，所述保护剂为脱脂奶粉与甘油以比例5：1的混合物。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述的唾液乳杆菌JM55制备的肉鸡日粮饲料。
进一步，每千克日粮中含109cfu所述唾液乳杆菌JM55。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：唾液乳杆菌JM55的分离。
1、菌株样品：西藏的藏鸡目前主要是以传统的散养方式为主，其抗病力强，在生长过程中没有接触过抗生素，可以作为一种理想的益生菌来源。样品是从陕西杨凌地区散养肉鸡肠道中采集的，取肠道内容物以及粘膜于4℃保存。
2、培养基：MRS培养基(Man Rogosa Sharp，MRS)，乳酸杆菌选择性培养基，组成如下：胰蛋白10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，三水合乙酸钠 5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三胺2.0g/L，七水合硫酸镁0.58g/L，一水硫酸锰0.25g/L，碳酸钙20g/L，琼脂15g/L，蒸馏水1L。
3、菌株的分离纯化：采用倍比稀释法涂布，37℃培养24h，挑取平板上有明显溶钙圈的单菌落，在平板上划线，多次纯化直到菌落的颜色、大小、形态完全一致；将纯化的菌落在平板上于4℃保存，菌液与50％的甘油1∶1混合均匀后保存于-80℃冰箱。
4、菌株形态特征及生理生化鉴定：将该唾液乳杆菌在MRS固体培养基平板上37℃培养24h，形成乳白色的圆形菌落，边缘整齐光滑。经鉴定，植物乳杆菌的生理生化特征为：革兰氏染色阳性、杆状，H2S反应、过氧化氢酶、硝酸盐还原、明胶液化均为阴性。
5、活性菌株的分子鉴定：提取唾液乳杆菌菌株的基因组，参照天根的DNA 提取试剂盒，PCR引物为细菌16S rRNA序列通用引物：
正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，如SED ID NO：1所示；
反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，如SED ID NO：2所示；
扩增菌株16SrRNA基因，PCR反应体系：20微升体系，mix 10微升，上下游引物各1微升，基因组1微升，灭菌水7微升。PCR反应条件为：95℃10min； 95℃30s；55℃30s；72℃90s；30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，用全式金的胶回收试剂盒回收片段，样品送南京金丝瑞测序公司测序。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示唾液乳杆菌JM55与GenBank基因库中唾液乳杆菌属中的lactobacillus salivarius的16S rRNA序列同源度最高，同源率达97.06％。
综上，根据形态学特性、生理生化特征、分子生物学鉴定，并结合文献报道，确定菌株JM55为唾液乳杆菌JM55。
实施例2：唾液乳杆菌JM55耐酸、耐胆盐的分析
1、首先配制pH为4的MRS培养基和胆盐浓度为0.2％的MRS培养基，121℃灭菌20min；挑取乳杆菌单菌落加到MRS培养基中，37℃培养过夜；然后将乳酸菌菌液涡旋30s，取150μl菌液接到4850μl灭菌生理盐水中，用灭菌生理盐水做10倍梯度稀释(第1管取出500μl，加到4500μl灭菌生理盐水中，即稀释10倍，每个管再取液体之前都要涡旋30s)，逐渐稀释到10-6，取500μl 涂板，每个菌做3个重复，平板放37℃培养箱培养24h，培养结束后统计菌落数M。同时取150μl相同菌液分别接种到4850μl pH为4和浓度为0.2％胆盐的液体MRS培养基中，放37℃培养箱培养2h；培养结束后，做10倍梯度稀释(稀释方法同上)，逐渐稀释到10-6，取500μl涂板，每个菌做3个重复；分别统计各组的菌落形成单位N，结果显示在pH为4和浓度为0.2％胆盐的液体MRS培养基该菌的成活率高达76.7％和89％。
2、唾液乳杆菌JM55耐酸、耐胆盐结果：说明该唾液乳杆菌JM55有较好的耐酸、耐胆盐特性。
实施例3：唾液乳杆菌JM55耐胰蛋白酶的分析：
(1)配制胰蛋白酶浓度为1mg/ml的MRS液体培养基(MRS培养基高温灭菌，冷却后加入胰蛋白酶，胰蛋白酶溶于无菌水中，并用滤膜过滤)
(2)取过夜培养的乳酸菌菌液150微升，用生理盐水10倍梯度稀释后，涂板计数，菌落数记为M；另取150微升菌液加入到胰蛋白酶浓度为1mg/ml的MRS液体培养基中，37℃培养4小时，生理盐水10倍梯度稀释后涂板计数，菌落数记为 N。
(3)计数唾液乳杆菌113的成活率n＝M/N；
(4)实验结果：初始菌落数M为2.33×108CFU；
胰蛋白酶处理4小时以后的菌落数N＝1.98×108CFU；
成活率n＝85％；
由此说明这株唾液乳杆菌可以很好地耐受胰蛋白酶。
实施例4：唾液乳杆菌JM55对热的稳定性：
过夜培养的乳酸菌菌液涡旋均匀后取1ml接种于100mlMRS培养基中，放37℃培养，2小时后稀释涂板计菌落数M；另取1ml接种于100mlMRS培养基中，放45℃培养箱，2小时后稀释涂板计菌落数N。
结果：在37摄氏度培养的菌约为2.5×107CFU；
在45摄氏度培养箱培养的菌约为1.9×107CFU。
实验结果表明，与37℃培养的菌相比，在45℃培养2小时，菌的数量级是一样的，说明该菌对45℃的耐受性较好。
实施例5：唾液乳杆菌JM55的安全性评价：
唾液乳杆菌JM55菌落过夜培养，划线到血平板培养基(购自索莱宝)，24小时以后观察现象，为溶血酶阴性菌。
实施例5：唾液乳杆菌JM55对Caco-2细胞的粘附：
本部分实验采用荧光素Fluorescein Isothiocyanate(FITC，Sigma，USA) 标记乳酸菌的方法检测乳酸菌对Caco-2上皮细胞的粘附能力的大小。具体操作步骤如下：
(1)8000×g室温离心10min收集乳酸菌，弃上清，并用无菌的PBS缓冲液 (pH 7.4)洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬浮菌体；
(2)重悬浮后的菌液，按1∶50加入FITC(Sigma，USA)，放置于培养箱，37 ℃避光静止孵育2h；
(3)离心标记好的乳酸菌，弃上清，并用PBS清洗3次以除去多余的荧光染料，最后用PBS重悬浮菌体，并调整菌液浓度为5×108CFU/ml；
(4)对乳酸菌进行荧光标记的同时，Caco-2细胞也需要预先处理。长成单层细胞的24孔细胞培养板用PBS洗涤2次，然后每孔加入600μl的无抗生素的 DMEM-F12培养基培养2h；
(5)吸取100μl标记的乳酸菌加入24孔板中，即5×107CFU/孔，于二氧化碳细胞培养箱中培养2h；
(6)培养结束后，小心吸取培养基和乳酸菌混合液，并用PBS洗涤3次，用以除去未粘附的乳酸菌；
(7)洗涤完之后，每孔中加入200μl胰酶，室温消化5min，然后再加入600 μl的PBS缓冲液；
(8)用1ml的微量移液器将24孔板中的细胞吹打混匀，加入黑色的96孔板中， 200μl/孔，测其荧光值为A1；
(9)取出剩余荧光标记的乳酸菌100μl，并加入200μl的胰酶和500μl 的PBS缓冲液，混匀后加入黑色的96孔板中，200μl/孔，测其荧光值为A2；
(10)取200μl的胰酶和600μl的PBS缓冲液，混匀后加入黑色的96孔板中，200μl/孔，测其荧光值为A0，作为空白对照；
(11)乳酸菌粘附率的计算公式为：粘附率＝(A1-A0)/(A2-A0)×100％。注意：所有的操作均在暗处进行，尽量避免光照对荧光素造成的损失。
实验结果表明，唾液乳杆菌JM55对肠上皮细胞系Caco-2的粘附能力高达 15％。
实施例6：唾液乳杆菌抑菌试验的分析：
1、将固体LB培养基配好后，121℃高压灭菌20min，灭菌完成后放65℃烘箱保温；挑取MRS平板上的乳杆菌单菌落接种到液体MRS培养基中，放37℃培养箱培养16h；取0.5ml菌液转接到50ml新鲜的MRS培养基中，37℃培养箱培养16h；指示菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌) 接到液体LB培养基中，放37℃摇床，培养15h；在洁净的平板上等距离放上2 个灭菌的牛津杯，固体LB降到45℃后加入指示菌(100ml LB加如100μl的指示菌菌液)，摇匀后每个平板上倒入20ml混有指示菌的LB培养基；
待培养基凝固后，用灭菌的镊子轻轻转动牛津杯并取出，两个孔各加入200微升菌液，每种菌做3个重复；对照组加入200微升的灭菌MRS；菌液加好后，室温放置2h，待菌液扩散完毕后放入放37℃过夜培养；并用游标卡尺测量抑菌圈直径(单位：mm)。、
2、植物乳杆菌的抑菌试验结果：见表1。
由表1可知，MRS培养基对各种肠道致病菌均没有抑菌效果，而植物乳杆菌对5种致病菌均有较强的抑菌效果，抑菌圈直径可达17mm以上。
表1-唾液乳杆菌JM55抑菌圈直径(mm)
实施例7：唾液乳杆菌药敏试验的分析：
首先将抗生素利用特定的溶剂配制浓成度为5120μg/mL的溶液，滤膜过滤除菌，-80℃保存备用(CLSI 2010)。试验前先将抗生素溶液用灭菌去离子水2 倍逐级稀释，稀释后的抗生素浓度从5120μg/mL至1.25μg/mL，共13个梯度。测定方法参照美国临床和实验室标准化协会推荐的琼脂稀释法进行耐药性检测，但本研究中略有改进，本试验中并未使用CLSI推荐的M-H培养基，因为其可能会影响到乳酸菌的正常生长，而已有研究表明MRS固体培养基对检测抗生素的抑菌活性并无显著的影响(Danielsen and Wind 2003)，因此本研究中的药敏试验均选用MRS培养基。将高压灭菌的MRS固体培养基降至40℃，然后精确量取上述逐级稀释的抗生素溶液2mL加入18mL MRS琼脂培养基中，混合混匀，倒板冷却，以不含抗生素的MRS平板作为阳性对照。MRS平板中的抗生素的终浓度从512μ g/mL至0μg/mL，共14个梯度，平板冷却凝固后4℃保存备用。将备选菌株按1％接种于MRS液体培养基中，37℃条件下静置培养12小时，8000rpm/min离心5分钟收集菌体，用灭菌生理盐水(0.9％NaCl)将菌液浓度调整至0.5麦氏比浊度后，再将其稀释1000倍。然后定量吸取1μL的备选菌液，按照抗生素浓度由低到高的顺序接种于添加抗生素的MRS平板上，各菌株重复3次。置于无菌操作台中使菌液晾干，37℃常氧条件下在培养箱中倒置培养36小时，观察并记录菌株的最小抑菌浓度值(MIC，minimalinhibitory concentration)；即36小时培养后能够观察到抑制菌株生长的最低抗生素浓度，然后与现有法规或文献中推荐的最小抑菌浓度临界值进行对比，以判定菌株是否具有抗生素耐药性。测定菌株MIC 值小于推荐临界值的认定对该抗生素敏感，大于或等于推荐临界值的认定为对该抗生素耐药。目前国际上并没有针对益生菌设定统一的耐药折点，本研究根据EFSA(2008)推荐的益生菌最小抑菌浓度作为标准来判定菌株是否耐药。
结果表明，唾液乳杆菌JM55对所测定抗生素均未表现出耐药性。
实施例8：唾液乳杆菌菌粉的制备
1、菌液的发酵
(1)制备种子液：从平板上挑乳杆菌单菌落接种到MRS液体培养基，放37 ℃培养箱培养16h；
(2)制备发酵液：取1ml新鲜乳酸菌菌液转接到100ml MRS液体培养基中，37℃培养16h，作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：配好4L MRS培养基，加入到发酵罐中，在碱瓶中装入10 mmol的碱液100ml，按要求装好发酵罐，121℃灭菌20min；
灭菌完成后，温度降至不烫手时装到发酵设备上，打开循环水浴降温降至37℃；用50ml无菌注射器吸取40ml菌种，通过接种口点火接种；在温度37℃，转速200rpm，pH 6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液。
4)菌粉的制备：将发酵菌液8000g用超高速离心机以转速8000rpm/min 离心20min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入脱脂奶粉和甘油作为保护剂，保护剂按菌泥重的10％添加，搅拌均匀；菌泥加在冻干盘上并抹平，冷冻干燥 24h；冻干后研成粉末状，称取0.1g菌粉用灭菌生理盐水分别稀释到10-6、10-7、和10-8涂板计活菌数，每批菌粉重复3次，测得每克菌粉的活菌数可达1010CFU 发酵菌粉放-20℃冰箱保存。
结论：上述表明在PH 6.5、温度37℃、转速200rpm/min的条件下，该菌株可大量生长，发酵菌液经过低温高速离心得到菌体，经过24小时的冷冻干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌数高达1010CFU。由此说明该菌株具有较好的可发酵性，具有大量生产的潜力。
实施例9：唾液乳杆菌JM55对肉鸡生产性能的影响
1、试验采用单因素完全随机设计，288只健康1日龄AA肉仔鸡随机分成3 个处理，每个处理6个重复，每个重复16只鸡。日粮选用无抗生素的基础日粮， 0-21天饲喂育雏期日粮，22-42天饲喂育成期日粮，试验日粮见表：2。在42日龄统计肉鸡生产性能见表3，包括平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI) 和饲料转化率(FCR)以及42日龄体重。
表2-试验日粮
组别(group) 添加类别(addition agent) 添加剂量(additional dose)
对照1(control 1) ---- ----
对照2(control 2) 金霉素 50mg/kg日粮(50mg/kg diet)
处理3(treatment) 唾液乳杆菌(L.salivarius) 109cfu/kg 日 粮(109cfu/kg
表3-唾液乳杆菌JM55对肉鸡生产性能的影响(单位：g)
注：同一行数字肩注有不同小写英文字母时表示差异显著(P＜0.05)
试验结果：由表3可知，唾液乳杆菌JM55可以显著提高肉鸡的平均日增重和42日龄体重，并且与抗生素具有相似的效果；此外，
唾液乳杆菌JM55也显著改善了肉鸡饲料转化率，并且与抗生素具有相似的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<120> 一种唾液乳杆菌JM55及其应用
<130> 2014
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> RNA序列 1
agagtttgat cctggctcag
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> RNA序列 2
ggttaccttg ttacgactt 。

Claims (7)

1.一种唾液乳杆菌JM55，其特征在于，所述唾液乳杆菌JM55保藏编号为M2016593，保藏日期为2016年11月-3日。
2.一种包含权利要求1所述的唾液乳杆菌JM55的唾液乳杆菌JM55菌粉。
3.一种如权利要求2所述的唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法，其特征在于，所述唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法包括以下步骤：
(1)制备唾液乳杆菌JM55的种子液；
(2)制备发酵液：将步骤(1)中制备的种子液转接到液体培养基中，在36℃～38℃培养12h～24h,作为发酵用菌种；
(3)扩大培养：在发酵罐中加入液体培养基，119℃～125℃灭菌15min～30min；灭菌完成后降温降至36～38℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为0.5％～2％的比例接种到液体培养基中；在温度36℃～38℃，转速100rpm～300rpm，pH 6～7，连续发酵12h～24h，即得发酵菌液；
(4)制备菌粉：将步骤(3)中所得的发酵菌液用超高速离心机以转速6000rpm/min～8000rpm/min，离心15min～25min；弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的8％～12％，然后搅拌均匀，冷冻干燥20h～30h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM55菌粉。
4.如权利要求3所述的唾液乳杆菌JM55菌粉的制备方法，其特征在于，制备唾液乳杆菌JM55的种子液具体包括：从平板上挑唾液乳杆菌JM55的单菌落接种到MRS液体培养基，在37℃培养箱培养16h；
制备发酵液中，将步骤(1)中制备的种子液以体积比为1％的比例转接到MRS液体培养基中，优选37℃培养16h,作为发酵用菌种；
扩大培养中，在发酵罐中加入MRS液体培养基，优选121℃灭菌20min；灭菌完成后，优选降温降至37℃；将步骤(2)中制备的发酵液以体积比为1％的比例接种到MRS液体培养基中；优选在温度37℃，转速200rpm，pH 6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液；
制备菌粉中，优选用超高速离心机将发酵菌液以转速为8000rpm/min离心20min，弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10％，然后搅拌均匀，冷冻干燥24h后研成粉末状，即得唾液乳杆菌JM55菌粉。
5.如权利要求3～4任意一项所述的的植物乳杆菌JM55菌粉的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉与甘油以比例5：1的混合物。
6.一种利用权利要求1所述的唾液乳杆菌JM55制备的肉鸡日粮饲料。
7.如权利要求6所述的肉鸡日粮饲料，其特征在于，每千克日粮中含109cfu所述唾液乳杆菌JM55。
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