CN104480047B - 一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌hs11bd1菌株及其应用 - Google Patents

一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌hs11bd1菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1(Bacillus？subtilis？HS11BD1)菌株，该菌株的基因序列如SEQ？ID？NO.1所示。该菌株具有高分泌枯草菌素的优点，能够应用于制备抗大肠杆菌的药物中。同时，将该菌株作为助剂添加进家禽家畜饲料中，能够显著提高家禽家畜生长速度，降低腹泻率，对于蛋鸡、肉鸡以及仔猪和肥育猪的效果尤其明显。本发明提供的高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1(Bacillus？subtilis？HS11BD1)菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO：M2014637。

Description

一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株，具体涉及一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1菌株，以及该菌株的用途，属于微生物应用技术领域。
背景技术
现代规模化和集约化养殖方式的迅速发展，导致饲养密度过大、养殖环境质量下降等多种问题的出现，破坏了动物胃肠道正常菌群的微生态平衡，使条件性致病菌大量增殖，降低动物对病菌的抵抗力，易引起动物各种消化道疾病。为达到防治动物疾病、促进动物生长的目的，目前主要采用改善饲养管理和在饲料中添加抗生素的方法，但大量抗生素广泛应用于动物生产中，也带来了菌株的药物耐药性增强、药物残留增加、动物易感性增加、免疫力下降等各种不良后果，甚至会导致人畜共患的、具有超强耐药性的超级细菌出现，这种状况引起了科研工作者和广大消费者的高度关注。
随着益生菌微生态制剂技术的不断开发和积累，其具有的安全性、无毒性、无残留性以及有利于生态环境的可持续发展等的特点，使其成为抗生素替代品的首选。微生态制剂可分泌多种物质，抑制病原菌的生长，改善动物免疫力。而芽孢杆菌更是应用于微生态制剂最为广泛的一个菌株。在恶劣环境下，芽孢杆菌以孢子的形式存活，在饲料颗粒和胃酸环境中仍有较强的活性，可产生多种抗菌素和多种酶类，在改善动物生产性能、维持动物胃肠道微生态平衡、提高饲料利用率等方面有很好的作用。
自然界中，不同的芽孢杆菌菌株在益生性能上存在较大的不同，某些抗菌素的分泌状况也存在较大的差异，特别是对枯草菌素高分泌的菌株应用尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1(BacillussubtilisHS11BD1)菌株，该菌株的的保藏编号为：CCTCCNO：M2014637，该菌株的基因序列如SEQIDNO.1所示。
该菌株具有高分泌枯草菌素的优点，能够应用于制备抗大肠杆菌的药物中。
同时，将该菌株作为助剂添加进家禽家畜饲料中，能够显著提高家禽家畜生长速度，降低腹泻率，对于蛋鸡、肉鸡以及仔猪和肥育猪的效果尤其明显。
本发明提供的高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌HS11BD1(BacillussubtilisHS11BD1)菌株于2014年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014637。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1菌株的筛选、鉴定及检测
HS11BD1菌株的筛选
制备土壤稀释液：从黄石天坑采取的土壤样品称取10g，放入150ml的无菌水中，摇床150r/min震荡50min，置于50℃的水浴锅中30min，取出静置到溶液澄清。无菌操作吸取上清液1ml与9ml的无菌水，用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9共九个浓度梯度。
培养：每个稀释浓度按5％的接种量接入到灭菌过后冷却至55℃左右的NA培养基中(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0)，置于30℃恒温培养箱中培养48h。
筛选单菌落：待培养皿中长出菌落后，根据枯草芽孢杆菌的形态挑取单个菌落接种于NA培养皿中，30℃培养36～48h。
菌株纯化：采用平板划线分离纯化方法，至平板上检测为单一菌株，并命名为HS11BD1。
菌株保藏：纯化的HS11BD1菌株保存于-20℃的低温冰箱中。
菌株的鉴定
1、形态观察：将HS11BD1菌株接种于NA培养基中培养适当时间后做革兰氏染色镜检观察。
2、染色镜检结果：HS11BD1菌株为杆状细菌，革兰氏染色为阳性G+，鞭毛侧生，有芽孢，芽孢椭圆形，中生，芽孢囊不明显膨胀。
表1HS11BD1菌株形态学特征
形态学特征 结果
革兰氏染色 G+
性状 杆状
大小 0.6～0.9μm×2.2～3.5μm
芽孢 +
鞭毛 +
孢囊 +
运动性 +
3、生理生化试验：7％NaCl生长试验、V-P试验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、接触酶反应实验、淀粉水解实验、丙酸盐利用实验、D-甘露醇发酵实验、pH5.7生长试验。
表2HS11BD1菌株形态学生理生化特性
4、HS11BD1菌株对O2的耐受性：
采用深层琼脂培养法测定HS11BD1菌株对O2的耐受性，在NA深层培养基(pH7.0)中接种HS11BD1菌株，在30℃下培养36h，然后开始观察期生长情况，直到结果清晰为止，根据菌株在培养基中的生长位置来判断其对O2的耐受性。
结果表明，HS11BD1菌株只生长在培养基的表面，认定为好氧菌。
5、HS11BD1菌株对温度的耐受性：
将HS11BD1菌株接种到NA培养基中，分别置于5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃条件下培养48h，观察菌株的生长状况。
表3HS11BD1菌株对温度的耐受性
一：不生长；+：生长差；++：生长一般；+++：生长良好
6、HS11BD1菌株对pH的耐受性：
制备pH分别为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的NA液体培养基，在无菌条件下接种等量的菌株，保证每个培养试管内菌的浓度一样，然后置于30℃恒温培养箱中培养24h，测定每个培养的OD600值。
表4HS11BD1菌株对pH的耐受性
由表4可以看出，HS11BD1菌株的最适生长pH在中性偏弱碱性环境。
7、16SrRNA核苷酸序列分析
引物：
F：5’-AGGTCCTGAGCTAGCTAATG-3’
R:5’-CATTAGCTAGCTCAGGACCT-3’
测出该菌株16SrRNA全基因序列如SEQIDNO.1所示。将此序列提交到NCBI核苷酸数据库中进行BLAST在线分析，与已有菌株的部分16srRNA基因序列进行比对，结果表明与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的同源性均＞96％。结合菌株的形态特征和生理生化特性，初步鉴定将HS11BD1菌株暂定为枯草芽孢杆菌。
枯草菌素的检测
1、枯草菌素上清液的制备：将HS11BD1菌株接种到Landy液体培养基中，于37℃下培养20h，吸取1ml培养液接种到装有50ml的液体Landy培养基的三角瓶中，继续培养20h，获得枯草菌素的发酵液(同时检测此时培养液中枯草芽孢杆菌的数量)。将10ml发酵液在无菌环境下转移至己灭菌的EP管，15000g，4℃条件下离心l5min，即得发酵上清液。
2、取上清液2ml，用0.22μm微孔滤膜过滤，取500μL过滤液上样，用RP-HPLC，采用BeckmanGoldHPLC操作软件系统进行分析，柱子型号为AgilentzobaxEclipseXDB，粒径5μm，4.6×250mm。
3、采用梯度洗脱，流动相A为：20％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。梯度洗脱方法为(以流动相B作为参考)：0-10min，0％B；10-12min，0-20％B；12-32min，20％-30％B；32-35min，30％-100％B，检测波长214nm，流速0.5ml/min。枯草菌素标准品(Sigam)也在相同条件下进行HPLC分析。经计算，枯草菌素的含量为30.5±3.5mg/L，此种枯草芽孢杆菌的枯草菌素分泌量较目前已知的所有枯草芽孢杆菌的都高。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD11菌株的培养
取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1菌株接种于100mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度：30℃，pH值：7.0，转速：200rpm，发酵时间：48h。所使用的种子培养基组成为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉20.0g，pH7.0。
取100mL摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，装液量：6L，发酵温度：30℃，pH值：7.0，转速：200rpm，发酵时间：36h-48h。所使用的发酵培养基组成为：葡萄糖0.5％、淀粉0.4％、豆饼粉1.2％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸亚铁0.015％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％，补充水至100％，pH值7.0。
将发酵培养液和载体混合均匀，经离心喷雾干燥，制得枯草芽孢杆菌制剂用于后续实施例使用，枯草芽孢杆菌制剂中的活菌含量为4×109CFU/g～2×1010CFU/g，载体为淀粉、滑石粉、碳酸钙中的一种或任意几种的组合体。
实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1益生性验证
应用牛津杯法测定抑菌效果。把大肠杆菌冻干粉置于复活液中，然后放置于37℃培养箱培养48h。分别取2克200亿CFU/g枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1、2克市售同类产品200亿CFU/g枯草芽孢杆菌、2克40亿CFU/g枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1溶于20毫升蒸馏水中。充分混匀之后用移液枪取0.5mL于10mL的液体培养基中，置于32-35℃培养箱中18-24h，设空白对照一个。将熔化好的固体培养基倒入平板约20mL。待晾干后，用移液枪取400μL稀释好的细菌悬浮液(106～107CFU/mL)，再用三角涂布棒均匀涂布。然后在上面均匀摆放2-3个外径为7.8mm的灭菌过牛津杯。在每个牛津杯中加入200μL样品稀释液，放置于4℃的冷藏室12h以确保样品充分扩散，之后放置于32-35℃培养箱中24-48h，待空白长满指示菌后，测量抑菌圈直径(d)计算抑菌面积。
表5枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1对大肠杆菌的抑菌圈直径的影响
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)
结论：本试验结果显示，枯草芽孢杆菌可显著抑制大肠杆菌生长，具有较好的抑菌作用(P＜0.05)，且枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1效果最为显著，显著优于市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品效果(P＜0.05)。低含量组与市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品相比抑菌效果相近。
实施例3：本发明产品的在断奶仔猪中使用效果
本实例选择健康断奶仔猪120头(平均9kg)，按体重相近原则随机分成4处理，每个处理3个重复，每个重复10头仔猪，分为空白对照组、本发明高含量组和低含量组，及市场购买同类产品组，试验期35天。
本发明高含量组：本发明高含量组：本发明的高含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。低含量组：本发明的低含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥4×109CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为4×108CFU/kg饲料。
同类产品组：市场购买的枯草芽孢杆菌，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。试验结果如下表：
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)
结论：本试验结果显示，添加枯草芽孢杆菌可显著提高仔猪生长速度、降低料肉比和减少仔猪断奶后腹泻率(P＜0.05)，其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1效果最为显著，且显著优于市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品效果(P＜0.05)。低含量组与市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品相比效果相近。
实施例4：本发明产品的在生长肥育猪中使用效果
本实例选择健康生长猪96头，按体重相近原则随机分成4处理，每个处理3个重复，每个重复8头猪，分为空白对照组、本发明高含量组和低含量组，及市场购买同类产品组，试验期45天。
本发明高含量组：本发明高含量组：本发明的高含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。低含量组：本发明的低含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥4×109CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为4×108CFU/kg饲料。
同类产品组：市场购买的枯草芽孢杆菌，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。
试验结果如下表。
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)
结论：本试验结果显示，添加枯草芽孢杆菌可显著提高生长猪生长速度和降低料肉比(P＜0.05)，其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1效果最为显著，且显著优于市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品效果(P＜0.05)。低含量组与市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品相比效果相近。
实施例5：本发明产品的在肉鸡中使用效果
本实例选择体重相近、健康1日龄AA肉鸡160羽，随机分成4组，每组4个重复，每个重复10羽鸡。分为空白对照组、本发明高含量组和低含量组，及市场购买同类产品组，试验期42天。
本发明高含量组：本发明高含量组：本发明的高含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。低含量组：本发明的低含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥4×109CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为4×108CFU/kg饲料。
同类产品组：市场购买的枯草芽孢杆菌，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。
试验结果如下表：
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)
结论：本试验结果显示，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1可显著提高肉鸡42日龄时的体重，降低腹泻率，降低全期料重比(P＜0.05)。低含量组与市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品相比效果相近。
实施例6：本发明产品的在蛋鸡中使用效果
本实例选择同一栏舍内29周龄健康海兰褐蛋鸡720羽，鸡只精神状态良好、产蛋率无显著差异，随机分成4组，每组3个重复，每个重复60羽，分为空白对照组、本发明高含量组和低含量组，及市场购买同类产品组，试验期28天。
本发明高含量组：本发明高含量组：本发明的高含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。低含量组：本发明的低含量枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥4×109CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为4×108CFU/kg饲料。
同类产品组：市场购买的枯草芽孢杆菌，活菌数≥2×1010CFU/g，按0.01％量添加到饲料中，含菌数为2×109CFU/kg饲料。试验结果如下表：
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)
结论：本试验结果显示，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1可显著提高蛋鸡产蛋率(P＜0.05)，低含量组与市场购买的枯草芽孢杆菌同类产品相比效果相近。

Claims (5)

1.一种高产枯草菌素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HS11BD1菌株，该菌株的保藏编号为：CCTCCNO：M2014637，该菌株的16srRNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HS11BD1菌株在制备抗大肠杆菌的药物中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HS11BD1菌株在制备家禽家畜饲料中的应用。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的家禽饲料为蛋鸡和肉鸡饲料。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的家畜饲料为仔猪和肥育猪饲料。
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