CN104480075A - 一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用。所述生物酶为SEQID NO:2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制备，首先构建生物酶的基因工程菌株，将全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性内切酶SalI线性化重组质粒。将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养至OD为1.0时接入1％甲醇诱导，诱导72h，用于表达生物酶，经过进一步发酵获得催化合成丙谷二肽的生物酶。利用该生物酶催化合成丙谷二肽；经过加热失活、过滤后，采用纳滤技术除去生成的盐，浓缩后用甲醇和水析晶，得到高纯度的丙谷二肽。此合成方法简单，高效，而且环保，具有极高的经济价值和市场竞争力。

Description

一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种合成丙谷二肽的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和现代化的分离技术的丙谷二肽生物合成方法，具体是一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用。
背景技术
N(2)-L-丙氨酞-L-谷氨酸胺属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，主要用于人体保健行业，是人体含量最丰富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品。
由于谷氨酰胺极为重要的生理功能和药理作用，使其在肠外营养中的应用受到人们普遍的重视。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下，生成有毒的焦谷酸和氨，所以商品氨基酸制剂中都不含有谷氨酰胺。只有将其转化为稳定的衍生物才能对人体起作用。
相对于谷氨酰胺而言，丙谷二肽的溶解度是谷氨酸胺的20倍，在储存和加热灭菌中也很稳定，可直接制备成输液制剂用于临床。丙谷二肽进入人体后即迅速分解成谷氨酰胺而发挥作用。研究证明，丙谷二肽在体内很快被分解为其组成氨基酸，半衰期很短，血液中只能检测到少量的二肽，仅有微量的二肽从尿液中排出，说明丙谷二肽可有效的被利用而且不会在血液中积聚，避免了可能产生的药理及生理性损害。健康人体长期静脉滴注丙谷二肽没有任何副作用及不良反应，不影响正常的肾功能。
CN101659691A和CN1786019A公开了一种丙谷二肽的化学合成和工业化生产方法(如下路线)，但是该方法反应合成路线长，环境污染大，工艺成本高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶。
本发明第二个目的是提供一种编码所述催化合成丙谷二肽的生物酶的核苷酸序列。
本发明第三个目的是提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶的制备方法。
本发明第四个目的是提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的应用，进一步提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法
本发明提供的丙谷二肽的生物合成采用生物酶法催化一步合成丙谷二肽；本发明利用毕氏酵母酶高效转化谷氨酰胺生成丙谷二肽，并采用现代化的先进分离技术，使丙谷二肽的工业化生产成本大大降低。
本发明的技术方案如下：
一种催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。
根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
本发明还提供一种编码所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供还一种所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；
(2)将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养，最后经发酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。
本发明进一步提供一种所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，包括如下步骤：
(1)把L-丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中；
(2)将L-谷氨酰胺加入水中，降温至5-15℃,用碱调pH至8.5-9.5，形成反应体系；
(3)将所述的生物酶加入到L-谷氨酰胺的反应体系中,并将(1)中配好的L-丙氨酸甲酯水溶液加入所述反应体系中，滴加碱水，pH保持在8.5-9.5；
(4)pH不变时，反应结束，加热反应体系，升温至60-100℃，使生物酶失活，过滤除生物酶；
(5)所得滤液除盐后，减压蒸馏至固体析出；
(6)经离心分离后，得丙谷二肽粗品；
(7)用甲醇和水精制，得丙谷二肽产品。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(5)中所得滤液经纳滤除盐后，减压蒸馏至固体析出。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(6)中用过滤离心机进行离心分离，得丙谷二肽粗品。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(2)中pH为9.0-9.3
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(1)中所得到L-丙氨酸甲酯盐酸盐的水溶液的质量浓度为30-60％。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(3)中所述生物酶的用量为谷氨酰胺质量的0.1-1.0％，进一步优选为0.5-0.8％。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐的用量为(以每升反应液计)：谷氨酰胺：50‐155g/L；L-丙氨酸甲酯盐酸盐70‐350g/L。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(4)中还加入活性炭脱色，促进过滤，所述活性炭的用量为反应液质量的3-8％。
根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述碱选自LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、K2CO3和Na2CO3中的一种或一种以上。
本发明所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养过夜。
(2)从平板上挑单菌落(直径1mm)至50ml YPD液体培养基(酵母粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，加水定容至1L)中，30℃、200rpm摇床振荡过夜培养过夜(24h)。OD600长至4-5。
(3)以10％的接种量接种到300mlYPD液体培养基中(1L三角瓶)摇瓶中，30℃、200rpm摇床振荡培养，约24h后OD600长到12左右。
(4)将发酵培养基按每升料配置好后，倒入发酵罐(30L)，121℃灭菌30min；降温后控制温度30℃，使用氨水调节pH值至5.0。
(5)将长好的种子液接种进罐，接种量5％。
(6)根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30％以上，诱导发酵96h后，菌体湿重达到约为340g/L左右放罐。
(7)离心，收集清液；
(8)将清液超滤浓缩后冻干，得到合成丙谷二肽用生物酶冻干粉。
本发明的技术方案主要是：构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株；建立有效的丙谷二肽生物酶发酵和提取工艺；得到有效的生物酶催化合成丙谷二肽的反应条件和分离手段。
本发明提供的所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，详述为如下步骤：
丙谷二肽的生物合成的反应式如下：
(1)把L-丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中；
(2)将L-谷氨酰胺加入水中，降温至5-15℃,用碱调pH至8.5-9.5；
(3)将生物酶加入到L-谷氨酰胺的反应体系中,并将(1)中配好的L-丙氨酸甲酯水溶液慢慢加入反应体系中，同时滴加碱水，使pH保持在8.5-9.5；
(4)pH不变时，加热升温至60℃使酶失活，过滤除酶；
(5)滤液经纳滤除盐后，减压蒸馏至有大量固体析出；
(6)离心分离，得丙谷粗品；
(7)用甲醇和水精制，得高纯度丙谷二肽产品。
步骤1中L-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为 30-60％；
步骤2中要求温度为5-15℃，最佳温度为10℃；要求pH为8.5-9.5，最佳pH为9.0；
步骤3中酶的用量为谷氨酰胺量的0.1-1.0％(w/w)，最佳量为0.5％；
步骤4中要求加热使酶失活，并加入活性炭脱色，促进过滤，活性炭的用量为反应液的3-8％；
步骤5中要求纳滤除盐，采用的纳滤膜截留分子量大于150，测定氯离子的含量，确定除盐效果；
步骤7中精制包括溶解、析晶、离心过滤、干燥粉碎和包装。
本发明的有益技术效果：
本发明提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用，本发明利用所述生物酶催化合成丙谷二肽；经过加热失活、过滤后，采用纳滤技术除去生成的盐，浓缩后用甲醇和水析晶，得到高纯度的丙谷二肽。
本发明提供的丙谷二肽的生物合成方法，合成路线简单，原料便宜易得，设备要求简单，用酶量极少(0.2％)，反应时间短(2‐3小时)，溶剂回收利用率高，除盐效果好；对设备要求简单；收率高，后处理简单，产品纯度高；成本低，具有极高的经济价值和市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明所应用LB液体培养基的组成：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，调节pH到7.0；加水定容至1L；
YPD培养基的组成：酵母粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，加水定容至1L；
BMGY液体培养基的组成：酵母粉10g，蛋白胨10g，YNB 13.4g，甘油10g，生物素0.004g，用磷酸盐缓冲液(0.1M)调节pH到6.0，加水定容至1L。
本发明产品依照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
实施例1：生物酶的基因工程菌株构建
将全基因合成的生物酶基因片段(序列如SEQ ID NO：1所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，经限制性内切酶EcoRI和Not I(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组到酵母表达载体pPIC9K(invitrogen公司)，转化到E.coli TOP10(购自北京全式金生物技术有限公司)中，将E.coli TOP10置于LB液体培养基中37℃、160转震荡培养过夜，中提重组质粒。利用限制性内切酶SalI(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)线性化重组质粒。
巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞(invitrogen公司)的制备:将Pichia Pastoris GS115单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的Pichia GS115按0.5％的接种量接入50ml YPD培养基中30℃培养至对数期，离心获得的菌体用20ml无菌水洗2次，再用20ml无菌1M山梨醇洗2次，加入1ml 1M山梨醇溶液重悬菌体获得巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞。
将线性化片段加入到80μl巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中冰浴5分钟，电转化后加入800μl山梨醇将细胞洗至1.5ml无菌离心管中，25℃温育2h后，离心涂MD平板，30℃培养至长出菌落后，划线分离出单菌落。将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase(购自sigma公司)后37℃温育1h消化细胞壁，取部分消化产物加入PCR体系检测阳性克隆。
将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养至OD为1.0时接入1％甲醇诱导，诱导72h，每24h补加一次甲醇用于表达本发明的生物酶。
实施例2：生物酶的发酵制备
取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养过夜。从平板上挑单菌落(直径1mm)至50ml YPD液体培养基(酵母粉10g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，加水定容至1L)中，30℃、200rpm摇床振荡过夜培养过夜(24h)。OD600长至4-5。以10％的接种量接种到300mlYPD液体培养基中(1L三角瓶)摇瓶中，30℃、200rpm摇床振荡培养，约24h后OD600长到12左右。将发酵培养基按每升料配置好后，倒入发酵罐(30L)，121℃灭菌30min；降温后控制温度30℃，使用氨水调节pH值至5.0。将长好的种子液接种进罐，接种量5％。根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30％以上。培养24h左右，待溶氧突变上升，此时湿重约为140g/L，开始补料30％(w/v)甘油，补料速度约为15ml/L发酵液/小时，补料速度控制溶氧保持在30％以上；待菌体湿重长至180g/L左右，停止补加甘油，以7.2ml/L发酵液/小时流速流加100％甲醇，诱导10h后，pH值调节为6.0，诱导24h，pH值调节为7.0，补料速度保持不变，根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30％以上。诱导96h后菌体湿重约为340g/L左右放罐。离心，收集清液，超滤浓缩后冻干，得到合成丙谷二肽用生物酶冻干粉350g。
实施例3：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用NaOH水溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品60g。
精制：把60g丙谷二肽粗品溶于60mL水中，于50℃，加入300mL甲醇，缓慢降温至5-10℃析晶4h，离心过滤，烘干粉碎得51g丙谷二肽纯品，收率85％，纯度99％。依照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。
实施例4：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至15℃,用NaOH水溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品50g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率83％，纯度98％。
实施例5：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至5℃,用氨水调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品55g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率85％，纯度97％。
实施例6：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用NaOH水溶液(2M)调pH至9.3，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品45g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率86％，纯度92％。
实施例7：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用NaOH水溶液(2M)调pH至8.8，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加NaOH水溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品48g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率87％，纯度94％。
实施例8：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用氨水调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加氨水溶液(20％)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品65g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率86％，纯度97％。
实施例9：
将158g L-谷氨酰胺(1.08mol)加入1400mL水中，降温至10℃,用氨水调pH至9.0，将630mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将225g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(1.62mol)溶解于200mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加氨水溶液(20％)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入100g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品165g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率88％，纯度98％。
实施例10：
将158g L-谷氨酰胺(1.08mol)加入1400mL水中，降温至10℃,用氨水调pH至9.0，将630mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将250g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(1.80mol)溶解于200mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加氨水溶液(20％)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入100g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品169g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率87％，纯度97％。
实施例11：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用LiOH溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加LiOH溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品41g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率85％，纯度96％。
实施例12：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用KOH溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加KOH溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品45g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率83％，纯度97％。
实施例13：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用K2CO3溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加K2CO3溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品50g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率82％，纯度97％。
实施例14：
将58g L-谷氨酰胺(397mmol)加入400mL水中，降温至10℃,用Na2CO3溶液(2M)调pH至9.0，将110mg酶干粉加入到反应体系中,然后将L-丙氨酸甲酯水溶液(将82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐(590mmol)溶解于100mL水中)滴加入反应体系中，同时滴加Na2CO3溶液(2M)，使pH保持在8.9-9.0；pH不变时，反应结束，加热升温至60℃失活30min，加入20g活性炭，搅拌10min后过滤；滤液经纳滤除盐，减压蒸馏至有大量固体析出；降温过滤，固体在50℃减压烘干得丙谷二肽粗品50g。
所述粗品的精制与实施例3同，收率84％，纯度98％。
本说明书描述了一些实施方式，然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书可获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应当包括在所附权利要求书范围内。

Claims (10)

1.一种催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，其特征在于，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
3.一种编码权利要求1所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种权利要求1所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；
(2)将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养，最后经发酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。
5.一种权利要求1所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)把L-丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中；
(2)将L-谷氨酰胺加入水中，降温至5-15℃,用碱调pH至8.5-9.5，形成反应体系；
(3)将所述的生物酶加入到L-谷氨酰胺的反应体系中,并将(1)中配好的L-丙氨酸甲酯水溶液加入所述反应体系中，滴加碱水，pH保持在8.5-9.5；
(4)pH不变时，反应结束，加热反应体系，升温至60-100℃，使生物酶失活，过滤除生物酶；
(5)所得滤液除盐后，减压蒸馏至固体析出；
(6)经离心分离后，得丙谷二肽粗品；
(7)用甲醇和水精制，得丙谷二肽产品。
6.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中所得到L-丙氨酸甲酯盐酸盐的水溶液的质量浓度为30-60％。
7.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述生物酶的用量为谷氨酰胺质量的0.1-1.0％。
8.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐的用量为：谷氨酰胺：50‐155g/L；L-丙氨酸甲酯盐酸盐70‐350g/L。
9.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步骤(4)中还加入活性炭脱色，促进过滤，所述活性炭的用量为反应液质量的3-8％。
10.根据权利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述碱选自LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、K2CO3和Na2CO3中的一种或一种以上。
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