CN105274174A - 一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丙谷二肽的制备技术领域，具体公开了一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，包括：1）生物酶液的制备：将生物酶溶解在缓冲溶液中，控制pH值在7.0±2.0内，控温5～10℃，制得生物酶液，其中所含酯酰基转移生物酶的质量分数为5%～20%；2)将底物L-丙氨酸的酯类衍生物和谷氨酰胺溶解在纯化水中，之后将生物酶液均匀滴加到反应液中，同时加入酸液或碱液控制反应液pH在5～10，控温15～25℃反应，反应过程取样检测丙谷二肽生成量，当其含量最高时停止反应，所得转化液经分离得到丙谷二肽。本发明方法使得酶的活性高，物料反应率更高，具有工艺控制简单、质量指标容易控制、成本低的优点，更适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及丙谷二肽的制备技术领域。
背景技术
N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酸胺（又称丙氨酰谷氨酰胺）属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，主要用作氨基酸类肠外营养剂，具有重要的医疗价值和经济价值。
丙谷二肽的制备技术主要有化学合成法和微生物酶转化法，化学合成法主要存在合成路线长、生产周期长、环境污染大、工艺条件严格和成本高的缺点。
公布号为CN104480075A的专利公开了一种生物酶催化转化制备丙谷二肽的方法，其生物酶制备和使用采用生物酶冻干粉的形式，使用不方便，且酶活低，物料反应率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，具有生产时间短、工艺控制简单、生产方便无污染、物料反应率高、低成本的优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，包括以下步骤：
1）生物酶液的制备：将生物酶溶解在缓冲溶液中，控制pH值在7.0±2.0内，控温5～10℃，制得生物酶液，其中所含酯酰基转移生物酶的质量分数为5%～20%；所属酯酰基转移生物酶为胞内酶，其基因载体为大肠杆菌和酵母菌；
2)将底物L-丙氨酸衍生物和谷氨酰胺溶解在纯化水中，之后将生物酶液均匀滴加到反应液中，同时加入酸液或碱液控制反应液pH在5～10，控温15～25℃反应，反应过程取样检测丙谷二肽生成量，当其含量最高时，一般为60～120g/L，停止反应，所得转化液经分离得到丙谷二肽；
所述L-丙氨酸衍生物为L-丙氨酸的酯类衍生物。
优选的，所述缓冲溶液为磷酸氢二钾-磷酸缓冲溶液。
所述酸液为质量分数为10%-50%的盐酸、硫酸、磷酸或醋酸，所述碱液为质量分数为10%-50%的碳酸钠、碳酸氢钠、氨水或三乙胺。
进一步地，所述L-丙氨酸衍生物为丙氨酸异丙酯或丙氨酸甲酯。
进一步地，所述丙氨酸异丙酯加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为2:1。
进一步地，所述丙氨酸甲酯加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为1.4～1.2:1。
进一步地，所述生物酶的加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为12～17:100。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
1）本发明将生物酶溶解于缓冲溶液中制成生物酶液使用，相比现有技术中采用生物酶冻干粉，能够使酶的活性更高，酶活可达4500～6000U,酶的催化转化能力更高，催化转化反应效率高，同时具有操作简便的优点，更适用工业生产应用。
2）本发明相比于现有技术改进了物料的加入顺序，首先将底物完全溶解于水中使混合更均匀，再缓慢滴加生物酶液，物料反应率更高，转化率高达90%以上。
3）本发明工艺控制简单、质量指标容易控制、实施成本低，更适于工业化生产。
具体实施方式
下面举例对本发明方法作进一步说明。
实施例1
取生物酶350g溶解在3000ml的磷酸氢二钾-磷酸缓冲溶液中，调节PH至7.5，控温5～10℃，制备得到生物酶液。经检测酶活为5122U。用纯化水分别与盐酸、氨水配制质量分数15%的稀盐酸和稀氨水备用。
取反应底物丙氨酸异丙酯5kg和谷氨酰胺2.5kg溶解在50L纯化水中，将生物酶液缓慢均匀加入到反应底物中，控制加入速度15ml/min，实时监控反应液的pH，用制得的稀盐酸和稀氨水加入反应底物中，控制反应液pH在5～10，同时保持温度15～25℃。反应过程中抽样检测，液相色谱法检测生成的丙谷二肽量，丙谷二肽生成量为最大时停止反应，得到转化液中丙谷二肽含量5.0%wt，谷氨酰胺剩余量为0.13%wt，转化液经分离提纯后制得力肽3.5kg，转化率93.5%。
实施例2-4
实施例2-4中生物酶、底物的用量见表1，生物酶溶解在300ml的磷酸氢二钾-磷酸缓冲溶液中，经检测酶活为5428U。底物溶解在50L纯化水中，其余步骤和反应条件与实施例1相同，反应停止后转化液中各物质含量见表2。
实施例5-7
实施例5-7中生物酶、底物的用量见表3，生物酶溶解在2900ml的磷酸氢二钾-磷酸缓冲溶液中，底物溶解在60L纯化水中，其余步骤和反应条件与实施例1相同，反应停止后转化液中各物质含量见表4。
需要说明的是，反应液中调控pH用稀盐酸和稀氨水可根据需要，制备成不同浓度，方便使用。
Claims (7)
1.一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）生物酶液的制备：将生物酶溶解在缓冲溶液中，控制pH值在7.0±2.0内，控温5～10℃，制得生物酶液，其中所含酯酰基转移生物酶的质量分数为5%～20%；所属酯酰基转移生物酶为胞内酶，其基因载体为大肠杆菌和酵母菌；
2)将底物L-丙氨酸衍生物和谷氨酰胺溶解在纯化水中，之后将生物酶液均匀滴加到反应液中，同时加入酸液或碱液控制反应液pH在5～10，控温15～25℃反应，反应过程取样检测丙谷二肽生成量，当其含量最高时，停止反应，所得转化液经分离得到丙谷二肽；
所述L-丙氨酸衍生物为L-丙氨酸的酯类衍生物。
2.根据权利要求１所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于所述缓冲溶液为磷酸氢二钾-磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求１所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于所述酸液为质量分数为10%-50%的盐酸、硫酸、磷酸或醋酸，所述碱液为质量分数为10%-50%的碳酸钠、碳酸氢钠、氨水或三乙胺。
4.根据权利要求１所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于所述L-丙氨酸衍生物为丙氨酸异丙酯或丙氨酸甲酯。
5.根据权利要求4所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于，所述丙氨酸异丙酯加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为2:1。
6.根据权利要求4所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于，所述丙氨酸甲酯加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为1.4～1.2:1。
7.根据权利要求1所述的一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法，其特征在于，所述生物酶的加入量与谷氨酰胺的加入量的质量之比为12～17:100。
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