CN106509455A - 一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，首先分别在不同的环境下筛选出肠道益生菌，通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比较，并且在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。本发明促进了外源性益生菌在兔肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的生长和繁殖，减少了动物食用抗生素对兔肉质的影响，还能提高饲料的转化率、增加肉类品质和提高食品的安全质量，解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。

Description

一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法。

背景技术

目前，我国合生元微生态制剂在动物的生产中的应用研究还较少，畜牧业动物食用添加剂中微生态制剂的使用情况还较少，人们对微生态制剂适用添加比较模糊，即混淆有针对性的添加对象，导致动物生长的效果往往低于预期效果。微生态制剂的出现是由于人们生活水平的提高，人们逐渐认识到抗生素长期添加于饲料中可通过食物链对人类的健康造成危害。微生态制剂的研究应用克服了长期使用抗生素给养殖业造成的种种弊端，对发展绿色饲料添加剂具有广阔的应用前景，己被农业部列为二十一世纪重点推广技术项目。这意味着对微生态制剂的研究、推广符合我国可持续发展的总体要求。

现有的微生态制剂中菌株的稳定性没有得到很好的保证，投给菌必须以活菌的形式通过胃到达肠道代谢，并定居在肠道内培殖，这对一般的孢子形式的细菌来说是不易做到的；微生态制剂没有针对性的添加对象，国内对微生态制剂的应用还不够充分，推广度不够，被养殖户接受的程度不高为了解决滥用抗生素导致越来越多的致病菌产生抗药性，药物残留，降低兔肉产品品质以及由于食物链累积对人类身体健康带来的严重影响，生产替代抗生素的微生态制剂势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，旨在解决目前动物用合生元微生态制剂吸收利用率低，应用效果差的问题。

本发明是这样实现的，一种兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，首先分别在不同的环境下筛选出肠道益生菌，通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比较，并且在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。本发明是这样实现的，一种兔用复合型合生元微生态制剂，所述兔用复合型合生元微生态制剂由益生菌和益生元组成；

所述益生菌：益生元＝1:1～5的质量比比例混合。

进一步，所述益生菌由双歧杆菌、芽孢杆菌和粪肠球菌组成(标准菌株均购自北京北纳创联生物技术研究院)。

进一步，所述益生元由低聚糖和酸化剂组成；

所述低聚糖为木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖，酸化剂由乳酸、柠檬酸、延胡索酸组成的复合酸化剂。

进一步，所述益生菌为0.02-15g/kg，益生菌营养物质为0.05-80g/kg，低聚糖为0.01-90g/kg。

进一步，低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；添加由1份乳酸、3份柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂0.1％-0.5％(占微生态制剂比例)。

本发明的另一目的在于提供一种所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

首先针对性的分离、筛选出肠道益生菌，通过在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将适合兔胃、肠道的益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。

进一步，兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括：

步骤一、从兔的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌(粪链球菌)、枯草芽孢杆菌和双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

步骤二、利用兔肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质兔肠道益生菌；

步骤三、在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，进行更进一步的筛选，最终选取得到1株粪肠球菌(粪链球菌)、1株枯草芽孢杆菌和1株双歧杆菌；

步骤四、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；

步骤五、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；质量比0.1％-0.5％；

步骤六、将添加复合酸化剂后的3株益生菌与质量比5％的益生元(木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg)进行结合，配制出兔用复合型合生元微生态制剂。

进一步，步骤一中进行菌种的鉴定包括：

常规鉴定：芽孢杆菌繁殖快速，四小时增殖10万倍，生命力强无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。体积比一般病原菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。粪肠球菌为圆形或椭圆形、呈单个或成对或短链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。本菌对营养要求较高，要求高盐(6.5％NaCl),高碱(pH9.6),40％胆汁培养基和10-45℃环境下生长。

将双歧杆菌、芽孢杆菌和肠球菌益生菌和选择出的益生元有机结合起来，再加入有利于益生菌生长的营养物质，制成复合型合生元微生态制剂。

营养物质：由于兔属于哺乳类动物，所用稀释生理盐水与哺乳类、两栖动物略有区别，一般NaCl浓度为0.9％，蛋白胨1-100g/kg、牛肉膏2-8g/kg、蔗糖1-50g/kg、酵母粉1-20g/kg、碘酸钾1-3g/kg、磷酸二氢钠0.5-2.5g/kg、硫酸镁0.1-1g/kg、复合维生素0.01-10g/kg,、复合氨基酸0.01-10g/kg。

本发明的兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，能避免单独使用益生菌产品的弱点，相辅相成，扬长避短，促进了外源性益生菌在兔肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的生长和繁殖，从而达到促进动物健康的目的，减少了动物食用抗生素对兔肉质的影响，更加健康安全，无公害，不仅可以促进动物生长，还能提高饲料的转化率、增加肉类品质和提高食品的安全质量，根据各类益生菌选择出合适的益生元，解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。

本发明提供的兔用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，解决了饲养商品兔单独使用益生菌产品的弱点，并且适合于各类型商品兔，扬长避短，促进了外源性益生菌在动物肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的在兔只体内的迅速生长和繁殖，从而达到促进兔只健康的目的，其生产性能也得以极大提高，减少了传统动物食用添加剂对兔肉的影响，更加经济适用。目前对动物微生态制剂的作用机理了解程度还不够全面，缺乏深层次的机理、机制研究，而本发明较清楚地阐述了该复合型微生态制剂的作用机理并且大胆采用了模拟动物肠道环境实验，通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比较，在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选得到最佳的菌株；再将各类低聚糖含量进行了测定，选择出最佳添加量，将肠道益生菌和低聚糖混合制成兔用复合型合生元微生态制剂。目前使用的抗生素替代品功能还比较单一，而本发明所得的复合型微生态制剂充分克服了这一缺点，通过将各种益生菌与益生元以最适的比例混合实现了调节动物肠道微生物平衡，维持肠道健康，刺激有益菌群的生长，竞争性抑制有害菌，最终达到促进动物的生长，提高兔只的免疫力以及生产性能，而且获得的菌种能够直接运用于发酵制备微生态制剂，无污染、无残留。现有技术只是将益生菌与益生元简单机械地混合，并没有针对性，进而得到的复合型微生态制剂的效果不是很显著，而本发明所得微生态制剂是将各种益生菌与益生元按照最佳的比例而制得的，很具针对性，效果也很明显。

本发明兔用复合型合生元微生态制剂能够调节兔肠道微生物平衡，维持肠道健康，刺激有益菌群的生长，竞争性抑制有害菌，最终达到促进兔的生长，提高兔的免疫力的目的；获得的菌种能够直接运用于发酵制备微生态制剂，无污染、无残留，是现阶段标准的绿色动物食用添加剂，满足人们对食品的健康标准，符合日益提高的食品安全与质量要求；这种兔用复合型合生元微生态制剂在畜牧业中发挥着重要作用，不仅可以促进兔生长，还能提高饲料的转化率，并且符合食品质量与安全的标准。

本发明为寻找替代传统兔用食用添加剂，以用来解决畜牧行业面临的因抗生素滥用造成的兔肉的安全性和品质的问题，提出一种兔用复合型合生元微生态制剂；旨在弥补将益生菌或益生元直接添加进入饲料中的不足和对兔肉品质的影响，能够提高兔肉生产质量，且对畜牧产业动物传统食用添加剂更新换代具有促进作用。

本发明涉及一种有益于兔生长、提高兔肉的复合型合生元微生态制剂；合生元微生态制剂作为一种新型、绿色的动物食用添加剂，主要作用是优化兔的肠道菌群，调节兔肠道微生物平衡，维持其肠道健康，利用低聚糖益生元刺激有益菌群的生长，竞争性抑制有害菌，最终达到促进兔的生长，提高动物机体对病原物质的抵抗力，调节机体免疫系统，从而提高动物的免疫力，达到提高兔肉的品质目的；本发明模拟肠道环境筛选出有益菌后，根据各类益生菌选择出合适的益生元，如木寡糖、寡甘露糖、果寡糖等低聚糖,合成一种复合型合生元微生态制剂，为我国畜牧业解决新型动物食用添加剂以提供新的选择，且解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例的兔用复合型合生元微生态制剂为益生菌、益生元；按照质量比所述益生菌(冻干粉)：益生元＝1:1～5的比例混合。

进一步，所述益生菌由双歧杆菌、芽孢杆菌和粪肠球菌组成(标准菌株均购自北京北纳创联生物技术研究院)。

进一步，所述益生元由低聚糖和酸化剂组成；

所述低聚糖为木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖，酸化剂由乳酸、柠檬酸、延胡索酸组成的复合酸化剂。

进一步，所述益生菌为0.02-15g/kg，益生菌营养物质为0.05-80g/kg，低聚糖为0.01-90g/kg。

进一步，低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；添加由1份乳酸、3份柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂0.1％-0.5％(占微生态制剂比例)。

本发明的另一目的在于提供一种所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

首先针对性的分离、筛选出肠道益生菌，通过在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将适合兔胃、肠道的益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。

进一步，兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括：

步骤一、从兔的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌(粪链球菌)、枯草芽孢杆菌和双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

步骤二、利用兔肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质兔肠道益生菌；

步骤三、在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，进行更进一步的筛选，最终选取得到1株粪肠球菌(粪链球菌)、1株枯草芽孢杆菌和1株双歧杆菌；

步骤四、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；

步骤五、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；质量比0.1％-0.5％

进一步，步骤一中进行菌种的鉴定包括：

常规鉴定：芽孢杆菌繁殖快速，四小时增殖10万倍，生命力强无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖)。体积比一般病原菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。粪肠球菌为圆形或椭圆形、呈单个或成对或短链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。本菌对营养要求较高，要求高盐(6.5％NaCl),高碱(pH9.6),40％胆汁培养基和10-45℃环境下生长。

将双歧杆菌、芽孢杆菌和肠球菌益生菌和选择出的益生元有机结合起来，再加入有利于益生菌生长的营养物质，制成复合型合生元微生态制剂。

营养物质：由于兔属于哺乳类动物，所用稀释生理盐水与哺乳类、两栖动物略有区别，一般NaCl浓度为0.9％，蛋白胨1-100g/kg、牛肉膏2-8g/kg、蔗糖1-50g/kg、酵母粉1-20g/kg、碘酸钾1-3g/kg、磷酸二氢钠0.5-2.5g/kg、硫酸镁0.1-1g/kg、复合维生素0.01-10g/kg,、复合氨基酸0.01-10g/kg。

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：

请参阅图1：

一种兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，首先分别在不同的环境下筛选出肠道益生菌，通过对筛选出的肠道益生菌的功能和生物学特性比较，并且在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。

进一步，兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括：

S101、从兔的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌(粪链球菌)、枯草芽孢杆菌和双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

S102、利用兔肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质兔肠道益生菌；

S103、在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，进行更进一步的筛选，最终选取得到1株粪肠球菌(粪链球菌)、1株枯草芽孢杆菌和1株双歧杆菌；

S104、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；

S105、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由1份重量的乳酸、3份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；

S106、将添加复合酸化剂后的3株益生菌与质量比5％的益生元进行结合，配制出兔用复合型合生元微生态制剂。

实施例1：从养殖场附近的土壤初步筛选芽孢杆菌类益生菌。

第一步：含芽孢杆菌土壤样品的采集。选择大型养殖场附近的土壤为采集目的地，随机选择3-5个小区，每个小区取20-50g原始土壤，装入已灭菌的自封袋中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

第二步：芽孢杆菌的分离。在无菌条件下，在土壤样品加入到富集培养液，形成菌落，再将菌种接种到加入无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

第三步：芽孢杆菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的益生菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯菌落，斜面接种保存备用；

第四步：芽孢杆菌的鉴别。将分离纯化后的芽孢杆菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

实施例2：从动物肠道中初步筛选双歧杆菌益生菌。

第一步：含益生菌样品的采集。选择各个大型屠宰场为样品采集目的地，随机切取不同健康现杀动物的肠道组织，装入已灭菌的自封袋中，并快速带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

第二步：益生菌的富集、分离。在无菌条件下，将肠道组织样品内表面物质加入到富集培养液中培养，形成菌落，再将菌种接种到加入无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

第三步：益生菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的益生菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯菌落，斜面接种保存备用；

第四步：益生菌的鉴别。将分离纯化后的乳杆菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定的等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

实施例3：从兔肠道或者粪便中初步筛选粪肠球菌(粪链球菌)。

第一步：兔肠道样品的采集。选择大型商品兔养殖场为采集目的地，选择用新鲜宰杀兔肠衣(各段)作为样品约50g，装入已灭菌的自封袋中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

第二步：粪肠球菌的富集、初步分离。在无菌条件下，在兔肠衣样品中加入到富集培养液中，形成菌落，再将菌种接种到无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

第三步：粪肠球菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的粪肠球菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯种粪肠球菌形成的菌落，斜面接种保存备用；

第四步：粪肠球菌的鉴别。将分离纯化后的粪肠球菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定的等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

实施例4：复合型合生元微生态制剂的制备。

第一步：根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖和酸化剂组成的益生元，可选择的低聚糖为寡甘露糖，果寡糖,低聚异麦芽糖,乳寡糖等，酸化剂使用由乳酸、柠檬酸、延胡索酸等物质组成的复合酸化剂

第二步：测试各类低聚糖的添加量，各类低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。添加由乳酸、柠檬酸、延胡索酸等物质组成的复合酸化剂0.1％-0.5％；

第三步：将三种益生菌和选择出的益生元有机结合起来，再加入有利于益生菌生长的营养物质，制成复合型合生元微生态制剂；

第四步：最后制成的产品添加到动物食用料中进行动物实验，根据实验动物的增重量、饲料消耗量和料肉比等来判断实验动物的生产性能情况。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

步骤一、从养兔场内的土壤、喂养兔的饲料槽、胃肠道区域分离筛选出双歧杆菌、芽孢杆菌和粪肠球菌益生菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能以及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

步骤二、利用兔肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出提高兔从日粮中获取能量的优质益生菌，利用优质益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力，再根据微生物技术指标(现有技术:1.在选择性培养基上分离益生菌,然后对所选的每株细菌逐一进行耐酸、耐胆盐、耐消化酶等的生理特性检测,最后进行益生菌其他特性实验。2.先在动物消化道内取少量内容物,并进行稀释,于厌氧状态下,在MRS培养基中进行富集培养，获得可作为益生菌种的细菌，然后再通过梯度培养，逐渐增加培养基的酸度(pH为3.0左右)及胆汁盐浓度，选出具有耐酸和耐胆汁特性的菌株，再根据益生菌特性的要求，在培养基中添加其他的抑制剂或病原菌，筛选出长势良好并能抑杀病原菌的菌株，最后再对该菌株进行革兰氏染色、触酶等形态和生化鉴定，并确定其种属。)筛选优质兔肠道益生菌；3.筛选及测定将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能的比较以及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选优质益生菌；1)双歧杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)：分别取胃﹑十二指肠﹑肥肠﹑空肠﹑盲肠内容物一定量溶于100mL改良MRS培养基，富集培养24h,取1mL梯度稀释，涂布于平板上，在厌氧条件下培养48h，用接种环挑取蓝色菌落纯化3次，得到双歧杆菌，挑取严格厌氧的菌株进行革兰氏染色，镜检观察菌体颜色﹑大小﹑形状等是否符合双歧杆菌属的基本特征。2)枯草芽孢杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)分别取胃﹑十二指肠﹑肥肠﹑空肠﹑盲肠内容物一定量于50mL厌氧稀释液中﹑搅拌﹑作10倍系列稀释，分别取3个稀释度各0.1mL涂布LBS平板，37℃培养48h-72h,用接种环挑取疑是菌落，先进行复红简单染色观察，再进行革兰氏染色和芽孢染色，挑取芽孢杆菌菌落进行纯培养，并于斜面保存，再进行过氧化氢酶测定，即将各分离株接种于LB固体培养基斜面上，37℃培养18h-24h，取一干净载玻片，在上面滴一滴10％的H2O2,挑取一环培养好的菌苔，在H2O2中涂抹，若有气泡，则为阳性，反之为阴性。3)粪肠球菌(以养殖场附近的土壤为例)：

(1)土壤的采集处理

采用五点取样法从养殖场附近的土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。

(2)土壤中菌种的分离

将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。称取1g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28℃，12h，180rpm摇床富集培养。取1mL富集培养液，分别进行五个梯度稀释(1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000)，再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1mL稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面(注意不能使培养基表面破裂)，将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度(一般为25℃或28℃)的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/mL的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。

步骤三、在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的兔肠道益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，进行更进一步的筛选，筛选最佳的菌株；1.鉴定：双歧杆菌为革兰氏阳性的无芽孢杆菌，长短不等，典型的双歧杆菌有V字型或Y字型，排列呈单、双、短链、X、Y、V或栅状。芽孢杆菌存在两种形态：芽孢和营养体。营养体的细胞基本形态有杆状和椭圆状。杆状中有长杆状、短杆状，椭圆状有长椭圆和短椭圆。粪肠球菌是单细胞真核微生物，肠球菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1-5微米×5-30微米，肠球菌无鞭毛，不能游动。2.比较：根据比较不同益生菌的形态特征，从而鉴定各益生菌。

步骤四：根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由各类低聚糖和组成的益生元，选择出各类低聚糖最佳添加量；

步骤五、对步骤三筛选株益生菌与步骤四选择出的益生元，混合制成兔用复合型合生元微生态制剂。添加由乳酸、柠檬酸、延胡索酸物质组成的复合酸化剂0.1％-0.5％。在最佳酸化剂添加量下:1.动物的消化道环境能得到改善，从而改善动物的健康状况和生长性能。2.提高胃肠道的酸度，从而提高胃蛋白酶的活性。3.改善胃肠道内微生物区系，抑制有害微生物的繁殖4.促进动物体对矿物质元素和维生素的吸收5.促进有益菌的增殖，能够替代某些抗生素的功能)

进一步，步骤三筛选最佳的菌株中优选：1株肠球菌、1株枯草芽孢杆菌、和1株双歧杆菌。1.提高兔饲料转化率,促进肉兔生长；2.产生营养物质,并可以调节动物体内酶的活性；3.增强商品兔的免疫功能4.提高兔的成活率5.提高肉兔的日增重等6，增强动物的非特异性免疫功能。

进一步，步骤四中各类低聚糖为：木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖；

各类低聚糖最佳添加量优选木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg。1.能促使机体生成多种营养物质，包括维生素B1、B2、B6、B12、烟酸和叶酸；2.对肠道中双岐杆菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌等分别有选择性增殖作用，使有益菌群在肠道中占有优势，抑制有害菌的生长，减少有毒物质(如内毒素、氨类等)的形成，并且对肠粘膜细胞和肝具有保护作用，从而防止病变肠癌的发生，增强机体免疫力；3.对有害菌的抑制作用。

本发明的兔用复合型合生元微生态制剂能避免单独使用益生菌产品的弱点，相辅相成，扬长避短，促进了外源性益生菌在兔肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的生长和繁殖，从而达到促进动物健康的目的，减少了动物食用抗生素对兔肉质的影响，更加健康安全，无公害，不仅可以促进动物生长，还能提高饲料的转化率、增加肉类品质和提高食品的安全质量，根据各类益生菌选择出合适的益生元，解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种兔用复合型合生元微生态制剂，其特征在于，所述兔用复合型合生元微生态制剂由益生菌和益生元组成；

按照质量比益生菌：益生元＝1:1～5。

2.如权利要求1所述的兔用复合型合生元微生态制剂，其特征在于，所述益生菌由双歧杆菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌组成。

3.如权利要求1所述的兔用复合型合生元微生态制剂，其特征在于，所述益生元由低聚糖和酸化剂组成；

所述低聚糖为木寡糖、果寡糖，乳寡糖，L-阿拉伯糖，酸化剂由乳酸、柠檬酸、延胡索酸组成的复合酸化剂。

4.如权利要求1或3所述的兔用复合型合生元微生态制剂，其特征在于，所述益生菌为0.02-15g/kg，益生菌营养物质为0.05-80g/kg，低聚糖为0.01-90g/kg。

5.如权利要求3所述的兔用复合型合生元微生态制剂，其特征在于，木寡糖0.05-5g/kg、果寡糖0.02-2g/kg，乳寡糖0.5-3g/kg，L-阿拉伯糖0.1-3g/kg；添加由1份乳酸、3份柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂，复合酸化剂占微生态制剂比例的0.1％-0.5％。

6.一种如权利要求1所述兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，其特征在于，该兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括：

步骤一、从兔的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出粪肠球菌或粪链球菌、枯草芽孢杆菌，根据兔子消化系统特点，产气和产酸的益生菌都会不同程度给兔子带来负面效应，故母本益生菌仅选用双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

步骤二、利用兔肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在兔肠道中的提高能量的获取和储存、提高兔从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质兔肠道益生菌；

步骤三、在人工模拟的兔胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，选取得到1株粪肠球菌或粪链球菌、1株枯草芽孢杆菌和1株双歧杆菌；

步骤四、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量；

步骤五、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由1份重量的乳酸、3份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；

步骤六、将添加复合酸化剂后的3株益生菌与质量比5％的益生元进行结合，配制出兔用复合型合生元微生态制剂。

7.如权利要求6所述的兔用复合型合生元微生态制剂的制备方法，其特征在于，营养物质包括：NaCl浓度为1％，蛋白胨1-100g/kg、牛肉膏2-8g/kg、蔗糖1-50g/kg、酵母粉1-20g/kg、碘酸钾1-3g/kg、磷酸二氢钠0.1-2.5g/kg、硫酸镁0.1-1g/kg、复合维生素0.01-10g/kg,、复合氨基酸0.01-10g/kg。