CN107058408A - 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法 - Google Patents

一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107058408A
CN107058408A CN201710455267.3A CN201710455267A CN107058408A CN 107058408 A CN107058408 A CN 107058408A CN 201710455267 A CN201710455267 A CN 201710455267A CN 107058408 A CN107058408 A CN 107058408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
resveratrol
product
precipitation
bacterial transformation
extracting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710455267.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058408B (zh
Inventor
李玉
胡小妍
冯薇
王洪彬
路福平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN201710455267.3A priority Critical patent/CN107058408B/zh
Publication of CN107058408A publication Critical patent/CN107058408A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058408B publication Critical patent/CN107058408B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C37/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C37/68—Purification; separation; Use of additives, e.g. for stabilisation
    • C07C37/685—Processes comprising at least two steps in series

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，添加有底物虎杖粗药材的发酵培养基中接种沙福芽孢杆菌种子液，28‑37℃发酵6‑15h，菌体浓度OD600nm＝0.8‑1.6时，开始有产物析出，菌体与底物、产物相互作用，在微生物的作用下产物以菌体为晶核结晶析出，发酵液离心、蒸馏水洗涤沉淀，向沉淀中加入有机溶剂单次提取、干燥即可得到产品白藜芦醇，纯度≥99％。该方法操作简单，条件温和，转化时间短，产物收率高。

Description

一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法。
背景技术
白藜芦醇(Resveratrol)是一种具有天然活性的非黄酮类多酚物质，化学名称为芪三酚(3，5，4-三羟基二苯乙烯)，分子式为C14H12O3，为无色针状结晶，较难溶于水，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，光稳定和热稳定性差，需于低温、避光条件下保藏。
白藜芦醇被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物。为一种植物抗毒素,是在植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的。具有抗癌、保护心血管系统、降低血糖、促进神经干细胞的存活和增殖、特异性或非特异性免疫调节、保护胃粘膜、抗抑郁及神经保护、抑制肿瘤恶性增殖、美白、清除自由基、消炎润肤等功效。在医药、食品、保健品和化妆品等行业中有极广泛的应用。
植物提取白藜芦醇效率低，溶剂使用量大；白藜芦醇的光热不稳定性又限制了化学合成法在工业化生产白藜芦醇上的应用；酶法转化白藜芦醇，生产成本较高且不可再生，故工艺方法需不断改进提高；微生物细胞直接转化法因转化率高，环境友好，便于分离纯化而日渐兴起，目前已有霉菌转化白藜芦醇的报道但细菌转化法鲜有报道，而细菌发酵较霉菌发酵具有生产周期短、成本低、菌体浓度大、转化效率高、反应条件容易控制等优点，更适于生产。
发明内容
本发明主要目的是提供一种基于细菌细胞转化和提取白藜芦醇的方法，利用沙福芽孢杆菌细胞对虎杖粗药材的作用转化白藜芦醇，且能以菌体为晶核结晶析出产物，无需外加物质促进产物结晶，工艺简单，便于分离提取，使后期的提取工艺更加简便、降低对环境的危害。
本发明技术方案概述如下：直接利用细菌——沙福芽孢杆菌(菌种保藏号：CGMCCNo.13129)细胞转化虎杖粗药材，白藜芦醇在转化过程中会自然析出。在该过程中，当有白藜芦醇逐渐生成时，由于产物与菌体相互作用，结晶析出，发酵液较菌体浓度最高时澄清，即发酵液整体呈现出由澄清到浑浊再到较澄清的状态。菌体与产物相互作用，产物以菌体为晶核不断析出。在此基础上只需单步萃取，干燥即得白藜芦醇，产品纯度可高达99.3％。该方法操作简单，条件温和，转化时间短，产物收率高。
添加有底物虎杖粗药材的发酵培养基中接种沙福芽孢杆菌种子液，28-37℃发酵6-15h，菌体浓度OD600nm＝0.8-1.6时，开始有产物析出，菌体与底物、产物相互作用，在微生物的作用下产物以菌体为晶核结晶析出，发酵液离心、蒸馏水洗涤沉淀，向沉淀中加入有机溶剂单次提取、干燥即可得到产品白藜芦醇。HPLC-MS结果显示转化产物与白藜芦醇标准品出峰一致，分子量均为229.1，确为白藜芦醇，检测纯度≥99％。
所述底物虎杖粗药材(粉末状)的添加量优选为0.05％-0.5％。
所述底物虎杖粗药材中虎杖苷的纯度优选为30～100％。
所述发酵培养基优选为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，余量水。
所述沙福芽孢杆菌种子液的接种量优选为0.5-5％。
所述有机溶剂优选为乙醇。
所述乙醇纯度优选为60-100％。
所述有机溶剂的提取温度优选为4-28℃。
本发明提供的一株白藜芦醇发酵菌，菌株的分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13129，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2016年10月21日。该菌株生长速度快，抗逆性强，作用广谱，酶系丰富，可产生葡萄糖苷酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶，可降解虎杖粗药材中的纤维素、木质素、淀粉、蛋白等成分。
有益效果：
本发明技术所得的白藜芦醇产品纯度可高达99.3％(99.0％以上)，分离提取便捷，对生产设备适应性强、易操作，工艺简便可行。提取操作步骤简单，只需蒸馏水洗涤，单一溶剂单次萃取，干燥，即可使纯度高达99.3％。有机溶剂使用量少，并可循环利用。转化过程无需外加物质，结晶后期发酵液整体呈现较澄清的状态，简单处理可实现回收再利用。
附图说明：
图1：白藜芦醇形成时与菌体的相互作用；
图2：生物转化后的发酵液；
图3：白藜芦醇标准品HPLC-MS图；
图4：转化产物HPLC-MS图；
图5：转化产物1H-NMR图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
下述实施例中制备沙福芽孢杆菌种子液的种子培养基优选：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，余量水。所述沙福芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13129。
实施例1：
将0.1％底物虎杖粗药材加入到培养基(pH＝7.0)中，接入1％沙福芽孢杆菌种子液(OD600nm＝1.0)，于37℃，200r/min，摇瓶发酵10h，已有产物析出。在5000r/min，4℃的条件下离心，弃去上清液；用水洗涤沉淀，离心去上清；向沉淀中加入纯度为100％乙醇，再次在5000r/min，4℃的条件下离心，弃去沉淀；蒸发上清液中的有机溶剂，即可得到白藜芦醇产品，纯度为99.3％。
实施例2：
将0.3％底物虎杖粗药材加入到培养基(pH＝7.0)中，接入3％沙福芽孢杆菌种子液(OD600nm＝0.8)，于28℃，180r/min摇瓶发酵12h，有产物析出。在2000r/min，25℃的条件下离心，弃去上清液；用水洗涤沉淀，离心去上清；向沉淀中加入纯度为80％的乙醇，再次在2000r/min，25℃的条件下离心，弃去沉淀；蒸发上清液中的有机溶剂，即可得到白藜芦醇产品，纯度为99.3％。
实施例3：
将0.1％底物虎杖粗药材加入到培养基(pH＝5.0)中，接入3％沙福芽孢杆菌种子液(OD600nm＝0.8)，于37℃，200r/min摇瓶发酵6h，有产物析出。在3000r/min，25℃的条件下离心，弃去上清液；用水洗涤沉淀，离心去上清；向沉淀中加入纯度为90％的甲醇，再次在3000r/min，25℃的条件下离心，弃去沉淀；蒸发上清液中的有机溶剂，即可得到白藜芦醇产品，纯度为99.0％。
实施例4：
将0.5％底物虎杖粗药材加入到培养基(pH＝7.0)中，接入5％沙福芽孢杆菌种子液(OD600nm＝0.8)，于30℃，180r/min摇瓶发酵15h，有产物析出。在3000r/min，20℃的条件下离心，弃去上清液；用水洗涤沉淀，离心去上清；向沉淀中加入纯度为70％的乙醇，再次在3000r/min，20℃的条件下离心，弃去沉淀；蒸发上清液中的有机溶剂，即可得到白藜芦醇产品，纯度为99.0％。

Claims (7)

1.一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述方法为：添加有底物虎杖粗药材的发酵培养基中接种沙福芽孢杆菌种子液，28-37℃发酵6-15h，菌体浓度OD600nm＝0.8-1.6时，开始有产物析出，菌体与底物、产物相互作用，在微生物的作用下产物以菌体为晶核结晶析出，发酵液离心、蒸馏水洗涤沉淀，向沉淀中加入有机溶剂单次提取、干燥即可得到产品白藜芦醇，纯度≥99％；所述沙福芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13129。
2.如权利要求1所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述底物虎杖粗药材的添加量为0.05％-0.5％，虎杖粗药材中虎杖苷的纯度为30～100％。
3.如权利要求1所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述沙福芽孢杆菌种子液的接种量为0.5-5％。
4.如权利要求1所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，余量水。
5.如权利要求1所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
6.如权利要求5所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述乙醇纯度为60-100％。
7.如权利要求1所述的一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述有机溶剂的提取温度为4-28℃。
CN201710455267.3A 2017-06-16 2017-06-16 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法 Active CN107058408B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710455267.3A CN107058408B (zh) 2017-06-16 2017-06-16 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710455267.3A CN107058408B (zh) 2017-06-16 2017-06-16 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058408A true CN107058408A (zh) 2017-08-18
CN107058408B CN107058408B (zh) 2020-10-30

Family

ID=59595060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710455267.3A Active CN107058408B (zh) 2017-06-16 2017-06-16 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058408B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080530A (zh) * 2020-09-27 2020-12-15 廖国庆 一种白藜芦醇的生物萃取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896255A (zh) * 2006-06-17 2007-01-17 曹庸 微生物转化虎杖材料提取高纯白藜芦醇的工艺
CN102408999A (zh) * 2011-06-29 2012-04-11 林元山 一种微生物酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法
CN103387948A (zh) * 2013-08-02 2013-11-13 国家海洋局第三海洋研究所 沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896255A (zh) * 2006-06-17 2007-01-17 曹庸 微生物转化虎杖材料提取高纯白藜芦醇的工艺
CN102408999A (zh) * 2011-06-29 2012-04-11 林元山 一种微生物酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法
CN103387948A (zh) * 2013-08-02 2013-11-13 国家海洋局第三海洋研究所 沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王斌斌 等: "β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达", 《化学与生物工程》 *
马伟光 主编: "《天然植物药的生物转化研究》", 31 May 2014, 云南科技出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080530A (zh) * 2020-09-27 2020-12-15 廖国庆 一种白藜芦醇的生物萃取方法
CN112080530B (zh) * 2020-09-27 2022-03-22 山西纳安健康科技有限公司 一种白藜芦醇的生物萃取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058408B (zh) 2020-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103993042B (zh) 一种木质纤维素类物质联产生物乙醇和普鲁兰糖的方法
CN106520746A (zh) 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法
CN101665446B (zh) 辣椒素和辣椒红色素的提取方法
JP6861202B2 (ja) 発酵によるバニリンの改良された製造
CN104862347A (zh) 一种发酵分离耦合生产长链二元酸的方法
CN103276019B (zh) 一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法
WO2016173262A1 (zh) 一种农林生物质废弃物浓醪发酵产纤维素乙醇的方法
CN103966271B (zh) 发酵生产dha的方法
Wang et al. Bioconversion of cellulose and hemicellulose in reed sawdust to xylo-oligosaccharides and L-lactic acid
CN100552035C (zh) 一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法
NL2028177B1 (en) Process for producing acetoin by utilizing wheat b-starch
CN104894171A (zh) 以木薯淀粉为原料发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇的方法
CN107058408A (zh) 一种利用细菌转化和提取白藜芦醇的方法
CN104031109B (zh) 一种微生物发酵纯化茶皂素的方法
CN103361394B (zh) 利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法
CN101597627B (zh) 一种高分子γ-聚谷氨酸的生产方法
CN102511650B (zh) 一种利用菊芋糟渣发酵生产蛋白饲料的方法
CN102703558B (zh) 一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法
CN104480075A (zh) 一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用
CN101967457B (zh) 利用秸秆生产2,3-丁二醇菌种筛选及发酵方法
CN115010636A (zh) 一种斑蝥黄发酵液的提取方法
CN101709322A (zh) 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
CN101709072B (zh) 一种纳他霉素提取纯化方法
CN103103225A (zh) 一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法
CN103184164A (zh) 一株可同时生产d-阿拉伯糖醇和木糖醇的酵母菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: No.9, 13th Street, economic and Technological Development Zone, Binhai New Area, Tianjin

Patentee after: Tianjin University of Science and Technology

Address before: 300222 No. 1038 South Dagu Road, Tianjin, Hexi District

Patentee before: Tianjin University of Science and Technology