CN1823069A - 合成β－内酰胺酶抑制剂中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶法生产式(I)的中间体二环－杂芳基－2－甲酸的方法，其中X和Y定义于说明书中，该化合物适用于通过以下方法制备β内酰胺酶抑制剂：选择性酶解式(II)和(III)的位置可水解酯的混合物，其中X、Y和R定义于说明书中。
Description
发明领域
本发明涉及酶法合成二环-杂芳基-2-甲酸中间体的方法，该中间体适用于通过选择性酶解位置水解酯的混合物来制备β-内酰胺酶抑制剂。
发明背景
为了治疗人类疾病，不断地需要新的改良的抗生素。抗生素抗性生物体是持续的问题，而万古霉素是最后的防线，特别是在医院，万古霉素抗性株在医院分离的病原体中持续增高。最近的调查发现美国医院的肠球菌属的7.9％现在是万古霉素抗性株(“NosocomialEnterococci Resistant to Vancomycin”Morbidity and Mortality WeeklyReport 42(30)：597-598(1993))。报道了其它的抗万古霉素抗性和其它抗屎肠球菌(Enterococcus faecium)的抗生素，(Handwergers.et al.，Clin.Infect.Dis.1993(16)，750-755)。耐药生物体对其它重要的抗生素也是难题，包括哌拉西林。在克服抗药性生物体，并通过抑制某些耐药菌株产生的特异性酶，β内酰胺酶的活性提高抗生素的有效性的努力中，β内酰胺酶抑制剂于目前使用的抗生素联用或同时给予。
显然，抗生素抗性是一个发展的公共健康问题，开发新抗生素可给内科医生提供附加的选择治疗方案。此外，医疗界认识到对附加的抗生素有持续的需求，目前β内酰胺酶抑制剂有利于增强目前现有的已发展出抗性的抗生素。
新的β内酰胺酶抑制剂的制备需要可有效产生制备β内酰胺酶终产物所必需的中间体的方法。在许多合成方法的情况下，生产出的化合物的混合物需要色谱分离纯化。
本发明克服了混合物纯化和分离的问题，方式为提供另外的方法以通过选择性酶解位置酯异构体混合物中的一个酯异构体，制备单一羧酸中间体。水解酶如脂肪酶、酯酶或蛋白酶在动力学拆分分离手性分子上的用法，已在文献中完整建立，(Zaks，A，.Curr.Opinionin Chem Biol.2001，5，130-136.；Wang，C-H and Whitesides G.M.InEnzymes in synthetic organic chemistry：Tetrahedron organic chemistryseries vol.12：pp.41-130，Pergamon press；Berglund P，and Hult，K.Biocatalytic synthesis of enantiopure compounds using脂肪酶s，pp633-657，In“Stereoselective biocatalysis”，ed.Patel，R.N.Marcel DekkerInc.，2000)。优选通过酶裂解存在于相同分子上的一个酯基(也称为特定选择性)也是已知的，(Keller，J.W，Hamilton，B.J.，TetrahedronLetts.1986，27，1249.；Pirrung M.C.，and Krishnamurthy N.，J.Org.Chem.1993，58，954)。
但是，通过酶解选择性水解位置酯异构体，并分离本发明所述的所需的羧酸中间体化合物是未知的。
发明概述
本发明涉及制备式7的二环-杂芳基-2-甲酸的方法，
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，该方法包括酶解其中X、Y和R如上所定义的二环-杂芳基-2-甲酸酯6，或选择性地在下式的二环-杂芳基-2-甲酸酯6和二环-杂芳基-3-甲酸酯5的混合物中酶解，其中X、Y和R如上所定义：
和
产生下式的二环-杂芳基-2-甲酸7
其中Y如上所定义，并分离二环-杂芳基-2-甲酸7。
烷基为1-6个碳原子的直链或支链烷基部分。
芳烷基(C1-C6)指1-6个碳原子的烷基部分被芳基部分取代，其中芳基部分被定义为有6-12个碳原子的芳烃部分，该部分选自下述基团：苯基、α-萘基、β-萘基、联苯基、蒽基、四氢萘基、芴基、茚满基、亚联苯基和苊基。芳烷基(C1-C6)部分包括苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、3-苯乙基、2-苯丙基、4-硝基苄基等。
早期的专利申请描述了用色谱法分离位置(positional)酯混合物，将合适的酯还原为醇，再将醇氧化为醛，制备二环杂芳基-2-甲醛的方法。(参见U.S.Ser.No.60/377052，申请日2002年5月1日，Wyeth CaseAM100862L1)。此处所述的合成方法不需使用色谱法。
在本发明中，专一性酶切一种酯异构体有效的促进了所需中间体羧酸的分离，有利于从第二酯异构体制备β内酰胺酶抑制剂。
5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸是制备β内酰胺酶抑制剂，(5R，6Z)-6-(5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-基亚甲基)-7-氧代-4-硫代-1-氮杂二环[3.2.0]庚-2-烯-2-甲酸的关键中间体，该关键中间体可通过化学水解位置异构体的混合物形成，或色谱分离单一位置异构体然后化学水解形成。但是化学水解异构体混合物后，需要进行另一步困难的色谱分离以分离5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸。
如本文所述，5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸是从酯异构体的混合物通过酶解水性溶剂中的所需的酯来选择性合成的。通过化学方法分离酯可导致非选择性水解不需要的酯，从而产生的酸的低异构体纯度。此外，酶解可消除结晶步骤。5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸的分离的酸的纯度可高于99％，所述酶法的收率可至少为82％，并包括非常简单的处理步骤：通过有机溶剂萃取含水溶剂分离不需的酯，酸化含水溶剂并过滤分离不溶性酸。处理条件简单、酶价格低廉，提高了制备5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸的处理有效性。
特别是本发明为酶解下式的二环杂芳基-2-甲酸酯6和二环杂芳基-3-甲酸酯5混合物：
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，来选择性产生下式的二环杂芳基-2-甲酸7；
其中X和Y如上所定义；
包括：
a)使其中X、Y和R如上所定义的二环杂芳基-2-甲酸酯6和二环杂芳基-3-甲酸酯5的混合物与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
b)通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
c)通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
d)分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
e)分离作为游离酸或其药学上可接受的盐的下式的二环杂芳基-2-甲酸7，
其中X和Y如上所定义。
特别是，脂肪酶、酰基转移酶和蛋白酶表现出对5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯的特异性高于对5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯。
本发明还提供制备下式的二环杂芳基甲醛11的方法
其中：
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
该方法包含以下步骤：
a.用亚硝化试剂将其中X和Y为上述所定义的式1的氨基酸亚硝基化，
形成其中X和Y为上述所定义的式2的亚硝基化合物
b.将亚硝基化合物2与脱水剂反应，并用无机碱中和，形成其中X和Y为上述所定义的式3的内鎓盐
c.式3的内鎓盐与其中R1为1-6个碳原子的烷基的式HC≡CCO2R14的丙炔酸酯在非质子溶剂中反应，形成式5的二环-杂芳基-3-甲酸酯和式6的二环-杂芳基-2-甲酸酯的混合物，其中R1、X和Y如上述所定义
d.使二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
e.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
f.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
g.分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
h.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7或其盐
其中X和Y如上所定义；
i.使二环-杂芳基-2-甲酸7或其药学上可接受的盐与酰卤试剂或偶联试剂反应，形成活性中间体8，其中Q为从偶联试剂或酰卤试剂形成的离去基团，其中X和Y如上所定义
j.使活性中间体8或二环-杂芳基-2-甲酸7与式R3NHOR2 9的取代羟胺反应，其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基，在有机碱存在下反应得到式10的酰胺
其中X和Y如上所定义；
用还原剂还原式10的酰胺得到二环杂芳基甲醛11
其中X和Y如上所定义，并分离二环杂芳基甲醛11。
另一个本发明的实施方案提供了制备二环杂芳基甲醛11的方法
其中：
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
该方法包括以下步骤：
a.使二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中X和Y如上所定义且R1为1-6个碳原子的烷基
与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
b.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
c.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
d.分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
e.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7或其药学上可接受的盐
其中X和Y如上所定义；
f.使二环杂芳基-2-甲酸7或其盐与酰卤试剂或偶联试剂反应形成活性中间体8，其中Q为形成自偶联试剂或酰卤试剂的离去基团，X和Y如上所定义
g.使活性中间体8或二环-杂芳基-2-甲酸7与式R3NHOR2 9的取代羟胺其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基，在有机碱的存在下反应得到式10的酰胺
其中X、Y、R2和R3如上所定义；
h.用还原剂还原式10的酰胺得到式11的二环杂芳基甲醛
11
其中X和Y如上所定义并分离式11的二环杂芳基甲醛。
本发明还提供制备下式的二环杂芳基青霉烯-2-甲酸16、保护的酸、药学上可接受的盐优选碱金属盐的方法
其中：
A和B其中之一表示H，另一个表示以下部分
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
R3为1-6个碳原子的烷基；
R6为H、选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基、-CHR3OCOC1-C6的体内可水解的酯或药学上可接受的盐，优选碱金属盐；
该方法包含以下步骤：
a.用亚硝化试剂将其中X和Y为上述所定义的式1的氨基酸亚硝基化，
形成其中X和Y为上述所定义的式2的化合物
b.将亚硝基化合物2与脱水剂反应，并用无机碱中和，形成其中X和Y为上述所定义的式3的内鎓盐
c.式3的内鎓盐与其中R1为1-6个碳原子的烷基的式HC≡CCO2R14的丙炔酸酯在非质子溶剂中反应，形成二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中R1、X和Y如上述所定义
d.使其中X、Y和R1如上所定义的二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
e.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
f.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
g.分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
h.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义；
i.使二环-杂芳基-2-甲酸7或其药学上可接受的盐与酰卤试剂或偶联试剂反应，形成式8的活性中间体反应，其中Q为从偶联试剂或酰卤试剂形成的离去基团其中X和Y如上所定义
j.使式8的活性中间体或二环-杂芳基-2-甲酸7与式R3NHOR29的取代羟胺，其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基，在有机碱的存在下反应得到式10的酰胺，其中X、Y、R2和R3如上所定义
k.用还原剂还原式10的酰胺得到式11的二环杂芳基甲醛，其中X、Y、R2和R3如上所定义
l.使二环杂芳基甲醛11与下式的溴-青霉烯13缩合，其中R6为体内可水解的酯，选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基和CHR3OCOC1-C6或另外的苄基或对硝基苄基保护基，
在路易斯酸、醚合物和弱碱存在下，形成下式的羟醛14，其中X、Y和R6如上所定义
m.将羟醛14与酰氯或酸酐，(R4)Cl或(R4)2O，或与四卤甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反应，形成中间体化合物15，
其中R4为烷基SO2、芳基SO2、烷基CO或芳基CO；X1为Br、I或Cl；X、Y和R6如上述所定义；R5为X1或OR4；和
n.通过还原消除方法将中间体化合物15转化为下式的二环-杂芳基-青霉烯-2-甲酸16，其中R6为H，如果需要转化为药学上可接受的盐，优选碱金属盐或转化为酯，其中R6为C1-C6烷基、C5-C6环烷基和-CHR3OCOC1-C6
并分离二环-杂芳基-青霉烯-2-甲酸16。
本发明还包括制备具有式7的二环-杂芳基-2-甲酸的方法，该方法包括酶解具有式6的二环-杂芳基-2-甲酸酯，或选择性地在二环-杂芳基-2-甲酸酯6和二环-杂芳基-3-甲酸酯5的混合物中产生式7二环-杂芳基-2-甲酸。例如，所得的式7的二环-杂芳基-2-甲酸可通过以下反应被转化成具式11的二环杂芳基甲醛：使二环-杂芳基2-甲酸7或其反应性衍生物与具有式R3NHOR29的胺(其中R2和R3独立为1-6个碳原子烷基)或其反应性衍生物反应，得到式10的酰胺，并用还原剂还原式10的酰胺。具有式11的二环杂芳基甲醛可被转化成具式16的化合物。具式16的化合物可从具式11的二环杂芳基甲醛以WO03/093279所述的方式制备。
发明详述
如方案I所示，其中X、Y、R和n如上所述的氨基酸1(L，D或消旋体)在亚硝化试剂存在下被亚硝基化，亚硝化试剂包括亚硝酸钠和盐酸，得到1-亚硝基-氨基酸2，2再与脱水剂反应，脱水剂包括但不局限于三氟醋酐，通过文献所述方法(Ranganathan，D.；Shakti，B.“A Novel Proline Derived Meso-Ionic Synthon.”Tetrahedron Letts.1983：24(10)；1067-1070)和后处理修饰，包括将反应混合物中形成的三氟乙酰氯用无机碱的水溶液如碳酸氢钾或碳酸钾(等)或无水无机碱如粉状碳酸钾中和，然后用可以排除对色谱法需要的溶剂如二氯甲烷提取所需化合物，来制备内鎓盐3。用方法(Ranganathan，D.；Shakti，B.“A Novel脯氨酸Derived Meso-Ionic Synthon.”TetrahedronLetts.1983：24(10)；1067-1070)将内鎓盐3与丙炔酸酯4，其中R1为1-6个碳原子的烷基，如丙炔酸乙酯，优选为甲基或乙基，在非质子溶剂中反应，非质子溶剂包括取代的芳香族化合物(如氯苯、均三甲苯等)，取代的酰胺类(如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺等)，亚砜类(如二甲亚砜等)和醚类(如乙二醇的醚如1，2-二乙基、1，2-二甲基等)得到二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中R1、X和Y如上述所定义。优选的反应温度为约100-165℃。优选的溶剂为乙二醇的醚(二乙基、二甲基等)取代的酰胺类(N，N-二甲基甲酰胺)和取代的芳香族化合物如氯苯，在上述溶剂中酯的混合物中，以有利于所需的二环-杂芳基-2-甲酸酯6比例形成，范围为约1.5∶1至约3∶1。特别优选的溶剂包括二乙基乙二醇(1，2-二乙氧基乙烷，DEE)，或氯苯，其中在约120-125℃反应8-12小时，形成二环-杂芳基-2-甲酸酯6和二环-杂芳基-3-甲酸酯5的混合物，其比率为约1.5∶1-2.5∶1，该比例有利于二环-杂芳基-2-甲酸酯6，带有很少的来自多聚物的污染。
使二环-杂芳基-2-甲酸酯6和二环-杂芳基-3-甲酸酯5的混合物与水解酶接触，二环-杂芳基-2-甲酸酯6优于二环-杂芳基-3-甲酸酯5在合适的溶剂中可以被选择性地水解，得到二环-杂芳基-2-甲酸7，其中X和Y如上所定义。水解酶，包括脂肪酶、酰基转移酶、蛋白酶和酯酶。水解酶首先溶解在含水溶剂中，任选缓冲于优选的pH范围6.5-7.8。就酶活性而言，优选的pH位于有效的pH范围中，该范围可促使所用的特定酶的活性状态能够水解所述酯。水解酶包括：脂肪酶、酯酶、酰基转移酶和蛋白酶。优选的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液或其它pH在约7.25的缓冲液。酶浓度在含水溶剂中可变化，范围为例如3mg-10mg/ml，典型值为6mg/ml。可任选加入共溶剂。共溶剂包括乙腈和N，N-二甲基甲酰胺，优选10％乙腈。乙腈作为共溶剂在酶反应混合物中从0-30％测试其效果。乙腈促使酯混合物更好地分布于水性反应体系中。结果显示乙腈并不影响酶选择性，如果浓度高于10％只轻微降低酶反应速率。当化学合成后粗酯混合物不经进一步纯化直接用于酶反应时，向反应中添加10％乙腈(终浓度)促进酯底物的均匀分布，对酶活性和选择性没有任何不利影响。自从使用了固定化酶制剂，反应后酶的分离就简便了。有效pH范围可为约4.0-10.0。但是，如果酶水解的pH达到5.0或更低，酶活性可被抑制并导致底物的不完全水解。随着反应的进行，添加碱特别是氢氧化钠溶液或氢氧化铵等使pH保持在约7.0，优选6.5-7.8的范围。酶反应时间从9-72小时变动，取决于水解酶的类型和反应混合物中所用的底物浓度。底物的水解程度用HPLC监测或通过监测碱的消耗以保持反应的pH在约7.0。所需的酯的水解程度不影响所需酸产物的异构体纯度，但是如果底物酯水解不完全，只能得到低产率的酸产物。从未水解的酯二环-杂芳基-3-甲酸酯5纯化二环-杂芳基-2-甲酸7可以简便地通过有机溶剂萃取未水解的酯进行。合适的有机溶剂包括乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯、乙醚、异丙醚或任何其它未水解的酯可溶于其中的水互溶性有机溶剂，优选乙酸乙酯。二环杂芳基-2-甲酸7可通过冻干或蒸发分离的水相分离。二环杂芳基-2-甲酸7可任选在将分离的水相pH用无机酸优选盐酸调节至约2.0-约3.0后分离。
方案I
方案I(续)
如方案I所进一步描述，将二环-杂芳基-2-甲酸7的任选的其碱金属盐(钠、钾、锂等)转换成活性中间体8通过几种方法完成。优选的，使二环-杂芳基-2-甲酸7与酰卤试剂SO2Q2或QCOCOQ，其中Q为氯或溴，例如乙二酰氯、亚硫酰氯和亚硫酰溴等，在合适的非质子溶剂(例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲氧基乙烷等)优选在N，N-二烷基酰胺催化剂例如N，N-二甲基甲酰胺存在下，在合适的温度下(-10-30℃)反应，得到活性中间体8，其中Q为氯或溴。这样产生活性中间体8与羟胺R3NHOR29反应，其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基[即R3NHOR2，其中R3、R2＝Me，即O，N-二甲基羟胺等]，在合适的溶剂中，例如二氯甲烷、甲苯、二甲氧基乙烷等，在有机碱的存在下例如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、吡啶等、在温度范围为-10-50℃下，反应得到酰胺10，其中X、Y、R2和R3如上所定义。优选的方法包括产生活性中间体8其中Q为Cl，与乙二酰氯在二氯甲烷中，在约0-25℃，在催化量的N，N-二甲基甲酰胺存在下，并接着使活性中间体8其中Q为Cl与取代的羟胺盐酸盐9在吡啶或N，N-二异丙基乙胺的存在下反应，反应温度范围为约0-25℃，得到酰胺10，其中X、Y、R2和R3如上所定义。
或者，活性中间体8其中Q为Cl或Br可在有机碱例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾等存在下，与取代的羟胺盐酸盐9在两相系统中例如二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯等和水中反应。特别优选的形成酰胺10方法，该酰胺中X、Y、R2和R3如上所定义的方法，为使用Schotten-Baumen条件，其中2-甲酸的活性中间体8的溶液其中Q为Cl，在二氯甲烷中(产生自亚硫酰氯/N，N-二甲基甲酰胺)与取代的羟胺9的水溶液在无机碱碳酸钾的存在下，在温度范围为约10-20℃下反应。特别是，N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺优选由Schotten-Baumen条件产生，分离后不需进一步纯化。
使二环-杂芳基-2-甲酸7，其包括5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸，与取代的羟胺，9(方案I)偶联，来合成酰胺10其中X、Y、R2和R3如上所定义，可用几种方法进行。
在一个典型的偶联方法中，所述二环-杂芳基-2-甲酸7和取代的羟胺9与合适的偶联试剂反应。合适的偶联试剂将羧酸基团转换成活性中间体8其中Q为得自偶联试剂的离去基团，致使酰胺连键在羧酸和所述取代的羟胺之间形成。
合适的偶联试剂的例子包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-羟基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羟基苯并三唑二环己基碳二亚胺/HBT、二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷酰基氰化物、苯基二氯磷酸酯加咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP-试剂)、N，N’双[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(phosphorodiamidic chloride)(BOB Cl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、溴-三-吡咯烷-1-基(pyrrolidino)-鏻六氟磷酸盐和苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸盐。该偶联反应分几步完成，或在缩短的过程中完成。
典型的偶联反应通常在惰性溶剂中进行，优选非质子溶剂，在温度为约-20℃至约50℃进行约1-48小时，任选在季胺存在下进行，所述季胺如N，N-二异丙基乙胺N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2，6-二-叔-丁基-4-甲基吡啶、吡啶等。合适的溶剂包括乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环或氯仿或其混合物。
在一个多步偶联反应的实例中，二环-杂芳基-2-甲酸7与偶联试剂反应形成活性中间体8，可任选被分离，其中Q为离去基团。在第二步中，活性中间体8然后与取代的羟胺9反应得到酰胺10。又一个偶联反应的实例将酸转化为活性中间体包括亚硫酰氯、亚硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟，形成酰氟(Q为F)或氯甲酸烷基酯例如氯甲酸异丁基酯或氯甲酸异丙烯基酯(在季胺存在下)，形成甲酸的混合酸酐。另一个制备混合的酸酐的偶联试剂的实例为2，4，6-三氯苯甲酰氯[Inanaga et al.Bull.Chem.Soc.Jpn.52，1989(1979)]。偶联反应通常在惰性溶剂中进行，优选非质子溶剂，在温度为约-20℃至约30℃进行约1-24小时，任选在季胺存在下进行，所述季胺如N，N-二异丙基乙胺N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2，6-二-叔-丁基-4-甲基吡啶、吡啶等。合适的溶剂包括乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环或氯仿或其混合物。活性中间体8偶联的第二步已在上文描述，其中活性中间体从羧酸盐制备。在第二步骤中，当活性中间体为混合的酸酐时，如上文所述，将合适溶剂中的胺加入到混合酸酐溶液中，在合适的碱存在下，如上文所述，在用于活化的温度下，并将所述温度逐渐调至约30℃。将所述胺在用于活化的温度下加入到溶液中，并将温度调至约30℃。反应进行约1-48h。
其它偶联反应的实例将酸转化为活性中间体，任选分离的，例如活性酯，包括三氟醋酸五氟苯基酯，其提供活化的酚酯。特别是，简单酯例如甲基、乙基和丙基酯，通过使5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸与相应的醇用常规方法产生，也可用作活性中间体。提供活性中间体的偶联试剂如酰基叠氮化物还包括二苯基磷酰基叠氮化物。提供活性中间体的偶联试剂如酰基氰化物包括二乙基磷酰基氰化物。
偶联反应一般在约在-30℃和60℃之间进行，经常在0℃或以下。在第二步，将取代的羟胺加入到活性中间体的溶液中，在用于活化的温度下，并将温度缓慢调至约30℃。反应时间为1-96小时。其它的偶联试剂如上文所定义。
还原所述酰胺10其中X、Y、R2和R3如上所定义得到二环杂芳基甲醛11，可用还原剂进行，所述还原剂包括过量的氢化试剂，例如氢化铝锂和氢化二异丁基铝[DIBAL(H)]，在溶剂中例如四氢呋喃、乙醚和甲苯，温度在约-10-25℃。优选使用氢化铝锂在四氢呋喃中，在约0-25℃范围。描述了特别优选的方法，其中还原试剂为氢化铝锂[0.5mol每mol酰胺]，反应溶剂为四氢呋喃。反应温度在0-5℃持续约18小时。为减少副产物的量，醇12，其产生自用水猝灭反应混合物，优选向反应混合物中加入四氢呋喃和水的溶液来猝灭反应。优选用二氯甲烷的酸提取。特别优选的是对二环杂芳基甲醛11的纯化，经水可溶性亚硫酸氢钠复合物，其特别有效地除去残留醇12。
如方案II所进一步描述，二环-杂芳基青霉烯-2-甲酸16，保护的酸或其药学上可接受的盐，优选碱金属盐，其中A和B之一表示氢，另一个表示下式部分
其中X和Y如上所定义，可通过使如方案I所述制备的二环杂芳基甲醛11与6-溴-青霉烯13缩合，该化合物具有保护的酸其中R6为体内可水解的酯，选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基和CHR3OCOC1-C6，或者苄基或对硝基苄基保护基，在路易斯酸存在下，优选无水卤(Br或Cl)化镁更优选无水MgBr2或MgBr2：醚合物和弱碱例如三乙胺、二甲氨基吡啶(DMAP)或二异丙基乙基胺存在下，在低温优选在约-20℃至-40℃反应，得到羟醛14，该化合物可用酰氯或酸酐优选官能化为乙酸酯、三氟甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，或任选与四卤甲烷和三苯基膦与室温在合适的有机溶剂优选CH2Cl2中反应转化成卤素衍生物得到中间体15。使羟醛14与酰氯或酸酐反应，(R4)Cl或(R4)O，或与四卤甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反应，形成中间体化合物15其中R4为烷基SO2、烷基CO或芳基CO；X1为Br、I或Cl；A和R如上所定义；R6为X1或OR4。中间体15可被转化成所需的二环-杂芳基-青霉烯-2-甲酸16被保护的酸或其药学上可接受的盐，优选碱金属盐，方法为用金属例如活化的锌和磷酸盐缓冲液在适度的温度下优选约20℃-35℃在pH约6.5-8.0条件下进行还原消除；或经催化剂优选钯碳氢化。应该注意，要进行还原消除步骤以使羧基脱保护发生。如果羧基氧上的保护基为对硝基苄基取代基，则还原消除和脱保护可一步完成。但如果保护基不是对硝基苄基取代基，根据保护基的性质可进行两步反应。产物可分离为游离酸或药学上可接受的盐，优选碱金属盐。以上所述两步反应可不分离中间体15使整个反应在一步完成。此外，所述游离碱或碱金属盐可转化成酯，其中R6为C1-C6烷基、C5-C6环烷基和-CHR3OCOC1-C6。
方案II
本公开中用到了许多术语，下面提供了一些定义。
此处所述的芳基是指6-12个碳原子芳烃部分。
此处所用的术语C5-C6环烷基是指具有5-6个碳原子的饱和单环。示例性环烷基包括环戊基或环己基。
此处所用的术语含水溶剂指水。
此处所用的术语″反应″是指将化学反应物放在一起在可以引起化学反应的条件下发生反应。
术语″离去基团″一般指容易被亲核试剂取代的基团，如胺类。这类离去基团在本领域是已知的。该离去基团的实例包括但不局限于，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、氟、氯、溴、1，1′-羰二咪唑等。
如此处所用，接触是用来表示在水性介质中将酯反应物放在一起，在水解酶的存在下使酶解反应发生。
如此处所用，术语可水解酯表示任何通常用于保护羧酸不被此处所述的水解酶水解的酯。
如此处所用，有效的水解酶指可从酯反应物或酯反应物的混合物产生可检测量的甲酸产物的酶。有效的水解酶选自脂肪酶、酯酶、酰基转移酶或蛋白酶。特定的实例包括南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶B、曲霉属(Aspergillus)酰基转移酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶M、褶皱假丝酵母(C.rugosa)脂肪酶和来自假单胞菌种(Pseudomonas sp.)的脂肪酶。
如此处所用，有效量的有效水解酶是指酶的量可从酯底物产生可检测量的酸产物。一般而言，有效量的范围在约3mg-10mg/ml，优选约6mg/ml。
如此处所用，酶反应的有效pH范围为所给的酶对酯底物表现出催化活性的pH。该pH范围可变化，并取决于所用的特定酶。例如，对脂肪酶而言，有效pH范围为约5.0-10.0。类似的，对蛋白酶而言，有效范围为约4.0-10.0，对酰基转移酶而言，有效pH范围为约5.0-10.0。优选的pH范围为约6.5-约7.8。也优选的pH范围为约7.2-7.5。更优选的pH范围为约7.0。
如此处所用，酶反应的有效温度为所给的酶对所给的底物表现出活性的温度。例如，温度通常为约20℃-65℃，取决于所用的酶。优选的有效温度为约37℃。
如此处所用，酶选择性指一个反应，其中一个官能团(如酯基团)可被取代在分子上的不同位置(位置异构体)，而反应仅在一个位置选择性发生。
如此处所用，酶水解有效时间为约9-72小时。
此处所用的本发明的方法制备的碱性化合物的药学上可接受的盐是由如下有机酸或无机酸得到的：乳酸、柠檬酸、醋酸、酒石酸、反丁烯二酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸以及类似于已知的可接受的酸。有羧酸存在时，本发明的方法制备的化合物的盐是与如下的碱形成的：碱金属(Na、K、Li)或碱土金属(Ca或Mg)。
此处所用的无机酸指的是硫酸、盐酸等。
将在下列实施例中对本发明作更详细地描述，这些实施例以说明的方式给出而不是为了限制本发明。
实验方法：
通用酶条件
5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物在1ml反应中测试筛选酶活，反应由高压液相色谱分析(HPLC)。典型的底物浓度范围为1mg-20mg/ml，溶剂为0.1M磷酸钾缓冲液pH 7.25，该溶剂含有5-10mg酶或如果该酶为液体为10μl。将反应物于37℃孵育过夜。当酯被水解时，通过一滴初始pH的反应物到约6.0来指示。HPLC条件：在在Waters HPLC(Alliance HT：2795)上，用WatersTM SymmetryTM C18柱3.5m；4.6×75mm)和以下的溶剂梯度分析样品。溶剂A：5％乙腈，10mM乙酸铵水溶液；溶剂B：80％乙腈，10mM乙酸铵水溶液。梯度条件为；90％A：10％B-60％A：40％B在10分钟内；100％B在15min内；继续用100％B达20min，转回90％A：10％B。化合物在215或226nm检测。流速为1mL/min。不同的待测酶列于表1。待测酶中，来自曲霉种(Aspergillus sp.)的酰基转移酶、来自假单胞菌种(Pseudomonas sp.)和南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶显示出选择性水解所需酯形成所需的酸异构体。来自猪肝脏的酯酶显示出对两异构体的非选择性水解。
表1.针对5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯*和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯**的酯混合物的酶的列表
| 条目 | 酶 | 酯水解 |
| 1 | 脂肪酶A“Amano”12 | 未 |
| 2 | 脂肪酶AK荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens) | 未 |
| 3 | 脂肪酶AY-褶皱假丝酵母(Candida rugosa)粗酶 | 未 |
| 4 | 脂肪酶BC-假单胞菌种(Pseudomonas sp) | 未 |
| 5 | 脂肪酶F-AP15 | 未 |
| 6 | 脂肪酶G 50- | 未 |
| 7 | 脂肪酶M 10- | 未 |
| 8 | 脂肪酶PS-洋葱伯克霍尔德氏菌(Pseudomonas cepacia) | 未 |
| 9 | 脂肪酶R Amano G- | 未 |
| 10 | 脂肪酶TypeVII-(粗)褶皱假丝酵母(Candida rugosa) | 未 |
| 11 | Lipozyme RMIM-R.meihei | 未 |
| 12 | Lipozyme TLIM-T.lanuginosa | 未 |
| 13 | Newlase F | 未 |
| 14 | Novozyme 435-南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶B | *水解 |
| 15 | Novozym 388 | 未 |
| 16 | Novozyme 398 | 未 |
| 17 | Alcalase-细菌蛋白酶 | 未 |
| 18 | Acylase Amano-曲霉种(Aspergillus sp.) | *水解 |
| 19 | 酸性蛋白酶II | 未 |
| 20 | 酸性蛋白酶A | 未 |
| 21 | Chirazyme P1-B.licheniformis蛋白酶 | 未 |
| 23 | 蛋白酶A-2G | 未 |
| 24 | 蛋白酶M | *水解 |
| 25 | 蛋白酶N | 未 |
| 26 | 蛋白酶P | 未 |
| 27 | 蛋白酶S | 未 |
| 28 | Chirazyme(脂肪酶)筛选试剂盒 | |
| 29 | 脂肪酶L-2南极假丝酵母脂肪酶B可溶形式 | *和**水解 |
| 30 | L-3；粗褶皱假丝酵母 | 未 |
| 31 | L-3纯化的褶皱假丝酵母 | *水解 |
| 32 | L-5；南极假丝酵母的脂肪酶A | 未 |
| 34 | L-6；假单胞菌种 | *水解 |
| 35 | L-7；猪胰脏 | 未 |
| 36 | L-8；T.lanuginosus | 未 |
| 37 | L-9；M.meihei | 未 |
| 38 | L-10；产碱杆菌属(Alcaligenes) | 未 |
| 39 | Esterase E1-猪肝脏 | *和**水解 |
| 40 | Esterase E2-猪肝脏 | *和**水解 |
实施例1
用真菌酰基转移酶的酯水解
用酯底物混合物测试将N-乙酰氨基酸衍生物水解为相应的氨基酸的酰基转移酶。反应混合物含有约8.5mg酰基转移酶(约255酰基转移酶单位)，0.15mM氯化钴的1ml磷酸钾缓冲液pH约7.0。向其中加入约10mg的底物酯混合物，并于37℃孵育。酶反应过程通过用HPLC分析少量样品来监测。所需的酯异构体5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯被酶水解，而5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯不被水解。
实施例2
用假单胞菌种的脂肪酶的水解：
根据上述通用酶条件，1.50g 5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物用约100mg的假单胞菌种脂肪酶(L-6)在50ml 0.1M磷酸钾缓冲液pH7.25中水解，向其中加入0.5ml乙腈以使底物在缓冲液中均匀分布。37℃混合反应物。酶解后释放的酸降低了反应pH。定期检查反应的pH，如果其为7.0或更低，则加入1N氢氧化钠将pH调至约7.30。这样，pH保持高于7.0。孵育72h后，所需的酯水解达到约70％，根据HPLC分析。经0.2μ膜过滤酶反应物，移去粗酶制品中的不溶物质。在pH 7.0，用乙酸乙酯(1∶1)萃取酶反应物两次，移去所有剩余酯，只将5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸留在水相。冻干含酸产物的水相，将回收的固体溶于甲醇。分离并弃去不溶于甲醇的盐。蒸发含5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸(灰黄色)的甲醇，回收约0.5g的5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸。LC-MS和NMR的数据一致表明：仅存在所需的酸，异构体纯度为100％。HPLC检测的酸纯度为97％。HPLC条件为：Prodigy ODS3柱4.6×150mm。溶剂A：0.02％三氟乙酸(TFA)的水溶液。溶剂B：0.02％TFA的乙腈溶液。所用的梯度为：在0时90％A和10％B，梯度在20min达到，5％A和95％B并持续至25min。
实施例3
脂肪酶对酯异构体的非选择性水解
在某些条件下，例如水解酶过量和底物浓度低以及长时间孵育反应物会导致两种酯异构体被同样的脂肪酶以非选择性方式水解，而所述脂肪酶在另外的条件下会显示出对所需的酯异构体的非常好的水解选择性。这类南极假丝酵母脂肪酶B的固定化形式的非选择性水解条件的实例为：23g(10000U/g)的酶与2.5g的酯混合物在1LpH 7.25的缓冲液中一起孵育，37℃持续66小时。就固定化酶制剂而言，活性单位定义为如下的酯合成单位。每分钟可由丙醇和月桂酸合成1μmole的月桂酸丙酯的酶量为1个单位。类似的，就南极假丝酵母脂肪酶B的可溶形式而言，非选择性酯底物的水解条件是，5g酶(～120000U/g)2.5g酯混合物在1L pH 7.25的磷酸盐缓冲液中，在37℃持续18h。酶可溶形式的活性单位定义为：25℃，每分钟可由甘油三丁酸酯释放1μmol丁酸的酶量。
在上述条件下，两种南极假丝酵母脂肪酶B制剂显示出对两种酯异构体5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的非选择性水解。
实施例4
用南极假丝酵母脂肪酶B发展出的方法：
用南极假丝酵母脂肪酶B和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物在pH7.25的缓冲液中的实验显示出：该脂肪酶可选择性水解所需的酯异构体。典型的酶水解反应物含有6g/L酶，底物酯混合物范围为10-133g/L，pH用pH stat和3N氢氧化铵控制。如果pH失控，从酶反应释放的酸会降低pH，如果达到5.0或更低，则酶活性可被抑制并导致底物不完全水解，使酸产率降低。为了获得对所需酯异构体的完全水解，pH保持在约7.0。
实施例5
南极假丝酵母脂肪酶B与5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯
和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的混合物在133g/L的
反应：
为试验大规模转化的加工条件，使用了来自它们的合成反应的未经进一步纯化的酯底物的混合物。在终体积为30ml的、含有10％乙腈、4.05g的5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氢-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯混合物和0.2g脂肪酶0.1M Tris-HCl缓冲液中，37℃孵育Novozym 435，pH控制在7.20-7.50。用氢氧化铵(3N)来控制pH，利用带自动控制的pH-stat将碱加入以保持pH。在带有pH滴定计(Brinkmann，model 718 Titrino)夹套玻璃反应器中建立反应。氢氧化铵消耗停止后，表示不再从酯水解形成酸，通过溶剂萃取停止反应。用等体积(～30ml)的乙酸乙酯在约中性pH下萃取反应混合物三次，直到水相澄清。乙酸乙酯萃取除去了剩余所需酯同时除去了其它来自反应的有色物质。用浓盐酸将水相的pH降至～3.0，羧酸产物开始沉淀。再加入盐酸直到pH达到～2.0，并继续搅拌。于4℃将玻璃反应器保温1h。将酸性沉淀经中号滤器过滤(Buchner funnel)，并风干。使用上述条件的特定实施例示于表2。
表2.酯法酯水解条件和酸产物的产率
| 条目 | 粗酯混合物制剂溶剂 | 粗底物浓度(g/L) | 总反应体积(0.1M Tris-HCl pH 7.3) | 反应时间(12h内完全) | 回收的酸 |
| 12 | DMF1DEE2 | 4.04g(133g/L)4.05g(133g/L) | 30mL30mL | 19h17h | 0.962g1.33g |
1. N，N-二甲基甲酰胺(DMF)
2. 1，2-二乙氧基乙烷(DEE)
化学分析显示所得酸(表1条目2)纯度为99.8％(HPLC法)，含11％水分和0.387％灰分。H NMR、LC-MS和IR数据证实所得物质为预期从酶反应得到的所需酸。
实施例6
从5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸合成N-甲氧基-N-甲基-
5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺
将5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸，3.8g，25mmol)在40ml的2M乙二酰氯的二氯甲烷溶液中打浆，并向浆液中加入几滴二甲基甲酰胺。所得混合物在氮气下于15-22℃搅拌10-12小时。所得的酰氯的深色溶液蒸发得到干残留物。将残留物溶于甲苯(50ml)并再次蒸发得到粗酰氯。向搅拌的二氯甲烷(100ml)中的粗酰氯和N，O-二甲基羟胺盐酸盐(2.7g，27.5mmol)的混合物中，于0-5℃滴加吡啶(4.7g，3.2ml，60mmol)，在氮气下并保持温度约0-5℃。使所得的搅拌混合物在4小时内温至15-20℃，反应经HPLC监测完全程度(ProdigyODS3 4.6×150mm柱，用10min梯度从90∶10至10∶90水/含0.02％三氟乙酸的乙腈，于254nm检测UV。酰胺的保留时间为1.1min)。用水(50ml)洗涤混合物，浓缩并在短硅胶柱上用氯仿洗脱纯化，蒸发挥发物后，得到N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺，4.1g，86％)的浅棕色结晶固体，m.p.45-50℃，经NMR、质谱和元素分析鉴定。
实施例7
5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛
向N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺，2.5g，12.8mmol)的在冰/水浴中冷至0-5℃的四氢呋喃(35mL)溶液中，分几部分在7小时内加入氢化铝锂颗粒(0.211g，5.53mmol)。使反应混合物升至室温过夜(16小时)。薄层色谱[TLC：EM Science硅胶60F-254板，溶剂(20∶1)CH2Cl2∶CH3OH；Rf0.66(5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛)，0.38(N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺)显示少量的N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺。
使反应混合物在冰/水浴中冷至0-5℃，加入另一部分氢化铝锂(64mg，1.68mmol)。于0-5℃再过3小时，滴加饱和硫酸钠溶液(1.0mL)猝灭反应。15分钟后，形成浅灰色的凝胶，加入四氢呋喃(50mL)和硫酸镁(2g)。搅拌混合物10分钟后过滤。减压浓缩滤液得到1.6g澄清无色油状物。向该无色油状物中加入二氯甲烷(25mL)和1.5N盐酸(5mL)。将有机层减压浓缩并用油泵抽真空干燥，得到1.31g(77％产率)的5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛的白色固体，1H NMR(CDCl3)2.67-2.75(m，2H)，2.95(t，2H，J＝7.3Hz)，4.22(t，2H，J＝7.3Hz)，6.52(s，1H)，9.89(s，1H)。
Claims (63)
1.一种制备下式的二环-杂芳基-2-甲酸7的方法
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，所述方法包括酶解二环-杂芳基-2-甲酸酯6
其中X、Y和R如上所定义
产生下式的二环-杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义，并分离二环-杂芳基-2-甲酸7。
2.一种制备二环杂芳基-2-甲酸7的方法，
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，所述方法包括酶解下式的二环杂芳基-2-甲酸酯6和二环杂芳基-3-甲酸酯5的混合物中的二环杂芳基-2-甲酸酯6
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，选择性产生下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义
所述方法包括以下步骤：
a)使其中X、Y和R如上所定义的二环杂芳基-2-甲酸酯6和二环杂芳基-3-甲酸酯5的混合物与有效量的有效水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
b)通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
c)通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
d)分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
e)分离作为羧酸或其药学上可接受的盐的下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义。
3.权利要求2的方法，其中有效水解酶选自脂肪酶、酰基转移酶和蛋白酶。
4.权利要求3的方法，其中有效水解酶选自南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶B、曲霉属(Aspergillus)酰基转移酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶M、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶和来自假单胞菌种(Pseudomonas sp)的脂肪酶。
5.权利要求2的方法，其中有效量的有效水解酶在约3mg-10mg/ml的范围内。
6.权利要求5的方法，其中有效量的有效水解酶为约6mg/ml。
7.权利要求2的方法，还包括约20-65℃的有效温度。
8.权利要求7的方法，其中有效温度为约37℃。
9.权利要求2的方法，其中有效pH范围为约4.0-约10.0。
10.权利要求9的方法，其中所述反应的有效pH通过添加碱保持在约6.5-7.8。
11.权利要求10的方法，其中所述反应的有效pH通过添加碱保持在约7.0。
12.权利要求2的方法，其中所述任选的缓冲液选自磷酸盐或Tris-HCl缓冲液。
13.权利要求12的方法，其中所述缓冲液为Tris-HCl。
14.权利要求2的方法，其中所述任选的共溶剂选自乙腈或N，N-二甲基甲酰胺。
15.权利要求14的方法，其中所述共溶剂为乙腈。
16.权利要求15的方法，其中所述共溶剂乙腈的浓度为约10％。
17.权利要求11的方法，其中所述碱选自氢氧化钠或氢氧化铵。
18.权利要求2的方法，其中所述pH用盐酸调至约2.0-约3.0。
19.权利要求2的方法，其中所述有效时间为约9-72小时。
20.一种制备下式的二环杂芳基甲醛11的方法
其中：
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
该方法包括以下步骤：
a.用亚硝化试剂亚硝化下式的氨基酸1
其中X和Y如上所定义；形成式2的亚硝基化合物
其中X和Y如上所定义；
b.使所述亚硝基化合物2与脱水剂反应，并用无机碱中和形成式3的内鎓盐，
其中X和Y如上所定义；
c.使式3的内鎓盐与式4的丙炔酸酯反应
HC≡CCO2R14
其中R1为1-6个碳原子的烷基，在非质子溶剂中形成二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物
其中X、Y和R1如上所定义；
d.使其中X、Y和R1如上所定义的二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中并任选在共溶剂存在下接触；
e.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
f.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
g.分离水性溶剂并任选用无机酸调节pH至少至约2.0-约3.0；
h.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义；
i.使其中X和Y如上所定义的二环杂芳基-2-甲酸7或其盐与酰卤试剂或偶联试剂反应，形成活性中间体8，其中Q为从偶联试剂或酰卤试剂形成的离去基团
其中X、Y和Q如上所定义；
j.使活性中间体8或二环-杂芳基-2-甲酸7与其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羟胺在有机碱的存在下反应，得到式10的酰胺
其中X、Y、R2和R3如上所定义；
k.用还原剂还原式10的酰胺得到二环杂芳基甲醛11
其中X和Y如上所定义，并分离二环杂芳基甲醛11。
21.权利要求20的方法，其中所述亚硝化试剂为亚硝酸钠的盐酸溶液。
22.权利要求20的方法，其中R1为甲基或乙基。
23.权利要求20的方法，其中所述脱水剂三氟乙酸酐。
24.权利要求20的方法，其中所述非质子溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、氯苯或1，2-二乙氧基乙烷，温度为约100-165℃。
25.权利要求24的方法，其中所述非质子溶剂为1，2-二乙氧基乙烷或氯苯，在温度为约120-125℃形成二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物，比例范围为约1∶1.5-约1∶2.5。
26.权利要求20的方法，其中所述酰卤试剂为SO2Q2或QCOCOQ，其中Q为氯或溴。
27.权利要求26的方法，其中所述酰卤试剂选自亚硫酰溴、亚硫酰氯和乙二酰氯。
28.权利要求27的方法，其中所述酰卤试剂为乙二酰氯。
29.权利要求20的方法，其中所述偶联试剂选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-羟基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羟基苯并三唑二环己基碳二亚胺/HBT、二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷酰基氰化物、苯基二氯磷酸酯加咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP-试剂)、N，N’双[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(BOB Cl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、溴-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸盐、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸盐、亚硫酰氯、亚硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟、氯甲酸异丁酯、氯甲酸异丙烯基酯、三氟醋酸五氟苯基酯、二苯基磷酰基叠氮化物和二乙基磷酰基氰化物。
30.权利要求20的方法，其中所述有机碱选自三乙胺、N，N-二异丙基乙胺和吡啶。
31.权利要求20的方法，其中所述取代的羟胺是在Schotten-Baumen条件下反应。
32.权利要求20的方法，其中所述还原剂为氢化物试剂。
33.权利要求32的方法，其中所述氢化物试剂选自氢化铝锂和氢化二异丁基铝[DIBAL(H)]。
34.权利要求20的方法，其中X为-CH2-。
35.由权利要求20的方法制备的化合物5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛。
36.权利要求20的方法，其中所述有效时间为约9-72小时。
37.一种制备二环杂芳基甲醛11的方法
其中：
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
该方法包括以下步骤：
a.使二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物
其中X、Y和R1如上所定义，与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内反应有效的时间，任选在缓冲液中，并任选在共溶剂存在下反应；
b.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
c.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
d.分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
e.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义；
f.使所述二环-杂芳基-2-甲酸7或其盐与酰卤试剂或偶联试剂反应形成活性中间体8，其中Q为从偶联试剂或酰卤试剂形成的离去基团
其中X和Y如上所定义；
g.使活性中间体8或二环-杂芳基-2-甲酸7与其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羟胺在有机碱的存在下反应，得到式10的酰胺
其中X、Y、R2和R3如上所定义；
h.用还原剂还原式10的酰胺得到式11的二环杂芳基甲醛
其中X和Y如上所定义，并分离式11的二环杂芳基甲醛。
38.权利要求37的方法，其中所述酰卤试剂为SO2Q2或QCOCOQ，其中Q为氯或溴。
39.权利要求38的方法，其中所述酰卤试剂选自亚硫酰溴、亚硫酰氯和乙二酰氯。
40.权利要求39的方法，其中所述酰卤试剂为乙二酰氯。
41.权利要求37的方法，其中所述偶联试剂选自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐-羟基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羟基苯并三唑二环己基碳二亚胺/HBT、二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷酰基氰化物、苯基二氯磷酸酯加咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP-试剂)、N，N’双[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(BOB Cl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、溴-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸盐、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸盐、亚硫酰氯、亚硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟、氯甲酸异丁酯、氯甲酸异丙烯基酯、三氟醋酸五氟苯基酯、二苯基磷酰基叠氮化物和二乙基磷酰基氰化物。
42.权利要求37的方法，其中所述有机碱选自三乙胺、N，N-二异丙基乙胺和吡啶。
43.权利要求37的方法，其中所述取代的羟胺是在Schotten-Baumen条件下反应。
44.权利要求37的方法，其中所述还原剂为氢化物试剂。
45.权利要求44的方法，其中所述氢化物试剂选自氢化铝锂和氢化二异丁基铝[DIBAL(H)]。
46.权利要求37的方法，其中X为-CH2-。
47.由权利要求37的方法制备的化合物5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛。
48.权利要求37的方法，其中所述有效时间为约9-72小时。
49.一种制备下式的二环杂芳基青霉烯-2-甲酸16、保护的酸、
药学上可接受的盐或优选的碱金属盐的方法
其中：
A和B之一表示氢，另一个表示下式部分
Y为(CH2)n；
n为1或2；
X为NR、O、S或CH2；
R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；
条件是当X为NR或O时n为2；
R3为1-6个碳原子的烷基；
R6为H、选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基、-CHR3OCOC1-C6的体内可水解的酯或药学上可接受的盐，优选碱金属盐；
该方法包括以下步骤：
a.用亚硝化试剂亚硝化下式的氨基酸1，其中X和Y如上所定义；
形成式2的亚硝基化合物
其中X和Y如上所定义；
b.使所述亚硝基化合物2与脱水剂反应，并用无机碱中和形成式3的内鎓盐，
其中X和Y如上所定义；
c.使式3的内鎓盐与式4的丙炔酸酯反应
HC≡CCO2R14
其中R1为1-6个碳原子的烷基，在非质子溶剂中形成二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物
其中X、Y和R1如上所定义；
d.使二环-杂芳基-3-甲酸酯5和二环-杂芳基-2-甲酸酯6的混合物与有效量的水解酶在含水溶剂中在有效的pH范围内接触有效的时间，任选在缓冲液中，并任选在共溶剂存在下接触；
e.通过添加碱使pH保持在约6.5-约7.8；
f.通过有机溶剂萃取除去二环杂芳基-3-甲酸酯5；
g.分离水性溶剂并任选调节pH至约2.0-约3.0；
h.分离下式的二环杂芳基-2-甲酸7
其中X和Y如上所定义；
i.使二环杂芳基-2-甲酸7或其盐与酰卤试剂或偶联试剂反应，形成式8的活性中间体，其中Q为从偶联试剂或酰卤试剂形成的离去基团，其中X和Y如上所定义；
使活性中间体8或二环-杂芳基-2-甲酸7与其中R2和R3独立为1-6个碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羟胺在有机碱的存在下反应得到式10的酰胺
其中X、Y、R2和R3如上所定义；
j.用还原剂还原式10的酰胺得到式11的二环杂芳基甲醛
其中X和Y如上所定义；
k.将二环杂芳基甲醛11与下式的溴-青霉烯13缩合
具有被保护的酸的R6，其中R6为选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基、和-CHR3OCOC1-C6或另外的苄基或对硝基苄基保护基团的体内可水解的酯；
在路易斯酸、醚合物和弱碱存在下，形成下式的羟醛14，
其中X、Y和R6如上述所定义
1.将羟醛14与酰氯或酸酐，(R4)Cl或(R4)2O，或与四卤甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反应，形成中间体化合物15，
其中R4为烷基SO2、芳基SO2、烷基CO或芳基CO；X1为Br、I或Cl；X、Y和R6如上述所定义；R5为X1或OR4；且
m.用还原消除方法将中间体化合物15转化为下式的二环-杂芳基-青霉烯-2-甲酸16，其中R6为H，并且需要时转化为酯，其中R6为C1-C6烷基、C5-C6环烷基或-CHR3OCOC1-C6，药学上可接受的盐优选碱金属盐，其中A、B和R6如上述所定义
并分离二环-杂芳基-青霉烯-2-甲酸16。
50.权利要求49的方法，其中所述路易斯酸为无水卤化镁。
51.权利要求50的方法，其中所述路易斯酸为无水MgBr2。
52.权利要求49的方法，其中所述弱碱为三乙胺、DMAP或二异丙基乙基胺。
53.权利要求49的方法，其中所述低温为约-20℃至约-40℃。
54.权利要求49的方法，其中所述中间体化合物15为乙酸酯、三氟甲磺酸酯或甲苯磺酸酯。
55.权利要求49的方法，其中所述中间体化合物15不是分离的。
56.权利要求49的方法，其中所述还原消除方法是用活性锌和磷酸盐缓冲液在约6.5-8.0的pH下进行或在催化剂作用下氢化。
57.权利要求56的方法，其中所述催化剂为钯炭。
58.权利要求49的方法，其中所述还原消除方法是在约20℃-35℃温度下进行。
59.权利要求49的方法，其中所述式11的二环杂芳基甲醛被纯化为水溶性亚硫酸氢钠复合物。
60.一种制备式7的二环-杂芳基-2-甲酸的方法
其中Y为(CH2)n；n为1或2；X为-NR、O、S或-CH2-；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2，所述方法包括酶解其中X、Y和R如上所定义的二环-杂芳基-2-甲酸酯6，或选择性地在下式的二环-杂芳基-2-甲酸酯6和二环-杂芳基-3-甲酸酯5的混合物中酶解，其中X、Y和R如上所定义：
产生式7的二环-杂芳基-2-甲酸
其中X和Y如上所定义。
61.一种制备式11的二环杂芳基甲醛的方法
其中：Y为(CH2)n；n为1或2；X为NR、O、S或CH2；R为1-6个碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；条件是当X为NR或O时n为2；所述方法包括根据权利要求60中要求保护的方法制备式7的化合物，并将式7的二环-杂芳基-2-甲酸转化成式11的二环杂芳基甲醛。
62.权利要求61的方法，其中式11的二环杂芳基甲醛通过以下反应制备：使二环-杂芳基2-甲酸7或其反应性衍生物与具有式R3NHOR29的胺(其中R2和R3独立为1-6个碳原子烷基)或其反应性衍生物反应，得到式10的酰胺，
其中X、Y、R2和R3如上所定义；并用还原剂还原式10的酰胺。
63.一种制备下式的二环杂芳基青霉烯-2-甲酸16保护的酸、药学上可接受的盐或优选的碱金属盐的方法
其中：A和B之一表示氢，另一个表示以下部分
其中X和Y如权利要求61所定义，R6为H、选自C1-C6烷基、C5-C6环烷基、-CHR3OCOC1-C6、苄基或对硝基苄基保护基的体内可水解的酯或药学上可接受的盐优选碱金属盐；所述方法包括通过权利要求61或62要求保护的方法制备式11的二环杂芳基甲醛，并将式11的二环杂芳基甲醛转化成具式16的化合物。
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2004
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