CN113789281A - 一种提高产蛋性能和蛋品质的益生菌及其应用 - Google Patents

一种提高产蛋性能和蛋品质的益生菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高产蛋性能和蛋品质的益生菌及其应用。具体地，本发明提供一种唾液乳杆菌，所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivarius AHXMS‑1，保藏号：CGMCC No.17718。本发明所所述的唾液乳杆菌(CGMCC No.17718)具有优异的产生消化酶和有机酸特性，能够提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质。

Description

一种提高产蛋性能和蛋品质的益生菌及其应用
技术领域
本发明涉及畜牧业领域，具体地，本发明涉及一种提高产蛋性能和蛋品质的益生菌及其应用。
背景技术
鸡蛋是补充蛋白的重要食品，然而，随着蛋鸡的日龄增加，420日龄后，蛋鸡进入老龄化，产蛋率和蛋品质随日龄增加逐渐下降，鸡由于低产或停产等原因被淘汰。鸡老龄化后产蛋性能下降受到多种因素的影响，例如，老龄化的蛋鸡不仅肠道对营养物质的吸收与青年期相比会减弱，同时对钙的吸收减弱，钙在机体的沉积会逐渐下降，导致鸡蛋品质、蛋壳厚度和强度会逐渐减弱。还有，老龄化的蛋鸡的肠道生理功能逐渐退化，道菌群结构单一化、条件致病菌数量增多等等，何延长蛋鸡的高产日龄和蛋品质来提高经济价值成为家禽养殖业研究热点。
因此，本领域需要开发一种提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质的方法。
本发明的第一方面提供了一种唾液乳杆菌，所述的唾液乳杆菌为Lactobacillussalivarius AHXMS-1，保藏号：CGMCC No.17718。
优选地，所述的唾液乳杆菌产生消化酶和/或有机酸。
优选地，所述的消化酶选自下组的酶：α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，或其组合。
优选地，α-淀粉酶的活力为825-850U/mL，较佳地825-840U/mL。
优选地，β-淀粉酶的活力为230-250U/mL，较佳地230-240U/mL。
优选地，蛋白酶的活力160-190U/mL，较佳地160-170U/mL。
优选地，脂肪酶的活力为300-330U/mL，较佳地300-315U/mL。
优选地，所述的α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养15-17h后，离心，收集上清液，测定α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶和/或蛋白酶的活力
优选地，所述的α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，3000转/分钟离心发酵液10分钟，收集上清液，弃细菌，测定α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力。
优选地，所述的有机酸包括乳酸。
优选地，所述的乳酸包括D-乳酸。
优选地，有机酸的含量为2.9-3.3x10-3mol/L，较佳地3.0-3.2x10-3mol/L。
优选地，乳酸的含量为2.0-3.0x10-3mol/L，较佳地2.1-2.3x10-3mol/L。
优选地，所述的有机酸的含量通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养15-17h后，测定发酵液中的有机酸含量。
优选地，所述的有机酸的含量通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，测定发酵液中的有机酸含量。
优选地，所述发酵液的pH为酸性。
优选地，所述发酵液的pH为3-4，较佳地3.4-3.6。
本发明的第二方面提供一种组合物，所述的组合物包括如本发明的第一方面所述的唾液乳杆菌。
优选地，所述的唾液乳杆菌的含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-70wt％，更佳地0.05-40wt％，更佳地0.05-10wt％，按组合物的总重量计。
优选地，所述的组合物为饲料组合物。
优选地，所述的饲料包括家禽饲料。
优选地，所述的家禽包括鸡、鸭和/或鹅。
优选地，所述的鸡包括罗曼褐壳蛋鸡。
优选地，所述的组合物还包括饲料上可接受的载体。
优选地，所述的饲料上可接受的载体包括基础日粮。
优选地，所述的基础日粮参照美国国家研究委员会(NRC，1998)标准和/或国内蛋鸡词养标准NY/T33-2004配制。
优选地，所述的基础日粮包括如下组分：
基础日粮组分 用量
玉米 58-62重量份
豆粕 25-27重量份
石粉 6-8重量份
磷酸氢钙 0.9-1.3重量份
食盐 0.25-0.33重量份；和
预混料* 4.5-5.5重量份。
优选地，预混料为每千克饲粮提供：VA 8900-9100IU，VD3 2000-2200IU，VE 9-11IU，VK3 1.0-1.4mg，硫胺素1.3-1.7mg，核黄素2.8-3.2mg，VB6 1.6-2.0mg，VB12 0.008-0.012mg，生物素0.10-0.14mg，叶酸0.3-0.4mg，烟酸23-27mg，泛酸2.3-2.7mg，氯化胆碱590-610mg，Mn 95-105mg，Zn 75-85mg，Cu 7.8-8.2mg，I 0.13-0.17mg，Se 0.13-0.17mg，Fe75-85mg。
优选地，所述的基础日粮中的营养成分包括代谢能ME(MJ/kg)、粗蛋白、钙、总磷、可利用磷、赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。
优选地，所述的代谢能ME(MJ/kg)的含量为11-13％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的粗蛋白的含量为16-18％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的钙的含量为3.5-4.5％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的总磷的含量为0.6-0.8％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的可利用磷的含量为0.4-0.6％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的赖氨酸的含量为0.7-0.9％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的苏氨酸的含量为0.4-0.6％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的蛋氨酸的含量为0.5-0.7％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的组合物的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为饲喂(或口服)组合物。
优选地，所述的组合物还包括地衣芽孢杆菌，所述的地衣芽孢杆菌为Bacilluslicheniformis yb-2，保藏号：CGMCC No.14245。
优选地，所述的地衣芽孢杆菌的含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-70wt％，更佳地0.05-40wt％，更佳地0.05-10wt％，按组合物的总重量计。
优选地，所述的唾液乳杆菌与所述地衣芽孢杆菌的含量之比为(0.5-10):1，较佳地(0.5-5):1，更佳地(0.5-4):1，更佳地(1-3):1，更佳地(1-2):1，更佳地(1.3-1.7):1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的含量之比包括数量之比。
优选地，所述的含量的单位为CFU/g，即每g组合物中含菌数CFU。
本发明的第三方面提供一种活菌组合，所述的活菌组合包括如本发明的第一方面所述的唾液乳杆菌；和地衣芽孢杆菌；
所述的地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis yb-2，保藏号：CGMCCNo.14245。
优选地，所述的唾液乳杆菌与所述地衣芽孢杆菌的含量之比为(0.5-10):1，较佳地(0.5-5):1，更佳地(0.5-4):1，更佳地(1-3):1，更佳地(1-2):1，更佳地(1.3-1.7):1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的含量之比包括数量之比。
本发明的第四方面提供一种如本发明的第一方面所述的唾液乳杆菌、如本发明的第二方面所述的组合物、和/或如本发明的第三方面所述的活菌组合的用途，用于制备饲料，所述的饲料用于选自下组的一种或多种用途：(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性。
优选地，所述的饲料包括家禽饲料。
优选地，所述的饲料还包括基础日粮。
优选地，所述的饲料还包括饲料上可接受的载体。
优选地，所述的饲料为饲喂饲料。
优选地，所述的家禽包括育雏期家禽。
优选地，所述的家禽包括产蛋家禽。
优选地，所述的家禽包括鸡、鸭和/或鹅。
优选地，所述的鸡包括罗曼褐壳蛋鸡。
优选地，所述的家禽包括老龄家禽。
优选地，所述的家禽的日龄大于60周龄，较佳地60-80周龄，更佳地60-72周龄。
优选地，所述的(i)提高家禽的产蛋性能包括：
(i-1)提高产蛋率；
(i-2)提高产蛋重；
(i-3)降低料蛋比；
(i-4)降低软壳蛋率；和/或
(i-5)降低畸形蛋率。
优选地，所述的(ii)提高家禽的蛋品质包括：
(ii-1)提高蛋壳厚度；
(ii-2)提高蛋壳强度；
(ii-3)提高蛋的蛋白高度；
(ii-4)提高哈夫单位；和/或
(ii-5)提高蛋孵化率。
优选地，所述的(iv)改善家禽的肠道菌群多样性包括：
(iv-1)提高肠道中促消化菌属的数量；
(iv-2)提高肠道中促消化菌属的种类；
优选地，所述的促消化菌属选自下组：瘤胃球菌(Ruminococcaceae、Ruminococcus]_torques_group)、瘤胃球菌(Ruminococcaceae UCG-005)、粪杆菌(Faecalibacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)，或其组合。
优选地，所述的肠道包括小肠和/或盲肠。
本发明的第五方面提供一种(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性的方法，所述的方法包括步骤：给家禽饲喂如本发明的第一方面所述的唾液乳杆菌、如本发明的第二方面所述的组合物、和/或如本发明的第三方面所述的活菌组合。
在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1为Lactobacillus salivarius AHXMS-1产酶效果。
图2为Bacillus licheniformis yb-2产酶效果。
图3为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1产生溶钙区域。
图4为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2不产生溶钙区域
图5为各组蛋鸡盲肠菌群多样性结构Venn图，其中Y1、Y2、Y3、Y4和Y5分别为对应试验Ⅰ组、试验ⅠI组、试验IIⅠ组、试验ⅠV组和试验V组。
图6为盲肠菌群差异分析(属水平)，其中Y1、Y2、Y3、Y4和Y5分别对应为试验Ⅰ组、试验ⅠI组、试验IIⅠ组、试验ⅠV组和试验V组。
具体实施方式
本发明开发一种唾液乳杆菌(CGMCC No.17718)，所述的唾液乳杆菌(CGMCCNo.17718)能够提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质，且与地衣芽孢杆菌(CGMCC No.14245)具有协同提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质。
术语
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，“唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1”与“Lactobacillus salivarius AHXMS-1”可互换使用。
如本文所用，“地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2”与“Bacilluslicheniformis yb-2”可互换使用。
唾液乳杆菌
本发明提供一种唾液乳杆菌，所述的唾液乳杆菌具有优异的产生消化酶和有机酸特性，能够提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质。
本发明所述的唾液乳杆菌优选为Lactobacillus salivarius AHXMS-1，保藏号：CGMCC No.17718。
在本发明一个优选例中，所述的唾液乳杆菌产生消化酶和/或有机酸。
在本发明一个优选例中，所述的消化酶选自下组的酶：α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，或其组合。
优选地，α-淀粉酶的活力为825-850U/mL，较佳地825-840U/mL。
优选地，β-淀粉酶的活力为230-250U/mL，较佳地230-240U/mL。
优选地，蛋白酶的活力160-190U/mL，较佳地160-170U/mL。
优选地，脂肪酶的活力为300-330U/mL，较佳地300-315U/mL。
优选地，所述的α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养15-17h后，离心，收集上清液，测定α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶和/或蛋白酶的活力
优选地，所述的α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，3000转/分钟离心发酵液10分钟，收集上清液，弃细菌，测定α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶和/或脂肪酶的活力。
在本发明一个优选例中，所述的有机酸包括乳酸。
优选地，所述的乳酸包括D-乳酸。
优选地，有机酸的含量为2.9-3.3x10-3mol/L，较佳地3.0-3.2x10-3mol/L。
优选地，乳酸的含量为2.0-3.0x10-3mol/L，较佳地2.1-2.3x10-3mol/L。
优选地，所述的有机酸的含量通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养15-17h后，测定发酵液中的有机酸含量。
优选地，所述的有机酸的含量通过以下方法测定：
将唾液乳杆菌接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，测定发酵液中的有机酸含量。
优选地，所述发酵液的pH为酸性。
优选地，所述发酵液的pH为3-4，较佳地3.4-3.6。
家禽
本发明所述的家禽可以包括包括鸡、鸭和/或鹅。
在本发明一个优选例中，所述的鸡包括罗曼褐壳蛋鸡。
在本发明一个优选例中，所述的家禽包括育雏期家禽。
在本发明一个优选例中，所述的家禽包括老龄家禽。
在本发明一个优选例中，所述的家禽的日龄大于60周龄，较佳地60-80周龄，更佳地60-72周龄。
基础日粮
本发明所述的基础日粮优选参照美国国家研究委员会(NRC，1998)标准和/或国内蛋鸡词养标准NY/T33-2004配制。
在本发明一个优选例中，所述的基础日粮包括如下组分：
基础日粮组分 用量
玉米 58-62重量份
豆粕 25-27重量份
石粉 6-8重量份
磷酸氢钙 0.9-1.3重量份
食盐 0.25-0.33重量份；和
预混料* 4.5-5.5重量份。
优选地，预混料为每千克饲粮提供：VA 8900-9100IU，VD3 2000-2200IU，VE 9-11IU，VK3 1.0-1.4mg，硫胺素1.3-1.7mg，核黄素2.8-3.2mg，VB6 1.6-2.0mg，VB12 0.008-0.012mg，生物素0.10-0.14mg，叶酸0.3-0.4mg，烟酸23-27mg，泛酸2.3-2.7mg，氯化胆碱590-610mg，Mn 95-105mg，Zn 75-85mg，Cu 7.8-8.2mg，I 0.13-0.17mg，Se 0.13-0.17mg，Fe75-85mg。
优选地，所述的基础日粮中的营养成分包括代谢能ME(MJ/kg)、粗蛋白、钙、总磷、可利用磷、赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。
优选地，所述的代谢能ME(MJ/kg)的含量为11-13％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的粗蛋白的含量为16-18％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的钙的含量为3.5-4.5％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的总磷的含量为0.6-0.8％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的可利用磷的含量为0.4-0.6％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的赖氨酸的含量为0.7-0.9％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的苏氨酸的含量为0.4-0.6％，以营养成分的含量计。
优选地，所述的蛋氨酸的含量为0.5-0.7％，以营养成分的含量计。
组合物
本发明还提供一种组合物，所述的组合物包括本发明所述的唾液乳杆菌。
在本发明一个优选例中，所述的唾液乳杆菌的含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-70wt％，更佳地0.05-40wt％，更佳地0.05-10wt％，按组合物的总重量计。
本发明所述的组合物优选为饲料组合物。
优选地，所述的组合物还包括饲料上可接受的载体。
术语“饲料上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于家禽使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和。
优选地，所述的饲料上可接受的载体包括基础日粮。
优选地，所述的组合物的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为饲喂(或口服)组合物。
优选地，所述的组合物还包括地衣芽孢杆菌，所述的地衣芽孢杆菌为Bacilluslicheniformis yb-2，保藏号：CGMCC No.14245。
优选地，所述的地衣芽孢杆菌的含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-70wt％，更佳地0.05-40wt％，更佳地0.05-10wt％，按组合物的总重量计。
优选地，所述的唾液乳杆菌与所述地衣芽孢杆菌的含量之比为(0.5-10):1，较佳地(0.5-5):1，更佳地(0.5-4):1，更佳地(1-3):1，更佳地(1-2):1，更佳地(1.3-1.7):1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的含量之比包括数量之比。
优选地，所述的含量的单位为CFU/g，即每g组合物中含菌数CFU。
本发明还提供一种活菌组合，所述的活菌组合包括如本发明所述的唾液乳杆菌；和地衣芽孢杆菌；
所述的地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis yb-2，保藏号：CGMCCNo.14245。
优选地，所述的唾液乳杆菌与所述地衣芽孢杆菌的含量之比为(0.5-10):1，较佳地(0.5-5):1，更佳地(0.5-4):1，更佳地(1-3):1，更佳地(1-2):1，更佳地(1.3-1.7):1，最佳地1.5:1。
用途
本发明提供一种本发明所述的唾液乳杆菌、本发明所述的组合物、和/或本发明所述的活菌组合的用途，用于制备饲料，所述的饲料用于选自下组的一种或多种用途：(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性。
在本发明的一个优选例中，所述的饲料包括家禽饲料。
优选地，所述的饲料还包括基础日粮。
优选地，所述的饲料还包括饲料上可接受的载体。
优选地，所述的饲料为饲喂饲料。
在本发明的一个优选例中，所述的(i)提高家禽的产蛋性能包括：
(i-1)提高产蛋率；
(i-2)提高产蛋重；
(i-3)降低料蛋比；
(i-4)降低软壳蛋率；和/或
(i-5)降低畸形蛋率。
在本发明的一个优选例中，所述的(ii)提高家禽的蛋品质包括：
(ii-1)提高蛋壳厚度；
(ii-2)提高蛋壳强度；
(ii-3)提高蛋的蛋白高度；
(ii-4)提高哈夫单位；和/或
(ii-5)提高蛋孵化率。
在本发明的一个优选例中，所述的(iv)改善家禽的肠道菌群多样性包括：
(iv-1)提高肠道中促消化菌属的数量；
(iv-2)提高肠道中促消化菌属的种类；
优选地，所述的促消化菌属选自下组：瘤胃球菌(Ruminococcaceae、Ruminococcus]_torques_group)、瘤胃球菌(Ruminococcaceae UCG-005)、粪杆菌(Faecalibacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)，或其组合。
优选地，所述的肠道包括小肠和/或盲肠。
本发明还提供一种(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性的方法，所述的发方法包括步骤：给家禽饲喂如本发明所述的唾液乳杆菌、本发明所述的组合物、和/或本发明所述的活菌组合。
菌种保藏
本发明的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1(与保藏名称相同)已于2019年05月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC No.17718。
本发明的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2(与保藏名称相同)已于2017年06月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC No.14245。
本发明的主要优异技术效果包括：
本发明提供一种唾液乳杆菌(CGMCC No.17718)，所述的唾液乳杆菌(CGMCCNo.17718)具有优异的产生消化酶和有机酸特性，能够提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质，且与地衣芽孢杆菌(CGMCC No.14245)具有协同提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质，从而提高老龄蛋鸡的产蛋性能和蛋品质的方法，提高蛋鸡的经济价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
1.益生菌菌种益生特性的评价
1)菌种
研究组从健康鸡肠道内分离多株益生菌，后经过产消化酶评价、产有机酸评价评价，得到2株益生芽孢杆菌，分别为唾液乳杆菌和地衣芽孢杆菌，申请中国微生物菌种保藏管理中心专利保藏，分别为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2，保藏编号分别为CGMCC No.17718、CGMCC No.14245。
2)菌种产消化酶评价
A.定性检测
制备液态营养琼脂培养基，将Lactobacillus salivarius AHXMS-1和Bacilluslicheniformis yb-2接种于培养基中培养16h后，3000转/分钟离心发酵液10分钟，收集上清液，弃细菌，每株菌制备8个平行样品。采用牛津杯法检测发酵液样品的消化酶。制备营养琼脂固态培养基上，摆放3-4只牛津杯于平板上，分别向牛津杯中加入100uL发酵液，培养20h后观察结果。
结果表明：在Lactobacillus salivarius AHXMS-1和Bacillus licheniformisyb-2的菌落周围有白色圆形区域，奶粉中富含蛋白、乳糖和脂肪，证实2种益生菌自身能产生蛋白酶、乳糖酶和脂肪酶。如下图1和图2所示，蓝色箭头所示。圆形区域直径越大，产酶能力越强。
B.定量检测
分别制备乳酸细菌培养基(MRS)或营养琼脂培养基，将Lactobacillussalivarius AHXMS-1和Bacillus licheniformis yb-2接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，3000转/分钟离心发酵液10分钟，收集上清液，弃细菌，每株菌制备8个平行样品。检测发酵液上清中α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、脂肪消化酶的活力，用于检测的试剂盒是购买于南京建成生物工程研究所。
结果表明：Lactobacillus salivarius AHXMS-1和Bacillus licheniformis yb-2的α-淀粉酶活力依次分别为828.41U/mL、588.96U/mL，β-淀粉酶活力依次分别为231.45U/mL、147.23U/mL，蛋白酶活力依次分别为164.47U/mL、198.89U/mL；脂肪酶活力依次分别为306.7U/mL、698.29U/mL。
3)产有机酸评价
A.定性检测
分别将Lactobacillus salivarius AHXMS-1和Bacillus licheniformis yb-2接种于MRS或营养琼脂液态培养基中活化培养16h后，分别将Lactobacillus salivariusAHXMS-1划线接种到含碳酸钙的MRS固态平板，将Bacillus licheniformis yb-2接种营养琼脂固态培养基中，观察结果。
结果表明：在Lactobacillus salivarius AHXMS-1细菌生长的周围，出现溶钙区域，蓝色箭头所示(如图3所示)；而Bacillus licheniformis yb-2周围却没有出现(如图4所示)。
有机酸能够与MRS培养基中碳酸钙起反应，形成可溶性的钙离子，降低MRS平皿的透光度。如果菌体不能分泌产生有机酸，不会产生空白溶钙区域。
B.定量检测
将Lactobacillus salivarius AHXMS-1和Bacillus licheniformis yb-2接种于MRS或营养琼脂液态培养基中培养16h后，使用精密pH计，测定发酵液中的pH值。D-乳酸测定试剂盒，生产厂家为南京建成生物工程研究所
结果表明：唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1发酵液pH值为3.49，有机酸含量达到3.09x10-3mol/L，D-乳酸含量为2.19x10-3mol/L。而枯草芽孢杆菌Bacilluslicheniformis yb-2不产有机酸，发酵液pH与原始pH相差不大，为7.0。
经过产酶和产有机酸检测可知，唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1既可以产生消化酶又能产生有机酸。所产生的消化酶可将饲料中营养物质降解，帮助蛋鸡消化与营养物质吸收。
2.固态复合益生菌制剂的制备
1)菌种
选择中国微生物菌种保藏管理中心专利保藏，分别为唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2，保藏编号分别为CGMCC No.17718、CGMCC No.14245。
2)菌种的活化与种子液的获得
将保存在4℃的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2接种于MRS和营养琼脂液体培养基上，37℃培养14h，如此连续活化3次后，得到益生菌种子液。
3)生产
将唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis yb-2种子液接种于培养基中。为了保证罗伊氏乳杆菌的营养需要，如碳源、氮源、生长促进因子，及便于吸附、成型，并综合考虑经济成本。经过反复试验得出其组分：玉米粉150g，麸皮780g，红糖50g，尿素20g。
采用2次接种发酵：首先接种400mL地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2种子液至上述1000g固体培养基中，发酵12-14h。后将发酵液与1000g新鲜固态培养基混合，接种500mL唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1种子液搅拌均匀后，37℃再次发酵16-18h。
二次发酵优点与意义：改善添加剂的菌种组成；改善发酵品的气味，具有酸甜味，提高发酵品的适口性，后加入乳酸菌，降低2种细菌之间的营养竞争，提供乳酸菌活菌数量，更有效降低发酵品的pH，不利于霉菌生长，便于贮藏与保存。
4)烘干与贮藏
将固态发酵成熟的复合益生菌制剂，放入恒温干燥箱中过夜烘干，摊开，使厚度不超过6厘米。用透气编织袋，装袋。室温、阴凉、干燥处保存，得到固态复合益生菌制剂。
5)产品活菌数
采用梯度稀释法进行活菌计数。分别使用MRS和营养琼脂平板，计数产品中唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2的活菌数量，结果2种细菌数量皆达到109活菌单位每克(CFU/g)。
6)货架时间
分别在产品贮藏至45天、90天后采集样品，按第5步方法，检测唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2的活菌数量。结果表明30天后活菌数为1.3±0.2×109CFU/g、1.7±0.3×109CFU/g，90天后活菌数为7.6±0.3×109CFU/g、1.1±0.2×109CFU/g。数量均超过国家饲用微生态添加剂活菌含量要求(>108CFU/g)。
3.固态复合益生菌制剂延长蛋鸡高产日龄、提高蛋品质的效果
1)试验动物及分组
选将体重均匀(1.62–1.67kg)的540只420日龄的罗曼褐壳蛋鸡，随机分成5组，每组108只(每组9个重复，每个重复12只)。分别为对照组(试验Ⅰ)、地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis yb-2组(自制，试验Ⅱ)、唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1组(自制，试验Ⅲ)、复合益生菌组(自制，含唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2，试验Ⅳ)、抗生素组(黄霉素，试验Ⅴ)。基础日粮参照美国国家研究委员会(NRC，1998)标准及中华人们共和国农业行业标准(蛋鸡词养标准，NY/T33-2004)蛋鸡营养需要配合而成，日粮组成及营养水平见表1。添加量皆为0.3％，使基础日粮中的活菌总数量达到5.0×106CFU/mL，见表2所示。饲喂方式：将益生菌制剂混入蛋鸡饲料中。黄霉素是蛋鸡饲料允许添加的抗生素，具有提高蛋鸡产蛋性能和蛋品质的功能，为阳性对照组。
有提高蛋鸡产蛋性能和蛋品质的功能，为阳
表1 AA蛋鸡基础日粮的配方组成％
Figure BDA0003269649660000141
Figure BDA0003269649660000151
a预混料为每千克饲粮提供：VA 9000IU，VD3 2100IU，VE 10IU，VK3 1.20mg，硫胺素thiamine 1.5mg，核黄素riboflavin 3.0mg，VB6 1.8mg，VB12 0.01mg，生物素biotin0.12mg，叶酸folic acid 0.35mg，烟酸nicotinic acid 25mg，泛酸pantothenic acid2.5mg，氯化胆碱choline chloride 600mg，Mn 100mg，Zn 80mg，Cu 8.0mg，I 0.15mg，Se0.15mg，Fe 80mg。
罗曼褐壳蛋鸡的试验期为60-72周龄，共12周，84天。每天观察试验蛋鸡的健康状况。环境一致，每日定时饲喂两次(早晨7:30，下午16:30)。试验期内定期消毒，疫苗注射及其它程序，同场内其它鸡群。
表2蛋鸡试验分组
Figure BDA0003269649660000152
2)测定指标
1、蛋鸡产蛋性能
每天记录每个组蛋鸡饲料消耗量、产蛋数量，记录软壳蛋和畸形蛋数量，称量每组产蛋蛋重，计算每个组料蛋比。
2、蛋品质
测量蛋壳厚度、蛋壳强度，蛋白高度、哈夫单位。
3、血浆钙含量
从蛋鸡翅静脉，采集血液，后3000转/min离心10分钟，收集血清，取1毫升血清加入10mL硝酸和1mL高氯酸，消化过夜，后用180℃沙浴热消化至消化液清亮。冷却后，加入1mol/L稀盐酸滴定至25毫升。采用ICAP-Q电感耦合等离子体光谱仪测定钙含量。每组9个重复。
4、肠道菌群多样性
无菌取72周龄蛋鸡盲肠，称取0.3g内容物，提取细菌总DNA，采用高通量二代测序法，检测菌群多样性，通过检测细菌核糖体DNA(16S rDNA)V3-V4区序列，明确肠道菌群多样性，益生菌添加对肠道菌群的改善作用。
5、数据分析
数据用SPSS17.0软件进行统计分析，差异显著者进行Duncan氏进行多重比较，以P<0.05作为差异显著，P<0.01作为差异极显著。
3)结果与讨论
3.1)产蛋性能
试验0-4周后，蛋鸡产蛋性能结果如表3所示。所有益生菌添加组产蛋率皆极显著提高(P<0.01)。地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2组中蛋鸡产蛋率极显著高于对照组(P<0.01)，唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1组与复合益生菌组、黄霉素组没有显著差异(P>0.05)。平均蛋重各组没有显著差异(P>0.05)，料蛋比结果为3个益生菌添加组和黄霉素组显著高于对照组(P<0.01)。各添加组软壳蛋率，极显著低于对照组(P<0.01)，唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1组、复合益生菌组和黄霉素组之间没有显著差异(P>0.05)，畸形蛋率的结果为黄霉素组最高，极显著高于对照组(P<0.01)，而各益生菌添加组极显著低于对照组(P<0.01)，复合益生菌组最低(P<0.01)。0-8周，各益生菌添加组与黄霉素添加组的产蛋率都极显著高于对照组(P<0.01)，料蛋比和软壳蛋率极显著低于对照组(P<0.01)。黄霉素组畸形蛋率极显著高于其他组(P<0.01)。0-12周，益生菌添加组与黄霉素添加组的产蛋率都极显著高于对照组(P<0.01)，料蛋比和软壳蛋率极显著低于对照组(P<0.01)。黄霉素组畸形蛋率极显著高于其他组(P<0.01)。
表3不同处理组蛋鸡产蛋性能
Figure BDA0003269649660000161
Figure BDA0003269649660000171
标注:同一栏肩标不同的大写字母表示差异极显著(P<0·01)。
复合益生菌添加后，使罗曼褐壳蛋鸡在68周龄内，产蛋率持续保持在86％以上，72周龄内产蛋率保持在82％，且唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2具有协同效果，唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2具有产消化酶的能力，能够帮助鸡消化饲料，促进肠道营养物质的吸收，提高蛋鸡产蛋性能，降低饲料料蛋比。
3.2)蛋品质
不同组的蛋品质结果如表4所示，在3个试验阶段，所有益生菌和黄霉素添加组中，蛋壳厚度与对照组相比无显著差异(P>0.05)。0-4周、0-8周内，蛋壳强度以复合益生菌组最高(P<0.05)，各益生菌和黄霉素添加组都显著高于对照组(P<0.05)。蛋白高度以黄霉素组最低(P<0.05)，各益生菌添加组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。哈夫单位以黄霉素组最低(P<0.05)，复合益生菌最高。0-12周内，蛋壳强度、蛋白高度和哈夫单位以复合益生菌组最高(P<0.05)，其他益生菌添加组和黄霉素组的蛋壳强度与对照组相比，无显著差异(P<0.05)，黄霉素组蛋白高度和哈夫单位最低(P<0.05)。
表4不同处理组蛋品质
Figure BDA0003269649660000172
Figure BDA0003269649660000181
标注:同一栏肩标不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同的大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
蛋清高度与哈夫单位可用于评价鸡蛋孵化率。蛋清高度与哈夫单位越高，孵化率越高。复合益生菌添加后，使罗曼褐壳蛋鸡在72周龄内，蛋壳强度持续高于对照组，对生产实践具有重大意义，保护鸡蛋运输，减少损失，且唾液乳杆菌Lactobacillus salivariusAHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2具有协同效果。唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2具有产消化酶的能力，同时唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1可分泌有机酸，所产生的有机酸可降解饲料中无机钙盐，变成游离钙，帮助钙吸收，便于钙在饲料中沉积，提高蛋壳强度。同时，添加复合益生菌后，提高了鸡蛋的孵化率，黄霉素添加后降低孵化率。
3.3)血浆钙含量
经等离子体测定血浆样品中无机钙的含量，结果如表5所示。0-4周、0-8周内，蛋鸡添加复合益生菌显著高于对照组(P<0.05)。0-12周，各组间无显著差异(P>0.05)。
表5各组蛋鸡血浆钙含量
Figure BDA0003269649660000191
标注:同一栏肩标不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。
唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis yb-2具有产消化酶的能力，且唾液乳杆菌Lactobacillus salivariusAHXMS-1可分泌有机酸，所产生的有机酸可降解饲料中无机钙，帮助钙吸收，提高血浆钙含量。在0-12周，血钙有上升趋势。血浆钙水平与蛋壳强度结果相吻合。
3.4)肠道菌群多样性
经肠道菌群多样性测序，5个组的盲肠菌群的多样性结果如图5所示。唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius AHXMS-1和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis yb-2肠道菌群多样性高于对照组，菌群OUT数量为343，黄霉素组为400，复合益生菌组数量为441，复合益生菌组，肠道菌群最优。黄霉素组没有显著差异(P>0.05)。Y1-Y5分别对应试验Ⅰ-Ⅴ组。
菌群差异分析如图6所示，对照组盲肠内以酵母菌属Candidatus_Arthromitus数量为主，而各益生菌和黄霉素添加组，菌群为多个菌分布为主。提高了促消化菌属的数量与种类，如瘤胃球菌(Ruminococcaceae、Ruminococcus]_torques_group)、瘤胃球菌(Ruminococcaceae UCG-005)、粪杆菌(Faecalibacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)的数量。
给老龄蛋鸡添加复合益生菌，可显著改善蛋鸡肠道内菌群结构和数量，修复老龄蛋鸡的肠道菌群结构的退化与萎缩；添加黄霉素也可以适当提高肠道菌群结构，但黄霉素会导致蛋鸡产畸形蛋的数量。造成抗生素残留，不利于消费者。
以上所述是本发明针对一种案例设计的实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种唾液乳杆菌，其特征在于，所述的唾液乳杆菌为Lactobacillus salivariusAHXMS-1，保藏号：CGMCC No.17718。
2.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括如权利要求1所述的唾液乳杆菌。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括地衣芽孢杆菌，所述的地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis yb-2，保藏号：CGMCC No.14245。
4.一种活菌组合，其特征在于，所述的活菌组合包括如权利要求1所述的唾液乳杆菌；和地衣芽孢杆菌；
所述的地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis yb-2，保藏号：CGMCC No.14245。
5.如权利要求3所述的组合物或如权利要求4所述的活菌组合，其特征在于，所述的唾液乳杆菌与所述地衣芽孢杆菌的含量之比为(0.5-10):1，较佳地(0.5-5):1，更佳地(0.5-4):1，更佳地(1-3):1，更佳地(1-2):1，更佳地(1.3-1.7):1，最佳地1.5:1。
6.如权利要求1所述的唾液乳杆菌、如权利要求2所述的组合物、和/或如权利要求4所述的活菌组合的用途，其特征在于，用于制备饲料，所述的饲料用于选自下组的一种或多种用途：(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的(i)提高家禽的产蛋性能包括：
(i-1)提高产蛋率；
(i-2)提高产蛋重；
(i-3)降低料蛋比；
(i-4)降低软壳蛋率；和/或
(i-5)降低畸形蛋率。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的(ii)提高家禽的蛋品质包括：
(ii-1)提高蛋壳厚度；
(ii-2)提高蛋壳强度；
(ii-3)提高蛋的蛋白高度；
(ii-4)提高哈夫单位；和/或
(ii-5)提高蛋孵化率。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的(iv)改善家禽的肠道菌群多样性包括：
(iv-1)提高肠道中促消化菌属的数量；
(iv-2)提高肠道中促消化菌属的种类。
10.一种(i)提高家禽的产蛋性能；(ii)提高家禽的蛋品质；(iii)提高家禽的血钙水平；和/或(iv)改善家禽的肠道菌群多样性的方法，其特征在于，给家禽饲喂如权利要求1所述的唾液乳杆菌、如权利要求2所述的组合物、和/或如权利要求4所述的活菌组合。
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