CN108587957A - 一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用。本发明的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)对常见畜禽肠道致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和魏氏梭菌具有明显的抑菌效果。本发明包括地衣芽孢杆菌菌株的分离鉴定、生物学特性研究及其作为畜禽饲料添加剂的应用等。本发明的菌株产纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶，耐受胃酸低pH值及肠道胆盐高渗透压，生长速度快，抗逆性能强，抑菌性较强、产酶能力强的特点，可用于制备畜禽饲用微生物添加剂。

Description

一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用

技术领域

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用，所述的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)对常见肠道致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及魏氏梭菌具有明显的抑菌效果。本发明包括地衣芽孢杆菌菌株的分离鉴定、生物学特性研究及其作为畜禽饲料添加剂的应用。

背景技术

抗生素饲料添加剂的使用曾被认为是二十世纪畜牧业生产最伟大的生物技术之一，在防治动物疾病、提高畜禽生产效率，满足人类动物产品需要上发挥了巨大作用。但随着时间的推移，由于饲料中长期添加抗生素带来了许多负面效应，如细菌耐药性和药物残留等，严重危害养殖业健康发展，影响人类食品安全，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。欧盟于2006年已全面禁止在饲料中使用抗生素作为饲料生长添加剂，美国、日本相继跟进；2011年7月1日韩国全面禁止在动物饲料中添加抗生素；近年来我国也不断加强饲添抗生素的管制，禁用饲添抗生素的呼声越来越高。因此研发绿色、无污染、无残留的抗生素替代品及替代技术已成为热点。

研究表明，益生菌制剂具有抗菌、抑菌，防止动物疾病，增强动物免疫力，改善动物生产性能的特点，且具有天然、安全、无残留、无污染等优点，能够很好的替代抗生素的抑菌作用；酶制剂同样具有安全、无残留、无污染等优点，能够显著提高饲料转化率，促进动物生长，能够替代抗生素的促生长作用，因此二者均作为饲添抗生素替代品被广泛研究开发与应用。尽管如此，二者均具有较大的局限性，益生菌作用侧重于抗菌、抑菌，促生长效果较弱，而酶制剂作用在于提高饲料转化率，促进动物生长，不具有抗菌效果，且其抗逆性较差，性质不稳定，容易失活。因此研究开发既具有抗菌、抑菌作用，又具有较好的促生长效果高产复合酶的益生菌，将能够很好克服单一益生菌与酶制剂的局限性与缺陷，发挥益生菌与酶制剂的协同效应，且能够有效降低动物生产成本，替代饲添抗生素，为我国畜牧业的绿色、健康可持续发展提供技术支撑。

基于以上的论述，本发明通过筛选具有良好益生特性及产酶特性的高抗逆性地衣芽孢杆菌，验证其应用效果，为开发具有自主知识产权的新型、高效动物微生态制剂奠定了基础同时也为饲添抗生素的替代产品提供相应的技术和产品支持。

发明内容

本发明的目的在于改善单一益生菌促生长效果较差，酶制剂制备成本高、性质不稳定、易受体内外环境影响等缺点，提供一种高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用。本发明通过抑菌性试验、生长曲线以及抗逆性试验等方法筛选出抑菌性较好、繁殖速度快、耐受性强且性质稳定的益生地衣芽孢杆菌菌株。对筛选出的菌株在不同饲料底物培养下的产酶情况进行了系统研究，通过体外消化试验测定其对于不同饲料组合中多糖和蛋白质的降解能力，探索该益生地衣芽孢杆菌对于动物营养吸收的促进作用，为产酶益生素制备和应用提供科学支撑，同时为减少抗生素的使用，提高动物生产性能，减少对环境污染，为发展新型、健康生态养殖模式提供技术支撑。

本发明的技术方案如下：

根据地衣芽孢杆菌的生理生化特性及遗传学特性，与现代分子生物学技术相结合，以采集的健康鸡粪作为菌种来源，选育出一株高产复合酶的地衣芽孢杆菌菌株，申请人将其命名为地衣芽孢杆菌HDRaBLp，Bacillus Licheniformis HDRaBLp，于2016年5月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2016300。

地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)HDRaBLp的微生物菌学特征：

地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)HDRaBLp菌株为革兰氏阳性菌，呈长杆状，单个、成对或链状排列。在LB培养基上生长良好，24h内形成扁平、边缘不整齐的污白色菌落且表面粗糙皱褶。厌氧环境能够生长，明胶液化、M.R、V.P、精氨酸阳性。鸟氨酸、赖氨酸阴性。对其16S rRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blastn比较，发现其16S rRNA与地衣芽孢杆菌(KX812811.1)的序列同源性最高，相似性为99％。

本发明的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株能耐受10％NaCl、0.5％胆盐的生长环境，在pH2.0的条件下孵育2h，其活菌数几乎没有下降；且在90℃高温孵化10min后其活菌数也几乎没有下降。由此推测，该菌株能够抵抗胃酸和小肠中高浓度胆盐的不利影响，并且能够经受高温制粒的加工等环境。

本发明的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株繁殖能力很强，无迟缓期，很快进入对数增长期(0h～6h)，6h后进入稳定期，一直持续到18h，细菌数达到最大，为2.35×10⁹CFU/mL，18h后进入衰退期。

本发明的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株对常见肠道致病菌(大肠杆菌、金黄色萄萄球菌、魏氏梭菌等)均具有明显的抑菌活性。

本发明的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株具有较强的产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶能力。

本发明的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株对于饲料营养的消化吸收一定的促进作用，适合作为饲料添加剂添加至饲料中。

本发明具有以下优点：

(1)本发明分离的地衣芽孢杆菌HDRaBLp来源于家禽肠道，对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌等)具有明显的抑菌效果，为替代抗生素作为饲料添加剂提供了有力依据。

(2)本发明分离的菌株生长繁殖速度快，适合于工业化生产；

(3)本发明分离的菌株能形成芽孢，因而对外界环境有很强的抵抗力，加热至90℃，10min不会失去活性，可完全耐受畜禽体内胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，相比于酶制剂耐受性强且性质稳定，因此可在肠道定植发挥益生作用；

(4)本发明分离的菌株作为肠道的定植菌，生产及使用均十分简单，产酶总量随时间推移而不断增加，大大降低了直接饲喂酶制剂所需的成本。

(5)本发明分离的具有一定的产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等复合酶能力，可提高畜禽肠道的消化酶活性，提高饲料消化率和利用率。体外消化试验证明，该菌株对于饲料营养的消化吸收具有一定的促进作用，可替代抗生素作为畜禽饲料添加剂使用，不仅可以提高畜禽生产性能，而且具有环境友好，对人畜安全的优点。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp 16S rDNA基因部分序列。

图1：本发明分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株在LB琼脂平板上的生长状态。

图2：本发明分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株革兰氏染色显微镜形态(×2000)。

图3：本发明分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株孔雀绿染色显微镜形态(×2000)。

图4：本发明分离筛选的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株16SrRNA基因PCR扩增检测结果。

附图标记说明：M：DL 2000 DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：HDRaBLb，泳道3：HDRaBLi；泳道4：HDRaBLk，泳道5：HDRaBL1，泳道6：HDRaBLp(本发明菌株)泳道7：HDRaBLq，泳道8：HDRaBLt。

图5：本发明地衣芽孢杆菌的生长曲线。

图6：地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株在不同产酶定性平板上的抑菌试验结果。附图标记说明：图6中的A图：接种在纤维素酶定性平板上地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株的抑菌圈比较；图6中的B图：接种在淀粉酶定性平板上地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株的抑菌圈比较；图6中的C图：蛋白酶定性平板上的地衣芽孢杆菌HDRaBLp菌株的抑菌圈比较。

具体实施方案

实施例1：菌株的分离和鉴定

一、菌株的分离

分离物样品取自湖北省武汉市某鸡场90日龄健康肉鸡鸡粪。样品采集后，用灭菌棉拭子挑取少许粪便于装有3mL无菌水的7mL EP管中，于80℃水浴10min后，将菌液涂布于LB固体培养基上，选取表面粗糙皱褶、边缘不整齐的污白色菌落做纯培养，纯培养物经革兰氏染色进行形态学观察以初步筛选，细菌呈长杆状，单个、成对或链状排列的革兰氏阳性杆菌，20h后形成芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大，将该发明的菌株命名为地衣芽孢杆菌HDRaBLp，传代保存。该菌株在固体LB培养基上的菌落特性见图1，革兰氏染色特性见图2，孔雀绿染色特性见图3。

二、菌株生理生化试验初步鉴定

将上述分离的菌株进行厌氧、明胶液化、M.R、V.P、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、耐盐生长等生理生化试验的鉴定，将鉴定结果(见表1)与常用的《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001)中关于芽孢杆菌种间鉴别的描述相对照，初步判定HDRaBLp为地衣芽孢杆菌。

表1地衣芽孢杆菌株HDRaBLp生化鉴定结果

三、菌株种的确证

在上述鉴定的基础上，进一步在分子生物学水平上对本发明的菌株HDRaBLp进行16S rRNA基因序列检测，对菌株所属的种进行确证鉴定。具体步骤如下：

(一)菌株基因组的提取：

(1)取1mL本发明分离的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp纯培养物，加入1.5mL EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中。

(2)加入6μl 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。

(3)再加2M NaCl 50μL，10％SDS 110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜。

(4)将菌液均分到两个1.5mL EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5～10min；12000rpm离心10min；如此重复抽提两次。

(5)加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。

(6)用75％的乙醇洗涤沉淀。

(7)风干后，溶于50μL ddH2O中，加入1μL 10mg/mL RNaseA，37℃消化2～3h。

(8)取2～5μl电泳检测。贮存于-20℃备用。

(二)16S rRNA基因序列的引物设计：

参照已发表的地衣芽孢杆菌16S rRNA基因序列(登陆号EU718490.1)，应用Primer5.0分析软件设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成如下：

正向引物F：5′-CGTGCCTAATACATGCAAGTCGAAC-3′，

反向引物R：5′-ACGACTTCACCCCAATCATCTATCC-3′；

PCR扩增16S rRNA基因的方法：

采用上述引物以本发明分离的细菌基因组为模板，扩增登陆号EU718490.1基因部分16S rRNA序列。反应体系见表2。PCR程序为：94℃5min，94℃45s，55℃45s，72℃1.5min，30个循环后72℃延伸10min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，片段大小与预期相符，为1579个碱基对(见图4)。

表2菌株HDRaBLp 16S rRNA PCR体系

(三)16S rRNA基因PCR产物的克隆与测序

用DNA纯化试剂盒(购自Omega公司)回收DNA，具体步骤参照该试剂盒的说明书。

PCR产物纯化后连接到pDM18-T载体，转化DH5α感受态细胞，涂于含Amp的琼脂平皿上进行筛选。挑取白色菌落于含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床过夜，直接取菌液做模板进行PCR鉴定。对阳性克隆的菌液，送武汉擎科创新生物科技有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对。检索发现，HDRaBLp的16S rRNA与地衣芽孢杆菌(KX812811.1)的序列同源性最高，相似性为99％。扩增的部分16S rRNA基因序列见序列表SEQ ID NO：1。

实施例2：菌株的抑菌性能验证

指示菌(肠致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌)悬液制备时，用接种针从斜面上挑取少量的指示菌，分别接种到常规营养肉汤培养基中，37℃培养24h，调节菌悬液的浓度约为10⁹CFU/mL。

采用平板扩散的方法(Lyver等，1998；林东等，2001)，将地衣芽孢杆菌用接种棒蘸取少许分别点种到倒好的营养琼脂平板中央，37℃培养24h，然后把平板倒扣于盛有一薄层氯仿的培养皿盖上并熏蒸约30min，以便杀死活细胞并能让菌落固定于平板的表面，然后移去培养皿盖并让平板里的残余氯仿彻底挥发20min。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液，均匀布满后倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培养24h，观察点种的芽胞杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。试验结果表明(表3)，该菌株具有较强的抑菌效果。

表3地衣芽孢杆菌株HDRaBLp发酵上清液体外抑菌试验

实施例3：地衣芽孢杆菌株HDRaBLp的抗逆特性及生长特性

一、耐受性试验

(一)胆盐耐受性试验

将地衣芽孢杆菌株HDRaBLp(于2013年12月从湖北省武汉市某鸡场90日龄健康肉鸡鸡粪中分离得到)活化2代后，取1mL接种于9mL含0％，0.15％，0.30％，0.50％胆盐的常规LB液体培养基中，37℃培养12h，稀释至合适倍数，取0.1mL涂于固体LB平板，观察生长情况并计数，每个处理重复3次。结果显示HDRaBLp能耐受0.15％，0.30％，0.50％胆盐浓度(见表4)。消化道内胆汁浓度在0.03％～0.3％范围内波动，因此，地衣芽孢杆菌株HDRaBLp能耐受肠道胆盐环境。

表4地衣芽孢杆菌株HDRaBLp对胆盐的耐受性

(二)酸耐受性试验

将活化的地衣芽孢杆菌株HDRaBLp按体积分数2％的接种量分别接种pH2.0，pH2.5，pH6.4的盐酸溶液，37℃静置培养。取培养0h，0.5h，1h，1.5h，2h的培养液，稀释至合适倍数，取0.1mL涂于固体LB平板，观察生长情况并计数。结果表明(表5)，HDRaBLp对pH2.0的盐酸溶液具有较好的耐受性，HDRaBLp经pH2.0的盐酸处理1h后的存活率为93.8％，处理2h后存活率位85.2％，而经pH2.5的盐酸处理2h后存活率均在90％以上，综合以上数据，表明本发明分离的地衣芽孢杆菌株HDRaBLp能顺利通过胃肠道的酸性环境并在胃肠道中生存。

(三)高温耐受性试验。

将2％已活化的地衣芽孢杆菌株HDRaBLp接种到LB液体培养基中，37℃条件下培养3～4h。菌液分别经过80℃、90℃的热处理，设37℃为对照；取热处理0min、3min、5min、10min的菌液，稀释至合适的倍数，取0.1mL涂于固体LB平板，观察生长情况并计数。试验结果见表6。结果显示经过80℃、3min和5min以及90℃、3min组合的处理后，地衣芽孢杆菌HDRaBLp存活率均达到95％以上。经过80℃、10min和90℃、5min的处理后地衣芽孢杆菌HDRaBLp存活率也能达到90％以上。并且在经过90℃、10min的处理后的存活率亦达到85％。说明本发明分离的地衣芽孢杆菌HDRaBLp能耐受高温。

表6地衣芽孢杆菌株HDRaBLp对高温的耐受性

二、生长曲线的测定

将活化好的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp按1％的接种量接入LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔2h取样，以平板计数估算其生长状况；以时间为横坐标，以细菌总数的对数值为纵坐标绘制生长曲线。

本发明的地衣芽孢杆菌菌株基本无迟缓期，很快进入对数增长期(0h～6h)，6h后进入稳定期，一直持续到18h，细菌数达到最大为2.35×10⁹CFU/mL。说明本发明地衣芽孢杆菌菌株具有较强的繁殖能力，其生长曲线见图5及表7。

表7地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同时间的生长情况

实施例4：地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产酶特性

一、地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp定性产酶试验

(一)地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产纤维素酶的定性试验

配置产纤维素酶定性培养基，于121℃，30min灭菌，制备定性平板。用无菌接种环将地衣芽孢杆菌接种至平板上，3菌/平板，待测菌株做3个重复，于37℃倒置培养72h。向培养好的平板中加入2ml0.2％的刚果红试剂，缓慢转动至溶液均匀覆盖平板表面，静置显色30min，倒出显色液，再加入3ml0.9％的NaCl洗脱液，轻旋至均匀覆盖平板表面，洗脱处理15min，以5％的醋酸钠溶液固定处理10min。菌落产纤维素酶分解菌落周围的大分子纤维素钠，刚果红无法与大分子纤维素钠结合而被洗脱，产生黄褐色显色圈。观察并记录平板上产显色圈情况，计算显色圈直径/菌圈直径的校正圈菌比。结果显示地衣芽孢杆菌株HDRaBLp圈菌参照比大于5.0(见表8和图6)，表明本发明分离的地衣芽孢杆菌菌株具有较好的产纤维素酶能力。

表8地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产纤维素酶定性检测透明圈-圈菌直径比

(二)地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产淀粉酶的定性试验

按照微生物学常规方法配制产淀粉酶定性培养基，于121℃，灭菌30min，制备成定性平板。用无菌接种环将地衣芽孢杆菌接种至于平板上，3个菌点/平板，待测菌株做3个重复，于37℃倒置培养24h。向培养好的培养基中加入1ml的碘液，轻旋至碘液均匀覆盖平板，静置1min观察结果，菌株产淀粉酶分解菌落周围的淀粉，使之不能与碘结合，所以碘液染色的蓝紫色平板上出现透明显色圈。观察并记录平板上产显色圈情况，计算显色圈直径/菌圈直径的校正圈菌比。结果显示地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp圈菌参照比为4.58(见表9和图6)，表明本发明的地衣芽孢杆菌菌株具有较好的产淀粉酶能力。

表9地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产淀粉酶定性检测透明圈-圈菌直径比

(三)地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp产蛋白酶的定性试验

按照微生物学常规方法配制产蛋白酶定性培养基，于121℃，灭菌30min，制备成定性平板。用无菌接种环将地衣芽孢杆菌接种至于平板上，3个菌点/平板，待测菌株做3个重复，于37℃倒置培养48h，菌株产酶分解酪素则平板上出现透明圈，观察并记录平板上产透明圈情况，计算透明圈直径/菌圈直径的校正圈菌比。结果显示地衣芽孢杆菌株HDRaBLp圈菌参照比为4.63(见表10和图6)，表明其具有较好的产蛋白酶能力。

表10地衣芽孢杆菌株HDRaBLp产蛋白酶定性检测透明圈-圈菌直径比

二、地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp定量产酶试验

1.活化：接种1-2环地衣芽孢杆菌于50ml活化的培养基中，37℃，200r/min培养18h。

2.培养：取5.00ml活化好的菌液，12000r/min离心2min，弃上清，将沉淀用无菌水调节OD值至0.5左右(约5×10⁷CFU/mL)，接种至121℃，30min灭菌的菜粕、豆柏、麸皮、棉粕固体发酵培养基中，接种量1ml/瓶。振荡混合，使接种菌液与培养基充分接触。将接种好的培养基于37℃培养箱静置培养48h。

3.粗酶提取：取培养好的固体培养物2.500g，加入pH 6.7磷酸缓冲液25.00ml，200r/min摇床中振荡30min后，4000r/min离心5min，取上清液为粗酶液，测定其中纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的酶活。

4.依据中华人民共和国国家标准和相关的企业标准，利用酶制剂的检测方法分别测定纤维素酶(企业标准QB 2583-2005)、淀粉酶(中华人民共和国国家标准GBT24401-2009)、蛋白酶(中华人民共和国国家标准GBT 23527-2009)的酶活。

结果显示，本发明分离的地衣芽孢杆菌株HDRaBLp具有一定的产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶能力，具体数据见表11。

表11地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料原料培养条件下产酶能力

实施例5：地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp在不同饲料中消化对比试验

一、菌株培养

地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp经LB固体培养基斜面活化后转接LB液体培养基振荡培养。振荡培养条件为37℃，200r/min；培养20h后，12000r/min，离心2min，将沉淀转入0.4％的50mL CaCl₂溶液中于37℃，200r/min条件下饥饿诱导至90％以上营养体转化为芽孢。最后调节OD值至0.5左右，备用。

二、模拟消化试验

分别称取棉粕、菜粕、豆粕和麸皮10g于250ml的三角瓶中，灭菌后加入50ml的无菌水后用HCl溶液调节pH至3.0，加入备用的菌液1ml，摇匀后静置30min后，使用NaOH调节pH至6.7±0.1，加入0.05％的胆酸盐，37℃，50r/min条件下培养，72h后分别测定不同培养基内的还原糖含量、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量、蛋白质的消化量以及物质损失量。

三、各类指标的测定

(一)还原糖的测定(按常规方法)

3，5-二硝基水杨酸钠(DNS)比色法测定：体外消化完成后过滤的滤液，取0.5ml于25ml比色管中，加入pH6.7的磷酸缓冲溶液2ml以及DNS溶液3ml，沸水浴10min，定容至25ml，540nm条件下比色。根据测得的吸光度在标准工作曲线中查得还原糖浓度，将单位换算成每克饲料中含有的还原糖的毫克数。结果显示，棉粕、菜粕、豆粕、麸皮组的还原糖含量都有所提升；其中，豆粕组与麸皮组提升量较大，在豆粕组中，HDRaBLp的还原糖含量相较于对照组提升了179.6％。而在麸皮组中，HDRaBLp菌株的还原糖含量相较于对照组提升了257.7％(表12)。

表12地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的还原糖含量

(二)可溶性蛋白含量的测定

参考博士德公司BCA试剂盒产品说明书进行可溶性蛋白含量的检测，依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。结果显示(见表14)，棉粕、菜粕、豆粕、麸皮组的可溶性蛋白含量均有较大提升，其中，HDRaBLp在菜粕组和豆粕组中消化后的可溶性蛋白含量相较于其他两组提升较高。

表14地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的可溶性蛋白含量

(三)福林酚法测定游离氨基酸的含量(参考中华人民共和国国家标准GBT 23527-2009)

取1mL适当稀释的滤液，加入2mL浓度为65.4g/L的三氯乙酸溶液，充分震荡后4000r/min，离心5min，取1mL上清液，加入5ml浓度为44.2g/L的Na₂C0₃溶液以及1mL的福林酚使用液，混匀后置于40℃水浴20min，680nm条件下比色，根据吸光度测得的吸光度在标准工作曲线上查得酪氨酸质量浓度。将单位换算成每克饲料中含有的氨基酸的毫克数。结果显示(表15)，其中，地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在麸皮组中消化后的游离氨基酸含量提升较大，比对照组提升了91.5％。

表15地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的游离氨基酸含量

(四)地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的蛋白质量差试验

鉴于福林酚试剂能够与酪氨酸、色氨酸等含酚基氨基酸反应显色，同一种饲料原料中蛋白质组成与氨基酸组成基本稳定，根据中国饲料原料数据库中不同的饲料原料蛋白质含量与酪氨酸、色氨酸含量，将福林酚法重测定的氨基酸的增加量换算，可以得到消化蛋白的量。结果显示，豆粕和麸皮两种饲料原料的蛋白质消化效果明显(表16)。

表16地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的蛋白质量差

(五)消化后固形物含量的测定方法以及物质损失率的计算

将地衣芽孢杆菌株HDRaBLp处理后的饲料原料过滤，滤出物于60℃烘干后105℃，2h烘干至恒重，称量，计算不同饲料中的物质损失，其中：

固形物损失量＝空白组干重-处理组干重

物质损失量＝固形物损失量-消化多糖-消化蛋白-可溶性蛋白

物质损失率＝物质损失量/原饲料干重

通过以上方法计算得出的物质损失率如表17所示。结果显示，棉粕组物质损失率最低。

表17地衣芽孢杆菌株HDRaBLp在不同饲料中消化前后的物质损失率(％)

本实施例旨在筛选出具有良好产酶能力并且可作为饲料添加剂的地衣芽孢杆菌菌株。

饲料品质包括化学成分组成、消化率、转化率等。王敏玲指出评价饲料营养价值的综合指标包括家畜活体消化率或体外消化率(王敏玲，2011)。

本实施例中，向不同饲料中添加地衣芽孢杆菌株HDRaBLp进行体外消化试验，结果显示，地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp对于饲料营养的消化吸收具有一定的促进作用。添加地衣芽孢杆菌HDRaBLp后，还原糖含量有明显提升，与对照组相比提升了60.0％～257.7％。可溶性蛋白含量与对照组相比提升了44.1％～160.0％。消化后的游离氨基酸含量相对于对照组提升了17.1％～91.5％。地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp在豆粕和麸皮两种饲料中蛋白质消化效果明显。物质损失率结果也显示本发明分离的地衣芽孢杆菌株HDRaBLp作为饲料添加剂添加到棉粕、菜粕、豆粕和麸皮等饲料中的物质损失率均较低。

参考文献

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株高产复合酶的益生地衣芽孢杆菌的筛选及应用

<141> 2018-04-18

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1579

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1579)

<400> 1

gccaagcttg catgcctgca ggtcgacgat ttacggctac cttgttacga cttcacccca 60

atcatctgtc ccaccttcgg cggctggctc caaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 120

acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 180

atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc 240

cgaactgaga acagatttgt gggattggct tagcctcgcg gcttcgctgc cctttgttct 300

gcccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 360

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac 420

taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 480

gacaaccatg caccacctgt cactctgccc ccgaagggga agccctatct ctagggttgt 540

cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 600

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca 660

ggcggagtgc ttaatgcgtt tgctgcagca ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc 720

actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 780

gcgcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc 840

tctacgcatc tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc 900

agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc 960

ctgcgcgcgc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 1020

ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggta ccgccctatt 1080

cgaacggtac ttgttcttcc ctaacaacag agttttacga tccgaaaacc ttcatcactc 1140

acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc 1200

gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac 1260

gcatcgtcgc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct 1320

gtaagtggta gctaaaagcc accttttata attgaaccat gcggttcaat caagcatccg 1380

gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac 1440

tcacccgtcc gccgctgaca tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg acttgcatgt 1500

attaggcacg ccgccagcgt tcgttctgag ccaggatcaa actctaatct ctagaggatc 1560

cccgggtacc gagctcgaa 1579

Claims (5)

1.一种具有高产复合酶的对畜禽肠道致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌有明显抑菌效果的地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus Licheniformis)HDRaBLp，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016300。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp，其特征在于：所述的菌株耐受胃酸低pH值及肠道胆盐高渗透压。

3.如权利要求1或2所述的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp，其特征在于：所述的菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶。

4.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp在制备畜禽饲用微生物添加剂中的应用。

5.包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株HDRaBLp的畜禽饲用微生物添加剂。