CN110382705B - 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丙谷二肽的制备方法，包括在α‑氨基酸酯酰基转移酶存在下，以L‑丙氨酸甲酯盐酸盐和L‑谷氨酰胺为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为7.0‑9.0，在恒定温度20‑40℃下反应后，收集得到丙谷二肽；所述α‑氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌；所述α‑氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：6中任意一项所示的氨基酸序列。该制备方法高效简便，成本低，转化率高，绿色环保，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了丙谷二肽制备用酶及应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用。
背景技术
丙谷二肽，又称L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine，Ala-Gln)，是由丙氨酸和谷氨酰胺残基构成的生物活性二肽，是一种性质稳定且易溶于水的二肽分子。研究表明，丙谷二肽具有多方面的药理活性，如可以促进肌肉蛋白合成，改善危重病人的临床与生化指标；维持肠道的功能，保持机体氮平衡；增强免疫系统作用等。目前丙谷二肽已广泛应用于严重感染、创伤、大手术、大面积烧伤及恶性肿瘤等疾病的治疗。
现有工艺主要是通过化学合成的方法来合成丙谷二肽，然而这些化学合成方法通常合成过程复杂，中间环节多，易生成副产物，目的产物提纯困难，合成条件苛刻，常常使用一些有毒有害物质。
因此，有必要发展一种工艺简单、耗时短、成本低、环境污染少、产率高且绿色环保的丙谷二肽的制备方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用；本发明所述制备方法采用生物酶法，工艺简单、成本低、产量高和绿色环保。
第一方面，本发明提供了一种丙谷二肽的制备方法，包括：
在α-氨基酸酯酰基转移酶(XPD)存在下，以L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为7.0-9.0，在恒定温度20-40℃下反应后，收集得到丙谷二肽；所述α-氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)；所述α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：6中任意一项所示的氨基酸序列。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：7-SEQ IDNO：12中任意一项所示的核苷酸序列。本发明优选地α-氨基酸酯酰基转移酶具有突出的生物活性，极强的特异性，能够高效催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺转化成丙谷二肽。
可选地，所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。以此类推地，所述SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的编码基因分别包括如SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
可选的，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO：2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO：1。所述SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的编码基因也同样应该考虑简并碱基。
本发明中，所述丙谷二肽的制备方法的具体工艺路线如式(1)所示：
其中，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐的分子式为C4H9NO2HCl，化学结构如式I所示；所述L-谷氨酰胺，分子式为C5H10N2O3，化学结构如式II所示；所述丙谷二肽，分子式为C8H15N3O4，化学结构如式III所示。本发明所述制备方法采用生物酶法，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺在α-氨基酸酯酰基转移酶催化作用下生成丙谷二肽。
可选地，本发明所述制备方法中，调节所述反应液的pH为7.0-9.0。进一步可选地，调节所述反应液的pH为8.0-9.0。例如调节所述反应液的pH为8.2，，或为8.5，或为9.0。可选地，本发明所述制备方法中，所述反应液的反应温度恒定在20-40℃。进一步可选地，所述反应液的反应温度恒定在20-30℃。例如，所所述反应液的反应温度恒定在20℃，或为23℃，或为25℃，或为30℃，或为35℃。
可选地，所述反应的反应时间为20-120min。进一步可选地，所述搅拌反应的搅拌时间为20-30min。本发明所述制备方法的制备过程中可以通过采用检测手段监测丙谷二肽的含量，待丙谷二肽不再增加后停止所述反应；所述检测手段包括液相色谱法检测法。
可选地，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐的制备方法包括：将二氯亚砜在0-10℃温度下在滴加至含有甲醇的反应釜中；然后在所述反应釜中加入L-丙氨酸进行搅拌反应，所述搅拌反应的过程中先将所述温度缓慢升温至25-30℃，反应0.5-1.0小时后，继续将所述温度升温至45-50℃搅拌1.0-2.0小时；反应结束后收集得到所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
可选地，所述搅拌反应的搅拌速率为200-300rpm。可选地，所述反应结束后收集得到所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐的收集过程包括采用减压结晶的方法得到所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶以表达宿主细胞或酶粉形式加入至所述反应液。所述表达宿主细胞是指胞内含有表达有α-氨基酸酯酰基转移酶的核苷酸序列、能都稳定表达所述α-氨基酸酯酰基转移酶的宿主细胞。
可选地，基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因；所述肽酶基因包括氨肽酶基因和羧肽酶基因中的一种或多种。进一步地，可选地，基因敲除所述表达宿主细胞的肽酶A(pepA)基因、肽酶B(pepB)基因、肽酶D(pepD)基因和肽酶N(pepN)基因中的一种或多种。所述pepA、pepB、pepD或pepN对短肽均具有较强的水解作用。
可选地，所述基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因的过程包括：设计引物，采用基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行基因重组，敲除所述蛋白酶基因和/或所述肽酶基因。可选地，所述引物包括如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
进一步地，可选地，所述基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因的过程包括：设计引物，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行基因重组，敲除所述蛋白酶基因和/或所述肽酶基因，所述引物包括如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
可选地，所述表达宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌中的一种或多种。进一步地，可选地，所述大肠杆菌可以为大肠杆菌JM109(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)。本发明优选地大肠杆菌表达系统，培养周期短，制备成本低，酶产量高。通过基因敲除改造的所述表达宿主细胞具有更稳定、更高效表达α-氨基酸酯酰基转移酶的功效；同时，所述表达宿主细胞也可以更大量地释放生物活性高的所述α-氨基酸酯酰基转移酶。
可选地，所述收集得到丙谷二肽的过程包括对所述反应液进行分离，然后得到所述丙谷二肽。可选地，当所述α-氨基酸酯酰基转移酶以表达宿主细胞形式加入至所述反应液时，大部分所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺进入至所述表达宿主细胞的胞内，在所述胞内的α-氨基酸酯酰基转移酶催化作用下得到所述丙谷二肽并释放至胞外的所述反应液中，小部分所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺在所述反应液中的所述α-氨基酸酯酰基转移酶催化作用下得到所述丙谷二肽。可选地，所述丙谷二肽的制备方法中，也可以采用分离所述表达宿主细胞停止所述反应；所述分离的所述表达宿主细胞可以循环重复用于所述丙谷二肽的制备。
由于所述丙谷二肽为一种短肽产品，当通过由常规现有技术中制备的生物酶进行催化过程中，时常伴随着丙谷二肽的分解；因为所述生物酶体系中包含着大量的蛋白酶和/或肽酶，该蛋白酶和/或肽酶会对所述丙谷二肽产生分解，因此会大大影响丙谷二肽的产率。本发明所述敲除了蛋白酶基因和/或肽酶基因的表达宿主细胞制备得到的α-氨基酸酯酰基转移酶可以高效催化生成丙谷二肽；同时，所述表达宿主细胞不会产生蛋白酶和/或肽酶，不会对胞内或胞外的丙谷二肽产生分解。此外，胞内的α-氨基酸酯酰基转移酶的催化生成丙谷二肽的效率高于表达宿主细胞释放在反应液中的α-氨基酸酯酰基转移酶的催化生成丙谷二肽的效率。
可选地，所述表达宿主细胞在所述反应液中的质量分数为1％-5％。进一步地，可选地，所述表达宿主细胞在所述反应液中的质量分数为1％-3％。
可选地，所述表达宿主细胞可以但不限于以表达宿主细胞溶液形式添加至所述反应液中。可选地，所述表达宿主细胞溶液还包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的任意一种或多种。可选地，所述缓冲液还包括其他种类缓冲液。可选地，所述缓冲液的浓度为10-500mmol/L。优选地，所述缓冲液的浓度为200-500mmol/L。例如，所述缓冲液的浓度为100mmol/L，或为200mmol/L，或为500mmol/L。
可选地，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐在所述反应液中的质量分数为3％-15％；所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺的质量比为1∶(0.3-2)。进一步地，可选地，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐在所述反应液中的质量分数为10％-15％。例如，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐在所述反应液中的质量分数为5％，或为10％，或为15％，或为20％。进一步地，可选地，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺的质量比为1∶(0.5-1.5)。例如，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺的质量比为或为1∶0.8，或为1∶1，或为1∶1.2。
可选地，所述L-谷氨酰胺和所述α-氨基酸酯酰基转移酶的质量比为1∶(0.1-2)。进一步地，可选地，所述L-谷氨酰胺和所述α-氨基酸酯酰基转移酶的质量比为1∶(0.5-1)。
本发明第一方面所提供的丙谷二肽的制备方法，所述制备方法采用生物酶法，整个工艺简便高效，绿色安全，成本低廉，耗时短；由所述制备方法制得的丙谷二肽具有极高的产率。
第二方面，本发明还提供了一种丙谷二肽的制备用酶，所述制备用酶包括α-氨基酸酯酰基转移酶，所述α-氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌；所述α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6中任意一项所示的氨基酸序列。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：7-SEQ IDNO：12中任意一项所示的核苷酸序列。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶通过构建重组质粒在表达宿主细胞中表达，所述重组质粒的载体质粒为pET28a(+)载体质粒。将所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列插入至所述pET28a(+)载体质粒中得到重组质粒，所述重组质粒可以高效、高产地在表达宿主细胞中的异源表达得到所述α-氨基酸酯酰基转移酶。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的多克隆位点区域。例如所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列可以但不限于插入到pET28a(+)载体质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间。所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamH I酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列上增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上His标签，His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。
由于不同种属来源的α-氨基酸酯酰基转移酶的酶学性质存在差异，包括酶的比活性、酶作用的底物范围、最适pH、最适温度、作用时间和酶的稳定性等方面。本发明第二方面提供的丙谷二肽的制备用酶-α-氨基酸酯酰基转移酶，具有很好的生物活性，纯度高；相比于传统方法，本发明优选的α-氨基酸酯酰基转移酶具有更高的产率，耗时短，具有更强的生物活性及特异性。
可选地，所述α-氨基酸酯酰基转移酶通过表达宿主细胞制备得到；所述表达宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌中的一种或多种。
可选地，基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因；所述肽酶基因包括氨肽酶基因和羧肽酶基因中的一种或多种。
可选地，所述基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因的过程包括：设计引物，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行基因重组，敲除所述蛋白酶基因和/或所述肽酶基因，所述引物包括如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供了α-氨基酸酯酰基转移酶以及含有所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因的微生物菌株在生物催化中的应用，所述α-氨基酸酯酰基转移酶由来源于脑膜败血伊丽莎白菌的α-氨基酸酯酰基转移酶基因编码，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：12中任意一项所示的核苷酸序列；所述α-氨基酸酯酰基转移酶催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺转化生成丙谷二肽。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1、本发明所述的制备方法采用生物酶法，转化率高、成本低和绿色安全，可以广泛适用于工业化规模生产；
2、本发明所述的制备方法使用的制备用酶-α-氨基酸酯酰基转移酶的具有突出的生物活性，极强的特异性，能够高效催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺转化成丙谷二肽；
3、本发明所述的制备方法，底物终浓度可高到达3％-15％，远远高于传统工艺底物终浓度；
4、经基因敲除改造的表达宿主细胞能够更加高效、大量在胞内表达α-氨基酸酯酰基转移酶并释放反应液中，可以大大提升反应转化率，且制备得到的丙谷二肽产量更高、纯度更好。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的pET28a-XPD02重组质粒的质粒图谱；
图2为本发明一实施例提供的丙谷二肽核磁氢谱；
图3为本发明一实施例提供的丙谷二肽核磁碳谱。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
1、α-氨基酸酯酰基转移酶的表达
(1)α-氨基酸酯酰基转移酶的核苷酸序列
通过实验筛选获得α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01，所述α-氨基酸酯酰基转移酶XPD01的核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；
(2)根据表1设计的上、下游引物，通过反向PCR技术对α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01进行突变等基因改造，制备得到α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02至XPD-07；其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02至XPD-07对应的核苷酸及氨基酸序列参见表2：
表1.突变引物序列
所述PCR扩增体系实验参数如下：
PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；55-65℃退火30s；72℃延伸7min；30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，分别利用限制性内切酶进行酶切，酶切后用T4连接酶连接至质粒pET28a(+)。提取质粒，经过测序成功后即得到的重组质粒。例如，以α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02为例，提供上游引物和下游引物，并通过实验得到的α-氨基酸酯酰基转移酶(XPD-02)的基因编码序列；所述α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
将所述XPD-02的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间。所述XPD-02的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述XPD的基因编码序列的5’端添加起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamH I酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定，以成功构建pET28a-XPD-02重组质粒，如图1所示的重组质粒pET28a-XPD-02的质粒图谱。其他α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01，及XPD-03至XPD-07的重组质粒可同样参照上述方法制得。
选取表达宿主细胞，所述表达宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌中的一种或多种。将制备得到的重组质粒转至表达宿主细胞-大肠杆菌中，表达得到对应的α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01至XPD-07。
表2.α-氨基酸酯酰基转移酶数据表
2、α-氨基酸酯酰基转移酶酶活力测定
(1)取0.5mL菌液，加入500μL含有200mM谷氨酰胺，200mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐，在pH＝9的0.1M硼酸-氢氧化钠缓冲液，混匀后置25℃恒温水浴锅中反应5min，加入等体积的1.7％磷酸(v/v)溶液终止反应，12000r/min离心5min，取反应液上清按高效液相色谱(HPLC)方法测定丙谷二肽浓度，(备注：一个酶活单位定义为1min内生成1μmol产物所需酶量)；实验测试参数参见下表(备注：按体积比计算)：
| 色谱柱 | 月旭UItimate XB-NH2 5μm×250×4.6mm |
| 流动相 | 0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH值至4.0)-乙腈(35∶65) |
| 仪器型号 | Agilent1260 |
| 检测器 | UV215nm |
| 流速 | 1.0mL/min |
| 柱温 | 30℃ |
| 进样量 | 20μL |
| 样品处理 | 用流动相稀释 |
| 产品浓度 | 0.5mg/mL左右 |
标准曲线的绘制：设置进样量和进样度分别为2μL、4μL、5μL、6μL、8μL，绘制标准曲线；计算得到的α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01至XPD-07的酶活力相关数据，并计算通过基因改造获得的α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02至XPD-07相比于α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01的酶活力增长率，如下表3所示，：
表3.α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01至XPD-07的酶活力数据表
实验测试结果显示，本申请所述的α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02至XPD-07具有突出的酶活力，相较于α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-01均具有较高的酶活力增长率，且pH稳定性也有较大的范围增长，特别是α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-04的酶活力增长率高于50％。
3、α-氨基酸酯酰基转移酶在重组改造后的表达宿主细胞上的表达
(1)选取表达宿主细胞，所述表达宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌中的一种或多种。所述大肠杆菌可以为大肠杆菌JM109(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行重组，包括如下步骤：
a)基因克隆
设计引物，分别以PASGF/PASGR、PBSGF/PBSGR、PDSGF/PDSGR和PNSGF/PNSGR的引物对，以质粒pTargetF为模板，PCR扩增出可识别pepA、pepB、pepD和pepN基因的pTargetF，并带有与基因组中目的片段20bp碱基互补的sgRNA，然后分别命名为sgRNA-pepA、sgRNA-pepB、sgRNA-pepD和sgRNA-pepN；然后将所述扩增的PCR产物转化至大肠杆菌DH5α内，分别利用上述引物鉴定阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆分别命名为pTargetF-pepA、pTargetF-pepB、pTargetF-pepD和pTargetF-pepN。
分别以引物PA01/PA02和PA03/PA04、PB01/PB02和PB03/PB04、PD01/PD02和PD03/PD04、PN01/PN02和PN03/PN04扩增用于同源重组的pepA、pepB、pepD和pepN基因的上下游同源臂片段pepA上/下、pepB上/下、pepD上/下和pepN上/下，然后通过重叠PCR(Overlap PCR)将pepA上/下、pepB上/下、pepD上/下和pepN上/下分别连接起来，将测序条带正确的分别命名pepA同、pepB同、pepD同和pepN同。
其中，所述PA01包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；所述PA02包括如SEQ IDNO：14所示的核苷酸序列；所述PA03包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；所述PA04包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；所述PASGF包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；所述PASGR包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。所述PB01包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；所述PB02包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；所述PB03包括如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；所述PB04包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；所述PBSGF包括如SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列；所述PBSGR包括如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。所述PD01包括如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列；所述PD02包括如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列；所述PD03包括如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列；所述PD04包括如SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列；所述PDSGF包括如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列；所述PDSGR包括如SEQID NO：30所示的核苷酸序列。所述PN01包括如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列；所述PN02包括如SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列；所述PN03包括如SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；所述PN04包括如SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列；所述PNSGF包括如SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列；所述PNSGR包括如SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
b)基因敲除
将pCas转化到表达宿主细胞中，然后挑取含有pCas的单克隆，再加入50mg/L卡那霉素的LB培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为0.2时，向摇瓶中加入终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导pCas载体上λ-Red蛋白的表达，然后摇至OD600为0.6时回收表达宿主细胞并制备电转感受态。电转时，向100μL的制备得到的感受态细胞中加入100ng的pTargetF质粒(包括pTargetF-pepA、pTargetF-pepB、pTargetF-pepD和pTargetF-pepN中的一种或多种)和400ng的同源臂DNA片段(包括pepA同、pepB同、pepD同和pepN同中的一种或多种)，轻柔混合后，加入到预冷的0.2cm电转杯中，在2.2kv的条件下放入电转仪(Bio-Rad)中电转，电转完后迅速加入1mL的LB培养基，30℃、180rpm培养1h复苏，涂含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的LB双抗平板上，30℃培养；挑取单克隆，PCR验证正确后消除pTargetF和pCas。
所述消除pTargetF和pCas的步骤包括：将重组的表达宿主细胞(含有pTargetF和pCas)培养在50mg/L卡那霉素LB培养基中，并加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养过夜，并将其涂布于含50mg/L卡那霉素的平板上用于消除pTargetF，待平板上长出单克隆，挑取该单克隆在含50mg/L壮观霉素的液体LB中培养过夜，不长即为pTargetF消除的重组的表达宿主细胞，然后挑取该重组的表达宿主细胞在42℃的环境中培养过夜，用以消除pCas。
(2)α-氨基酸酯酰基转移酶的表达
以α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-02为例，将构建的重组质粒pET28a-XPD-02转入重组的表达宿主细胞中，并以1％的接种量接种至含有4mL的LB培养基中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将表达宿主细胞以1％的接种量转接到含有1LLB培养基(50μg/mL卡那霉素)的三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的OD600值达到0.6左右，加入终浓度为度0.5mM的诱导剂IPTG，在30℃条件培养16-20小时后离心收集表达宿主细胞。将表达宿主细胞用100mM硼砂-硼酸缓冲液(pH＝8.0)进行重悬并保存得到表达宿主细胞溶液。通过参数调节，可以制得质量分数各异的表达宿主细胞溶液；实验过程中，通常加入质量分数为5％-50％的表达宿主细胞溶液。
取部分表达宿主细胞溶液，经超声破碎和离心，收集所述XPD-02；采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。本实施方式表达获得的XPD和XPD的分子大小均与相应蛋白的理论计算值相近，其中，XPD-02的理论分子量为66.8kDa。此外，对收集得到的XPD-02进行进一步纯化，可制得XPD-02酶粉。其他α-氨基酸酯酰基转移酶XPD-03至XPD-07可采用上述制备方法相应制备得到，本实施方式不做过多论述。
实施例1
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
将180g甲醇加入1L反应釜中，并降温至15℃；将78.6g二氯亚砜在10℃滴加入反应釜中；二氯亚砜滴加完全后将L-丙氨酸加入到反应釜中，保温搅拌30min，再缓慢升温至25℃，搅拌1h，再升温至50℃搅拌2h；50℃减压蒸馏，结晶制得82g L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将100mL XPD-02细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-02细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液625mL，得到丙谷二肽含量59.9g/L，转化率92.0％。
对制得的丙谷二肽进行取样检测，得到丙谷二肽核磁氢谱(图2)、和丙谷二肽核磁碳谱(图3)。
实施例2
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
将180g甲醇加入1L反应釜中，并降温至10℃；将78.6g二氯亚砜在0℃滴加入反应釜中；二氯亚砜滴加完全后将L-丙氨酸加入到反应釜中，保温搅拌60min，再缓慢升温至30℃，搅拌2h，再升温至45℃搅拌2h；50℃减压蒸馏，结晶制得82.7g L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将100mL XPD-02细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-02细胞在整个反应液中的质量百分比为5.0％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在9，温度保持在40℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液625mL，得到丙谷二肽含量60.6g/L，转化率93.0％。
实施例3
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
将180g甲醇加入1L反应釜中，并降温至15℃；将78.6g二氯亚砜在5℃滴加入反应釜中；二氯亚砜滴加完全后将L-丙氨酸加入到反应釜中，保温搅拌60min，再缓慢升温至30℃，搅拌1.5h，再升温至48℃搅拌2h；50℃减压蒸馏，结晶制得82.5g L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将100mL XPD-03细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-03细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液625mL，丙谷二肽含量60.4.g/L，转化率92.8％。
实施例4
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将80mL XPD-04细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-04细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液600mL，丙谷二肽含量61.5g/L，转化率94.5％。
实施例5
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将100mLXPD-05细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-05细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，调节pH＝8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液625mL，丙谷二肽含量55.8g/L，转化率85.7％。
实施例6
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将90mL XPD-06细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-05细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液612.5mL，丙谷二肽含量60.7g/L，转化率93.2％。
实施例7
一种丙谷二肽的制备方法，包括：
取反应底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐20g和谷氨酰胺21g溶解在纯水(400mL)中，将50mL XPD-07细胞溶液缓慢加入反应底物中，其中XPD-07细胞在整个反应液中的质量百分比为1.5％，实时监控反应液的pH值，用5M氢氧化钠溶液调节pH值在8，温度保持在25℃。反应过程中取样稀释后用液相色谱法检测生成丙谷二肽量。丙谷二肽开始分解时停止反应。反应液离心后，上清加入终浓度20％甲醇60℃水浴30min，0.5％活性炭搅拌30min，离心得上清反应液562.5mL，丙谷二肽含量60.9g/L，转化率93.5％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司
邦泰合盛生物科技（深圳）有限公司
江西安泽麦生物科技有限公司
<120> 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用
<130>
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 脑膜败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）
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Claims (14)
1.一种丙谷二肽的制备方法，其中，包括：
在α-氨基酸酯酰基转移酶存在下，以L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为7.0-9.0，在恒定温度20-40℃下反应后，收集得到丙谷二肽；所述α-氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌；所述α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：6中任意一项所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列为SEQ ID NO：7 - SEQ ID NO：12中任意一项所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶以表达宿主细胞或酶粉形式加入至所述反应液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐的制备方法包括：将二氯亚砜在0-10℃温度下滴加至含有甲醇的反应釜中；然后在所述反应釜中加入L-丙氨酸进行搅拌反应，所述搅拌反应的过程中先将所述温度缓慢升温至25-30℃，反应0.5-1.0小时后，继续将所述温度升温至45-50℃搅拌1.0-2.0小时；反应结束后收集得到所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐在所述反应液中的质量分数为3%-5%；所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和所述L-谷氨酰胺的质量比为1：（0.5-1.5）。
6.如权利要求3所述的制备方法，其中，所述表达宿主细胞在所述反应液中的质量分数为1%-5%。
7.如权利要求3所述的制备方法，其中，基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因；所述肽酶基因包括氨肽酶基因和羧肽酶基因中的一种或多种，所述肽酶基因选自肽酶A基因、肽酶B基因、肽酶D基因和肽酶N基因中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的制备方法，其中，所述基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因的过程包括：设计引物，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行基因重组，敲除所述蛋白酶基因和/或所述肽酶基因。
9.一种丙谷二肽的制备用酶，其中，所述制备用酶为α-氨基酸酯酰基转移酶，所述α-氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌；所述α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：6中任意一项所示的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的丙谷二肽的制备用酶，其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列为SEQ ID NO：7 - SEQ ID NO：12中任意一项所示的核苷酸序列。
11.一种丙谷二肽的制备用酶的制备方法，其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶通过表达宿主细胞制备得到；所述表达宿主细胞为大肠杆菌和酵母菌中的一种或两种，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：6中任意一项所示的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的丙谷二肽的制备方法，其中，基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因；所述肽酶基因包括氨肽酶基因和羧肽酶基因中的一种或多种，所述肽酶基因选自肽酶A基因、肽酶B基因、肽酶D基因和肽酶N基因中的一种或多种。
13.如权利要求11所述的制备方法，其中，所述基因敲除所述表达宿主细胞的蛋白酶基因和/或肽酶基因的过程包括：设计引物，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对所述表达宿主细胞进行基因重组，敲除所述蛋白酶基因和/或所述肽酶基因。
14.α-氨基酸酯酰基转移酶以及含有所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因的微生物菌株在生物催化中的应用，其中，所述α-氨基酸酯酰基转移酶由来源于脑膜败血伊丽莎白菌的α-氨基酸酯酰基转移酶基因编码，所述α-氨基酸酯酰基转移酶的基因编码序列为SEQ IDNO：7 - SEQ ID NO：12中任意一项所示的核苷酸序列；所述α-氨基酸酯酰基转移酶催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺转化生成丙谷二肽，所述生物催化为催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺转化生成丙谷二肽。
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