CN113424900A - 一种益生菌饲料添加剂的制备方法、产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种益生菌饲料添加剂的制备方法、产品和应用，制备方法包括：经过菌种活化后的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、屎肠球菌分别置于液体培养基中扩大培养得菌种发酵液；将麸皮、玉米和大豆混合均匀后加水得固体培养基，接种制备的菌种发酵液进行混合菌种固体发酵培养；所得固体发酵产物进行干燥粉碎得益生菌发酵产物；取海藻酸钠、壳聚糖混合均匀后加水配制成混合溶液，溶解后冷却至常温，加入制备的益生菌发酵产物，搅拌均匀制得悬混液后喷雾干燥得所述益生菌饲料添加剂。本发明制备的益生菌饲料添加剂可最大限度上保证菌种在制备和储存过程中的存活率，提高其作为禽畜动物饲料添加剂时的肠道稳态和免疫调节作用。

Description

一种益生菌饲料添加剂的制备方法、产品和应用

技术领域

本发明涉及微生物添加剂技术领域，具体涉及一种益生菌饲料添加剂的制备 方法、产品和应用。

背景技术

微生物饲料添加剂是一类无毒无副作用、无耐药性、无环境污染的制剂，不 仅具有维持肠道微生态平衡、促进动物生长、产生消化酶及维生素、提高饲料转 化率和动物饲养效益。而且部分功能菌可以产生抗菌肽类物质，具有抑制有害菌、 增强机体免疫机能、降低动物死亡率的作用。在取代抗生素、减少化学合成药物 在畜禽养殖中的用量方面正在发挥着越来越重要的作用。日益成为饲料添加剂的 发展趋势。

然而，现有技术中的益生菌饲料添加剂在生产、运输、储存以及通过胃肠道 时存在菌量损失严重的技术问题，导致其在饲喂时并不能达到理论上的技术效果， 从而极大的限制了益生菌饲料添加剂在禽畜饲料领域的广泛推广和应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种益生菌饲料添加剂的制备方法、产品 和应用，通过在制备过程中对益生菌制剂进行微胶囊化以确保益生菌在生产、运 输、储存时不受影响，同时，在进行微胶囊化前，对益生菌菌种进行了固态发酵 培养，增强了益生菌在进入肠道后的活力和定植能力，以进一步提高对于禽畜的 肠道稳态和免疫调节作用。

本发明提供一种益生菌饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)经过菌种活化后的枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，发酵乳杆菌，屎肠 球菌分别置于液体培养基中扩大培养得菌种发酵液；

(2)将麸皮、玉米和大豆混合均匀后加水，使含水率为20-35％，得固体 培养基，灭菌后接种步骤(1)制备的菌种发酵液进行混合菌种固体发酵培养， 所得固体发酵产物进行干燥粉碎得益生菌发酵产物；

(3)取海藻酸钠、壳聚糖混合均匀后灭菌，加水配制成混合溶液，加热溶 解后冷却至常温，加入步骤(2)制备的益生菌发酵产物，搅拌均匀制得悬混液 后喷雾干燥得所述益生菌饲料添加剂。

优选的，所述步骤(1)中，液体培养基为MRS液体培养基，枯草芽孢杆菌， 地衣芽孢杆菌，发酵乳杆菌，屎肠球菌菌种发酵液中菌种量分别不低于5× 10⁶cfu/mL、3×10⁶cfu/mL、2×10⁶cfu/mL、1×10⁶cfu/mL。

优选的，所述步骤(2)中，麸皮、玉米和大豆的混合质量比为(3-5)∶(1-3)∶ (0.8-1.5)。

优选的，所述步骤(2)中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、 屎肠球菌发酵液接种量和固体培养基的体积比为(3-5)∶(2-6)∶(1-6)∶ (1-3)∶100；

优选的，所述步骤(2)中，固态发酵条件25℃-30℃温度下发酵48-72小 时；固体发酵产物进行干燥至含水量小于10％。

优选的，所述步骤(3)中，海藻酸钠、壳聚糖、益生菌发酵产物、水的混 合质量比例为(1-5)∶(2-3)∶(15-35)∶100；加热溶解温度为50-80℃； 喷雾干燥条件：进口温度90-100℃，出口温度50-60℃。

优选的，所述步骤(3)中，混合溶液采用磷酸缓冲溶液调整pH值至4-5。

本发明还提供上述益生菌饲料添加剂制备方法所制备的益生菌饲料添加剂。

本发明还提供上述益生菌饲料添加剂在禽畜动物饲料中的应用。

优选的，所述益生菌饲料添加剂添加量为禽畜动物饲料的0.5-1.5％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)微囊化技术是利用一些可以成膜的物质，将芯材(固体、液体和气体) 包埋在微小封闭的微胶囊内的技术，微胶囊能保护芯材不受环境中各种严酷因子 的压迫，增加芯材的保存时间，同时在必要的时候对芯材进行可控的释放。本发 明以海藻酸钠和壳聚糖作为微胶囊的壁材，海藻酸钠可以提高益生菌对胃蛋白酶 等的耐受能力，然而海藻酸钠在作为壁材的时候，制作的微胶囊具有多孔的特点， 这就造成了海藻酸钠将益生菌与外界环境隔绝的不够彻底，将壳聚糖与海藻酸钠 结合会弥补这一缺点，由于壳聚糖自身难溶于水，在酸性条件下才较易溶，因此， 本发明优选的方案中将壁材溶液pH值调整至酸性，同时在pH值为4-5时壳聚糖 与海藻酸钠结合最紧密，制备的微胶囊性能最佳。

(2)本发明以麸皮、玉米和大豆为原料制备固体培养基后对菌种进行混合 固态预发酵，一方面，固态预发酵过程为不同菌种提供一个相互适应和配合的环 境，使其进行微胶囊包埋后能够充分的适应混合菌种环境，提高菌种制备成微胶 囊后菌种成活率；另一方面，固态发酵产物中还含有部分未被充分发酵利用的麸 皮、玉米和大豆，其在微胶囊形成后仍然可以为微生物菌种提供必要的营养物质 供给，提高菌种的适应能力；而且，麸皮富含膳食纤维，在胃中大部分不消化而 进入肠道中，因此，麸皮的加入能够极大程度地防止益生菌制剂被胃液破坏，从 而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到益生菌的保健和治疗的作用，增强了益 生菌在进入肠道后的活力和定植能力，进一步提高对于禽畜的肠道稳态和免疫调 节作用。

(3)本发明制备的益生菌制中枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，发酵乳杆菌， 屎肠球菌菌种总含量在10¹¹cfu/g以上，并且常温环境下保存6个月、低温储存 1年后、耐胃酸测试后仍然具有高的存活率。作为禽畜动物饲料添加剂可显著提 高禽畜动物的抵抗力，减少粪便有害气体的产生，减少或抑制像大肠杆菌、沙门 氏菌等细菌的数量，对仔猪腹泻方面也能起到一定的效果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明 的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本 发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和 下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述 值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小 范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的 常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但 是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材 料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关 的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式 做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书 得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅 是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为 开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明以下实施例中所用菌种来源：

枯草芽孢杆菌：保藏编号CGMCC No.3665，购自中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心；

地衣芽孢杆菌：保藏编号CGMCC No.7388，购自中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心；

发酵乳杆菌：保藏编号为CGMCC N0.7121，购自中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心；

屎肠球菌：保藏编号CGMCC No.7274，购自中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心；

实施例1

(1)取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、屎肠球菌分别进行活 化后分别置于MRS液体培养基中在37℃条件下扩大培养，直至枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、屎肠球菌菌种发酵液中菌种量分别为5×10⁶cfu/mL、 3×10⁶cfu/mL、2×10⁶cfu/mL、1×10⁶cfu/mL；

(2)取麸皮、玉米、大豆按照5∶2∶1的质量比混合均匀后，加水至含水 量为25％，高压蒸汽灭菌后得固体培养基，将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发 酵乳杆菌、屎肠球菌发酵液和固体培养基按照体积比为5∶4∶3∶2∶100进行接 种后进行固态预发酵，固态发酵条件25℃、发酵48h；发酵结束后对发酵产物进 行干燥至含水量在8％，粉碎得益生菌发酵产物。

(3)取海藻酸钠、壳聚糖混合均匀后灭菌，加水配制成混合溶液，80℃加 热溶解后冷却至常温，加入步骤(2)制备的益生菌发酵产物，混合均匀后进行 喷雾干燥得益生菌饲料添加剂；海藻酸钠、壳聚糖、益生菌发酵产物、水的混合 质量比例为2∶2∶35∶100，喷雾干燥条件：进口温度100℃，出口温度60℃。

实施例2

同实施例1，区别在于，使用磷酸缓冲溶液将步骤(3)中的海藻酸钠、壳 聚糖混合溶液调整pH值范围为4。

实施例3

同实施例1，区别在于，不加入壳聚糖。

实施例4

同实施例1，区别在于，固体发酵培养基中，不加入麦麸。

实施例5

同实施例1，区别在于，不进行固态发酵，直接将步骤(1)制备的菌种发 酵液混合制备微胶囊。

实施例6

同实施例1，区别在于不进行包埋，步骤(2)制备的固态发酵产物直接进 行喷雾干燥得益生菌制剂。

效果验证1

分别称取1g实施例1-6制备的、在25±2℃常温环境下储存6个月后、0-4℃ 低温储存1年后的益生菌饲料添加剂于烧杯中，加入9mL pH值为7.4的解囊液， 37℃振荡直至完全崩解，制成菌悬液，以供接种。将待测样品用无菌生理盐水以 10倍梯度稀释，用1mL无菌移液枪吸取0.1mL合适稀释度(活菌数在30～ 300CFU/mL范围内)的菌悬液滴于平板上，用涂布器涂匀，编号。待琼脂凝固后， 将平板翻转，36±1℃培养48±2h。培养后计数平板上的所有菌落数。换算出微 胶囊的活菌数。

活菌数计算公式：活菌数(CFU/g)＝同一稀释度3个重复固体培养基菌落平 均数×稀释倍数。

结果见表1；

表1

效果验证2

取实施例1-6制备的益生菌制剂各1g，将其分别分散于9mL的人工模拟胃 液中，于37℃恒温贮藏，分别于0h、1h和2h后取出1管，用0.9％生理盐水冲 洗，加入配制好的解囊液中进行解囊，解囊完成后从中移取1mL进行梯度稀释， 采用MRS琼脂培养基进行活菌计数。结果见表2。

表2

	酸处理前活菌数，cfu/g	酸处理后活菌数，cfu/g
			实施例1	7.76×10<sup>11</sup>	5.45×10<sup>11</sup>
实施例2	9.51×10<sup>11</sup>	8.49×10<sup>11</sup>
			实施例3	6.17×10<sup>11</sup>	4.16×10<sup>10</sup>
实施例4	7.05×10<sup>11</sup>	5.15×10<sup>10</sup>
			实施例5	1.18×10<sup>7</sup>	5.9×10<sup>6</sup>
实施例6	3.7×10<sup>11</sup>	2.5×10<sup>10</sup>

以上可得，经过本发明制备的益生菌微胶囊可以在极大程度上提高益生菌添 加剂的保存期限和耐酸能力。

效果验证3

本发明实施例1-6胶囊产品作为饲料添加剂进行饲喂效果试验。选择猪场进 行了为期21天的饲喂试验。随机选取140头健康的、出生均重相近的，体重在 14kg左右的50日龄猪，随机分为7组，每组20头。试验组1-6分别饲喂本发 明实施例1-6制备的益生菌饲料添加剂，所述饲料为常规市售饲料，各组饲喂量 相同，益生菌饲料添加剂在饲料中的添加量为1％。试验组7仅仅饲喂常规市售 饲料作为对照组，记录猪腹泻率、发病率、死淘率、平均日增重增重率、料肉比 结果，

其中：腹泻率(％)＝总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100％；

发病率(％)＝总发病次数/(总头数×试验天数)×100％；

死淘率(％)＝(死亡头数/总头数)×100％；

平均日增重增重率＝(饲喂后猪平均重量-饲喂前猪平均重量)/试验天数；

增重率(％)＝((饲喂后猪平均重量-饲喂前猪平均重量)/饲喂前平均重量) ×100％；

料肉比＝消耗饲料总量/增重总量。

具体见表3。

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。

Claims (10)

1.一种益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)经过菌种活化后的枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，发酵乳杆菌，屎肠球菌分别置于液体培养基中扩大培养得菌种发酵液；

(2)将麸皮、玉米和大豆混合均匀后加水，使含水率为20-35％，得固体培养基，灭菌后接种步骤(1)制备的菌种发酵液进行混合菌种固体发酵培养，所得固体发酵产物进行干燥粉碎得益生菌发酵产物；

(3)取海藻酸钠、壳聚糖混合均匀后灭菌，加水配制成混合溶液，加热溶解后冷却至常温，加入步骤(2)制备的益生菌发酵产物，搅拌均匀制得悬混液后喷雾干燥得所述益生菌饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，液体培养基为MRS液体培养基，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，发酵乳杆菌，屎肠球菌菌种发酵液中菌种量分别不低于5×10⁶cfu/mL、3×10⁶cfu/mL、2×10⁶cfu/mL、1×10⁶cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，麸皮、玉米和大豆的混合质量比为(3-5)∶(1-3)∶(0.8-1.5)。

4.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、屎肠球菌发酵液接种量和固体培养基的体积比为(3-5)∶(2-6)∶(1-6)∶(1-3)∶100。

5.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，固态发酵条件25℃-30℃温度下发酵48-72小时；固体发酵产物进行干燥至含水量小于10％。

6.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，海藻酸钠、壳聚糖、益生菌发酵产物、水的混合质量比例为(1-5)∶(2-3)∶(15-35)∶100；加热溶解温度为50-80℃；喷雾干燥条件：进口温度90-100℃，出口温度50-60℃。

7.根据权利要求1所述的益生菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，混合溶液采用磷酸缓冲溶液调整pH值至4-5。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的益生菌饲料添加剂的制备方法所制备的益生菌饲料添加剂。

9.一种根据权利要求8所述的益生菌饲料添加剂在禽畜动物饲料中的应用。

10.根据权利要求9所述的益生菌饲料添加剂在禽畜动物饲料中的应用，其特征在于，添加量为禽畜动物饲料的0.5-1.5％。