CN103387948A

CN103387948A - 沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

Info

Publication number: CN103387948A
Application number: CN2013103333543A
Authority: CN
Inventors: 邵宗泽; 王丽萍
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: CN103387948B

Abstract

沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用，涉及水产养殖。所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588，保藏编号为CCTCC NO：M2013290，分离自北冰洋加拿大海盆深海沉积物，可用于制备沙福芽孢杆菌制剂，所述沙福芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。所制备的沙福芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×10⁹CFU/mL，最高可达到1×10¹⁰CFU/mL以上。促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。

Description

沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

技术领域

本发明涉及水产养殖，尤其是涉及一种应用于对虾养殖的制剂，具体是由沙福芽孢杆菌制成的制剂在抑制弧菌，促进对虾生长，增强对虾抗病力，防治对虾弧菌病中的应用。

背景技术

集约化、高密度水产养殖的迅猛发展，使养殖生态环境遭到严重破坏，水产养殖病害越来越复杂，发病率越来越高，危害越来越严重，抗生素饲料添加剂的使用量日益增加。2010年，全国水产养殖面积764万公顷，其中有24万公顷遭受病害，产量损失近30万吨。在95%养殖面积中，为了防止疾病发生，生产中盲目、大规模地投放各类抗生素，如氯霉素、土霉素、呋喃唑酮等。氯霉素直接加入水中，土霉素拌饲料投喂或直接泼洒养殖水体。2000年抗生素用量约为16200吨，约70%用于畜牧业和水产养殖业。由于药物滥用、药物残留和细菌耐药性等问题日趋严重，引发了人们对食品和环境安全的关注。寻找一种新型、安全、绿色的抗生素替代品成为当前水产研究的热点之一，其中益生菌因其具有抑菌、促生长、提高免疫等作用日益受到重视。

微生态制剂是通过“以菌治菌”达到防治水产养殖动物病害的目地。一方面，通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质来抑制或者杀灭病原菌，同时在养殖水体和养殖动物肠道中与病原菌竞争营养，占据生态位，形成优势菌群，达到防治病害的目的。另一方面，有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪的代谢，提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的。

中国专利CN101993843A公开一种坚强芽孢杆菌菌株及其应用。坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)SSL065菌株，保藏编号为：CCTCC NO：M2010192。该菌株制备的坚强芽孢杆菌SSL065菌粉，可用于增强对虾细胞和体液的免疫水平。该发明的坚强芽孢杆菌SSL065菌株筛选自对虾消化道，是一种内源性的菌株，具有明显的提高养殖对虾非特异性免疫水平，大大增强养殖对虾抗病原菌感染力，特别是可以显著提高对虾抵御病毒病原感染能力等多种生物学功能。

中国专利CN102586144A公开一种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011411。该发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149具有强的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作为发酵菌株，经固态发酵、干燥粉碎制得以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成分的短小芽孢杆菌益生菌制剂，将其添加到对虾饲料中，饲喂对虾，不仅可以起到抑制对虾肠道病原弧菌生长、减少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数、提高商品品质、缩短养殖周期，从而减少养殖风险、降低养殖成本，且生物安全性高，在水产养殖中具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对于对虾弧菌病害具有较好防治效果、并能促进对虾生长的沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588。

本发明的另一目的在于提供沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用。

所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588已于2013年06月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2013290。

沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588是从北冰洋加拿大海盆深海沉积物分离获得。

沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588具有下述特征：

1、形态特征：沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588CCTCC NO：M2013290为杆状，大小为（0.3～0.5）μm×（1.0～1.8）μm，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。在2216E固体培养基上28℃培养48h，菌落呈灰白色、表面干燥、扁平、不凸起、边缘规则、不透明，菌落直径大小约为1～2mm。

2、生理生化特征：菌株生长盐度范围为0～12%，15%以上不生长，最适范围为1%～7%；生长pH范围为5～11，最适范围为6～8。氧化酶（+），接触酶（+），硝酸盐还原（-），吲哚试验（-），不能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化（+），尿素酶（+），β-葡萄糖苷酶（+），β-半乳糖苷酶（+），能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、苹果酸、柠檬酸，不能利用癸酸、己二酸、苯乙酸。

API ZYM结果显示，沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酶，不具有缬氨酸氨肽酶、胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、α-葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶等酶活性。

3、16S rRNA和pyrE基因序列分析：按照常规方法抽提沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588的基因组DNA，并对16S rRNA和pyrE基因序列进行测定，沙福芽孢杆菌Bacillussafensis1A07588的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

经BLAST比对分析，沙福芽孢杆菌1A07588与Bacillus safensis FO-036b(T)的16S rDNA序列同源性为100%，与B.pumilus ATCC7061(T)的16S rDNA序列同源性为99.87%，与B.altitudini41KF2b(T)的16S rDNA序列同源性为99.6%。pyrE基因序列的比对结果表明，沙福芽孢杆菌1A07588与B.safensis FO-036b(T)、B.pumilus ATCC7061(T)和B.altitudini41KF2b(T)三株模式种的同源性分别为95.42%、89.38%和83.33%。

综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA和pyrE基因序列分析结果，本发明的菌株1A07588鉴定为沙福芽孢杆菌，具体为沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588（CCTCCNO：M2013290）。

本发明的沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588对致病性弧菌有显著的抑制效果，对对虾生长有明显的促进作用。本发明的沙福芽孢杆菌1A07588能产生蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等，并且具有较强的活性。

本发明的沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588对哈维氏弧菌SF1、坎贝氏弧菌VH1、鳗弧菌W1、副溶血弧菌1937、欧文氏弧菌VH2、需钠弧菌FS-1等对虾致病性弧菌具有广泛的抑制性。

本发明的沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588在提高对虾抗病力、促进对虾生长方面有显著效果。在用致病性坎贝氏弧菌VH1浸浴感染对虾的实验中发现，添加沙福芽孢杆菌1A07588的实验组对虾存活率显著高于对照组，提高了35%。将沙福芽孢杆菌1A07588进行液体发酵，以10⁷cfu/g（每g饲料的活菌含量）的浓度添加至饲料中投喂南美白对虾，同时以10⁵cfu/mL（每毫升海水的活菌含量）的浓度泼洒至养殖水体中，结果发现，经过30天的饲养，投喂添加了沙福芽孢杆菌1A07588饲料的实验组与不添加益生菌的对照组相比，对虾平均体重增长率提高了29.9%，益生菌1A07588实验组的对虾肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶均均显著高于对照组（P<0.05）。弧菌含量动态监测结果表明，1A07588实验组的养殖海水中弧菌含量低于对照组；菌株1A07588能在养殖海水和对虾肠道中存活，养殖海水中检测到的活菌含量在10⁴cfu/mL以上，对虾肠道中芽孢杆菌含量在10⁴cfu/g以上。

所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588可用于制备沙福芽孢杆菌制剂，所述沙福芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。

所述沙福芽孢杆菌制剂的制备方法的具体步骤为：将沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）1A07588按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方（W/V）：豆饼粉3%，淀粉1.5%，玉米浆1%，葡萄糖0.5%，(NH₄)₂SO₄1%,NH₄Cl0.1%,KH₂PO₄0.05%，NaH₂PO₄0.5%,MgSO₄0.05%，MnSO₄0.05%。

所制备的沙福芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×10⁹CFU/mL，最高可达到1×10¹⁰CFU/mL以上。

所述沙福芽孢杆菌制剂按对虾饲料重量的0.5%～5%添加。

所述沙福芽孢杆菌制剂在养殖水体中的接种浓度为10³～10⁴cfu/mL。

本发明所述沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）1A07588对水产养殖病原弧菌具有广泛抑制性。以沙福芽孢杆菌1A07588发酵液作为活菌制剂，泼洒到养殖水体/添加到饲料中饲喂对虾，可以起到抑制养殖水体中病原弧菌的繁殖，提高对虾消化道酶活，促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。

附图说明

图1沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588的酶活性检测图。1、蛋白酶；2、脂肪酶；3、纤维素酶。

图2沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588抑菌活性检测图。1、指示菌：坎贝氏弧菌VH1；2、指示菌：哈维氏弧菌SF1。

图3沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588发酵上清液对坎贝氏弧菌VH1生长的抑制。在图3中，◆为对照：VH1，■为处理：VH1+1A07588。

图4养殖水体中弧菌含量的动态监测。在图4中，标记◆为1A07588，■为空白对照。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述的实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1沙福芽孢杆菌的分离、鉴定和抑菌谱测定

（1）菌株分离：在无菌超净台中取北冰洋加拿大海盆深海沉积物样品1g，加入9ml无菌生理盐水（0.9%NaCl）制成悬浮液，依次10倍梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4，取梯度稀释液100uL涂布Marine Agar固体培养基（2216E培养基），25℃培养48h后，挑取单菌落划线纯化，分离获得菌株1A07588。

（2）菌株的生理生化特征和分子鉴定

形态特征：沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）1A07588CCTCC NO：M2013290为杆状，大小为（0.3～0.5）μm×（1.0～1.8）μm，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。在2216E固体培养基上28℃培养48h，菌落呈灰白色、表面干燥、扁平、不凸起、边缘规则、不透明，菌落直径大小约为1～2mm。

生理生化特征：菌株生长盐度范围为0%～12%，15%以上不生长，最适范围为1%～7%；生长pH范围为5～11，最适范围为6～8。氧化酶（+），接触酶（+），硝酸盐还原（-），吲哚试验（-），不能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化（+），尿素酶（+），β-葡萄糖苷酶（+），β-半乳糖苷酶（+），能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、苹果酸、柠檬酸，不能利用癸酸、己二酸、苯乙酸。部分生理生化特征见表1。

表1：沙福芽孢杆菌1A07588的生理生化特性

注：“+”，表示阳性反应或可利用；“-”，表示阴性反应或不可利用

API ZYM结果显示，菌株1A07588具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酶，不具有缬氨酸氨肽酶、胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、α-葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶等酶活性。

分子鉴定：按照常规方法抽提沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）1A07588的基因组DNA，并对16S rRNA和pyrE基因序列进行测定，沙福芽孢杆菌1A07588的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

经BLAST比对分析，1A07588与Bacillus safensis FO-036b(T)的16S rDNA序列同源性为100%，与B.pumilus ATCC7061(T)的16S rDNA序列同源性为99.87%，与B.altitudini41KF2b(T)的16S rDNA序列同源性为99.6%。pyrE基因序列的比对结果表明，1A07588与B.safensisFO-036b(T)、B.pumilus ATCC7061(T)和B.altitudini41KF2b(T)三株模式种的同源性分别为95.42%、89.38%和83.33%。

综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA和pyrE基因序列分析结果，本发明的菌株1A07588鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号分别为CCTCC NO：M2013290。沙福芽孢杆菌1A07588的16S rDNA和pyrE基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

（3）产酶和抑菌活性检测

胞外酶活检测：对沙福芽孢杆菌1A07588进行胞外蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性检测，结果发现，菌株1A07588具有胞外蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶活性，但不具有淀粉酶活性。

抑菌活性检测：采用琼脂平板扩散法对沙福芽孢杆菌1A07588的抑菌活性以及抑菌谱进行测定。所用培养基为海水216L培养基，指示菌包括致病性弧菌如哈维氏弧菌SF1、坎贝氏弧菌VH1、鳗弧菌W1、副溶血弧菌1937、欧文氏弧菌VH2、需钠弧菌FS-1以及藤黄微球菌CGMCC1.2299、金黄色葡萄球菌FDA209、大肠杆菌CGMCC1.2389、嗜水气单胞菌SHI和铜绿假单菌1A06466。指示菌和受试菌分别在216L培养基中过夜培养，取适量指示菌用无菌生理盐水稀释至10⁷cfu/ml,吸取100μL涂布216L平板，在平板上打孔（孔径6mm），在孔中加入受试菌发酵液50ul，30℃培养24h，观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径。结果表明，沙福芽孢杆菌1A07588对11株指示菌均有不同程度的抑制作用，结果如表2所示。

沙福芽孢杆菌1A07588胞外酶活性检测图和抑菌活性见图1和2。

表2：菌株1A07588的抑菌活性

注：1～5均为致病性弧菌，对南美白对虾有较强的致病性。表格中数值代表抑菌圈直径（mm），数值越大，抑菌效果越强。-，表示观察不到抑菌圈

实施例2沙福芽孢杆菌1A07588发酵上清液对弧菌生长的抑制

将沙福芽孢杆菌1A07588和指示菌坎贝氏弧菌VH1分别在216L液体培养基中28℃培养24h。然后取1A07588发酵液用0.22um滤膜过滤除菌，取1mL过滤上清液加入4mL新鲜的216L培养基中，再在试管中接种50μl的指示菌VH1。同时接种指示菌VH1（50μl）至5mL216L液体培养基中作为对照。每组试验三个平行。分别在3，6，9，12，15，18，21，24h取样测定指示菌VH1的生长（以OD₆₀₀表示）。实验结果如图3所示，添加1A07588发酵上清液的实验组指示菌VH1生长明显弱于对照组，说明1A07588对弧菌VH1生长有抑制作用。

实施例3沙福芽孢杆菌1A07588对南美白对虾抗病性的生物测定

将沙福芽孢杆菌1A07588以及对虾致病菌坎贝氏弧菌VH1分别在216L液体培养基中28℃培养24h。取各菌发酵液在5000rpm下离心5min，去掉上清液，收集菌体，用无菌生理盐水制备成菌悬液，测定菌悬液OD₆₀₀，按照实验用量加入养殖水体中。

实验在30L水族缸中开展，每个水族缸中放入10L新鲜海水和50尾南美白对虾幼苗PL-40（体重约为0.1g），保证足够充气。实验设置空白组（30L养殖水体中不加任何菌），对照组（30L养殖水体中接种10⁶cfu/ml浓度的坎贝氏弧菌VH1）和实验组（30L养殖水体中同时接种10⁶cfu/ml同等浓度的沙福芽孢杆菌1A07588和坎贝氏弧菌VH1）。实验期间不换水，每日统计对虾死亡情况。结果如表3所示，经过7天的观察，结果表明，沙福芽孢杆菌1A07588能显著提高对虾存活率，降低弧菌感染对虾的死亡率。

表3：沙福芽孢杆菌1A07588对坎贝氏弧菌VH1感染对虾的保护作用

实施例4沙福芽孢杆菌1A07588对南美白对虾生长的影响

沙福芽孢杆菌的培养：将出发菌株沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis1A07588）保藏编号CCTCC NO：M2013290按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方（W/V）：豆饼粉3%，淀粉1.5%，玉米浆1%，葡萄糖0.5%，(NH₄)₂SO₄1%,NH₄Cl0.1%,KH₂PO₄0.05%，NaH₂PO₄0.5%,MgSO₄0.05%，MnSO₄0.05%。将上述获得的沙福芽孢杆菌发酵液用生理盐水进行10倍梯度稀释后，取100ul涂布MA平板，28℃培养24h，计算活菌含量为5×10⁹cfu/mL。

实验所用南美白对虾苗购买自厦门厦金龙育苗公司，体长0.8cm左右，在实验室暂养至体长4cm左右，体重1.3g左右即转移至养殖池开展实验。养殖池体积为500L，有效水体为375L，每个养殖池放养对虾100尾。实验分为对照组和实验组，每组三个平行。实验组对虾每日投喂添加有沙福芽孢杆菌1A07588的对虾商品饲料（“福星”牌南美白对虾2号饲料），对照组仅投喂不加菌的上述对虾商品饲料；同时每7天往实验组水体中泼洒10⁵cfu/mL的沙福芽孢杆菌1A07588。实验组对虾饲料制备方法：取10mL上述沙福芽孢杆菌发酵液，用无菌生理盐水适当稀释后均匀喷洒到500g饲料表面，搅拌均匀，保证饲料中活菌浓度在1×10⁷cfu/g。实验为期30天，每日投喂2次饲料，每日换水20%。30天后统计对虾平均体重增长量，测定肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性同时检测水体和肠道芽孢杆菌数目、弧菌数目等。

表4：沙福芽孢杆菌1A07588对南美白对虾体重量的影响

注：*相对体重增长率=（最终体重-初始体重）/初始体重。上标不同字母代表差异显著（P<0.05）

表5：沙福芽孢杆菌1A07588对南美白对虾肠道消化酶活性的影响

由表4和表5可知，经过30天的饲喂，沙福芽孢杆菌1A07588显著提高对虾的平均体重增长量，比对照组提高了29.9%。另外，1A07588益生菌处理组的对虾肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶均显著高于对照组（P<0.05）。此外，1A07588实验组水体中芽孢杆菌含量在10⁴cfu/mL以上，对虾肠道芽孢杆菌数在10⁴cfu/g以上。水体弧菌含量动态监测结果表明（图4），实验组养殖水体中弧菌含量一直低于对照组，说明沙福芽孢杆菌1A07588具有抑制水体弧菌繁殖的作用。综上，沙福芽孢杆菌1A07588具有促进对虾生长、抑制弧菌的作用。

实施例5急性毒性试验

按照实施例2将菌株1A07588在216L液体培养基中28℃培养24h制备菌液。取SPF级KM小鼠，体重18～22g，雌雄各10只，用菌液进行灌胃，每只每次灌胃0.4ml，24h内灌胃5次，共2ml/只。连续观察7天，第7天称重。结果表明，实验小鼠均未出现异常情况，体重增长正常。说明沙福芽孢杆菌1A07588是安全无毒的。

Claims

1.沙福芽孢杆菌，其特征在于为沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588，已于2013年06月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCCNO：M2013290。

2.如权利要求1所述沙福芽孢杆菌在制备沙福芽孢杆菌制剂中的应用，所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述沙福芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述沙福芽孢杆菌制剂的制备方法的具体步骤为：将沙福芽孢杆菌Bacillus safensis1A07588按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方，W/V：豆饼粉3%，淀粉1.5%，玉米浆1%，葡萄糖0.5%，(NH₄)₂SO₄1%,NH₄Cl0.1%,KH₂PO₄0.05%，NaH₂PO₄0.5%,MgSO₄0.05%，MnSO₄0.05%。