WO2023284775A1 - 吡唑衍生物及其中间体和制备方法 - Google Patents

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阚超
高清富
冯一骁
吴波
杨红
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上海海雁医药科技有限公司
扬子江药业集团有限公司
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    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the invention relates to the field of organic chemical synthesis, in particular to pyrazole derivatives, intermediates and preparation methods thereof.
  • Opioid receptors are an important class of G protein coupled receptors (G protein coupled receptors, GPCRs), which are the binding targets of endogenous opioid peptides and opioid drugs. Endogenous opioid peptides are naturally produced in mammals. Opioid active substances, currently known endogenous opioid peptides are roughly divided into enkephalins, endorphins, dynorphins and neomorphins. There are corresponding opioid receptors in the central nervous system, namely ⁇ (MOR), ⁇ (DOR), ⁇ (KOR) receptors and so on. Studies have found that the strength of the analgesic effect of endogenous opioid peptides mainly depends on the expression of opioid receptors, which are the targets of opioid drugs and endogenous opioid peptides.
  • MOR agonists with different structures, including WO2017106547, WO2017063509, WO2012129495, WO2017106306, etc., and also disclosed the preparation methods of these compounds.
  • the development of an efficient, low-cost, easy-to-scale, and reproducible synthesis process for new MOR agonists with better activity and selectivity is of great significance to the pharmaceutical field and industrial production.
  • the object of the present invention is to develop pyrazole derivatives suitable for industrial production, their intermediates and their preparation methods.
  • the preparation method has the characteristics of high efficiency, low cost, high selectivity, easy scale-up and good repeatability.
  • the first aspect of the present invention provides compound v2 having the following structure:
  • the second aspect of the present invention provides a method for preparing compound v2, comprising the following steps:
  • the lipase is selected from one or more of a lipase derived from Candida and a lipase derived from Candida antarctica.
  • the lipase derived from Candida antarctica is any one or both of Candida antarctica lipase B and Candida antarctica lipase A.
  • the lipase derived from Candida antarctica is Candida antarctica lipase B.
  • the Candida antarctica lipase B is unimmobilized Candida antarctica lipase B (in some embodiments, the unimmobilized Candida antarctica lipase B is Any one or both of CALB L) and immobilized Candida antarctica lipase B.
  • the immobilized Candida antarctica lipase B is Novozymes 435 or Candida antarctica lipase B immobilized on Immobead 150. In some embodiments, the immobilized Candida antarctica lipase B is Novozymes 435.
  • the lipase derived from Candida is Candida sp.
  • the lipase is Novozymes 435.
  • the mass ratio of compound v1 to lipase is 100:1-1:1, such as 100:1, 80:1, 75:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 25:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 1:1, etc.
  • the mass ratio of compound v1 to lipase is 20:1-2:1, for example, 20:1, 18:1, 15:1, 7:1, 2:1, etc.
  • the mass ratio of compound v1 to lipase is 10:1-2:1, for example, 10:1, 8:1, 7.5:1, 6:1, 5:1, 3.5:1 , 3:1, 2:1, etc.
  • the mass ratio of compound v1 to lipase is 6:1-3:1, for example, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, etc.
  • the mass ratio of compound v1 to lipase is 5:1.
  • the solvent used includes: one or more of water, buffer and organic solvent, and the solvent contains at least water.
  • the solvent used is selected from a mixed solution of water, a buffer and an organic solvent.
  • the solvent used in the hydrolysis reaction, is selected from water, a buffer, a mixed solution of water and an organic solvent, and a mixed solution of a buffer and an organic solvent; in other embodiments, the used The solvent is selected from water, a buffer, a mixed solution of a buffer and an organic solvent; in other embodiments, the solvent used is selected from a mixed solution of a buffer, a buffer and an organic solvent; in other embodiments, the The solvent used is buffer.
  • the buffer contains water.
  • the buffer is phosphate buffer.
  • the organic solvent is a water-soluble organic solvent.
  • the organic solvent is selected from one or more of PEG400, dioxane, ethanol, toluene, tetrahydrofuran and acetonitrile; in some embodiments, the organic solvent is PEG400 or dioxane.
  • the solvent used is a mixture of phosphate buffer and organic solvent; in some embodiments, the volume ratio of the phosphate buffer to the organic solvent is 10: 1 to 3:1, for example, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, etc.; in some embodiments , the volume ratio is 5:1 ⁇ 3:1; in some embodiments, the volume ratio is 3:1.
  • the hydrolysis reaction temperature is 5-80°C, for example, 5°C, 10°C, 20°C, 45°C, 50°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, etc.; In some embodiments, the temperature is 20-60°C, in some embodiments, the temperature is 40-60°C, in some embodiments, the temperature is 45°C.
  • compound v2 with high ee selectivity can be obtained through lipase hydrolysis catalysis, which can reduce the difficulty of chiral resolution, improve selectivity and reduce production costs.
  • the third aspect of the present invention provides a method for preparing compound v3, comprising the following steps:
  • Compound v1 is prepared by one or more than two steps of reaction to obtain compound v3;
  • preparing compound v3 comprises the following steps:
  • the v2 compound is prepared by the preparation method described in the second aspect of the present invention.
  • the compound v2 is prepared by a cyclization reaction to obtain the compound v3.
  • n-butyl lithium in n-hexane is used.
  • the cyclization reaction of the compound v2 is carried out at -75 to -10°C (preferably -75°C).
  • the cyclization reaction of compound v2 is carried out in anhydrous THF solution.
  • the fourth aspect of the present invention provides a method for preparing compound v5, comprising the following steps:
  • Compound v3 is prepared by one or more than two steps of reaction to obtain compound v5;
  • the step of preparing compound v5 includes the step of preparing compound v2 using the preparation method described in the second aspect of the present invention.
  • the preparation method of compound v5 comprises the following steps:
  • the compound v3 is prepared by the method described in the third aspect of the present invention.
  • the condensation reaction is performed in a mixed system of a base (in some embodiments, the base is pyridine) and an alcohol solvent (in some embodiments, the alcohol solvent is methanol).
  • the molar ratio of compound v3 to hydroxylamine hydrochloride is 1:1.1-1:1.5 (preferably 1:1.2).
  • the molar ratio of compound v3 to the base is 1:1.1-1:1.5 (in some embodiments, the molar ratio is 1: 1.25).
  • the temperature of the condensation reaction is 50-70° C. (in some embodiments, the temperature is 65° C.).
  • the reducing agent used is selected from the group consisting of: Pd/C and hydrogen, sodium borohydride, lithium tri-sec-butyl borohydride, sodium cyanoborohydride, diisobutyl aluminum hydride, Zinc and acetic acid.
  • step S420 it further includes the step of subjecting compound v5 to a salt-forming reaction to obtain a salt of compound v5; in some embodiments, the salt of compound v5 is L-tartrate of compound v5.
  • the fifth aspect of the present invention provides a method for preparing compound Ia, comprising the following steps:
  • the chiral resolution method is instrumental resolution or chemical resolution.
  • the resolution reagent used in the chiral resolution is D-tartaric acid, D-dibenzoyltartaric acid, D-malic acid, D-mandelic acid, D-camphorsulfonic acid or S-binaphthalene Phenol phosphates; in some embodiments, the resolving reagent is S-binaphthol phosphate.
  • the compound Ia is obtained by using the racemic compound Ia-1 as a starting material through chiral resolution, which can greatly reduce the production cost.
  • the preparation method of compound Ia comprises the following steps:
  • step S520 LiAlH 4 is used for reduction.
  • the preparation method of compound Ia comprises the following steps:
  • Compound 1a-1 was prepared by reducing 2-(9-(pyridin-2-yl)-6-oxaspiro[4.5]decane-9-yl)acetonitrile;
  • the chiral resolution method is instrumental resolution or chemical resolution.
  • (S)-binaphthol phosphate is used for resolution in step S532.
  • the sixth aspect of the present invention provides a method for preparing compound I, comprising the following steps:
  • the compound v3 is prepared by the preparation method described in the third aspect of the present invention.
  • the compound Ia is prepared by the method described in the fifth aspect of the present invention.
  • the step of preparing compound I includes the step of preparing compound v2 using the preparation method described in the second aspect of the present invention.
  • step S610 the reductive amination reaction of compound Ia and compound v3 is carried out under the reaction system of catalyst, organic solvent and reducing agent.
  • the catalyst is tetraethyl titanate and/or tetraisopropyl titanate.
  • the organic solvent is selected from C 1-4 alkyl alcohol (preferably methanol, ethanol), toluene, xylene, methyl tert-butyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, diethyl ether , dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, ethyl acetate, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, and combinations thereof.
  • C 1-4 alkyl alcohol preferably methanol, ethanol
  • toluene xylene
  • methyl tert-butyl ether tetrahydrofuran
  • 1,4-dioxane 1,4-dioxane
  • diethyl ether diethyl ether
  • dichloromethane chloroform
  • 1,2-dichloroethane 1,2-dichloroethane
  • ethyl acetate ace
  • the reducing agent is selected from tetrabutylammonium borohydride, sodium malonyloxyborohydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, sodium borohydride, lithium borohydride One or more of , potassium borohydride and borane.
  • the seventh aspect of the present invention provides a preparation method of compound I, comprising the following steps:
  • the compound v5 is prepared using the following synthetic route:
  • step S620 the reductive amination reaction of compound Ib and compound v5 is carried out in a reaction system of an organic solvent and a reducing agent;
  • the organic solvent is selected from C 1-4 Alkyl alcohol (preferably methanol), toluene, xylene, methyl tert-butyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, diethyl ether, methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, ethyl acetate Esters, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, and combinations thereof;
  • the reducing agent is selected from tetrabutylammonium borohydride salt, sodium malonyloxyborohydride , Sodium triacetoxyborohydride, Sodium cyanoborohydride, Sodium borohydride, Lithium borohydride, Potassium
  • step S620 also includes the step of preparing compound Ib by the following method:
  • step S621 a diisobutylaluminum hydride solution is used for the reduction reaction.
  • the present invention can obtain the compound represented by the formula I with a higher ee value in a higher yield, and the reaction conditions of each step of the above method are relatively mild, the post-treatment is simple and convenient, the environment is friendly, and it is easy to scale up production , has high industrial application value.
  • Fig. 1 is a diagram of the single crystal structure of a crystal cultured with a salt of compound v2 and benzylamine in Example 14 of the present invention.
  • THF is tetrahydrofuran
  • EA is ethyl acetate
  • PE is petroleum ether
  • DMF is dimethylformamide
  • DMSO is dimethylsulfoxide
  • room temperature means about 20-25°C.
  • lipase derived from Candida antarctica includes two lipases, Candida antarctica lipase A and Candida antarctica lipase B, respectively.
  • Candida antarctica lipase B can be immobilized, such as Candida antarctica lipase B immobilized on macroporous acrylic resin (Novozymes 435), Candida antarctica lipase B immobilized on Immobead 150 .
  • Candida antarctica lipase B can also not be immobilized, such as commercially available CALB L.
  • Buffer pH7.22 250mL water + 2.4g K 2 HPO 4 + 0.83g KH 2 PO 4
  • Buffer pH 8.8 150mL water + 0.5g K2HPO4
  • Buffer pH7.8 64.5mL water + 1.5g K 2 HPO 4 + 0.25g KH 2 PO 4
  • Lipase used in the following examples all comes from commercially available goods, specifically as follows:
  • Embodiment 1 the preparation of compound v1
  • Step 1 Add triethylphosphonoacetate (476mL, 2.4mol), DBU (365g, 2.4mol), lithium chloride (127g, 3mol) and acetonitrile (1.2L) into a 3L single-necked bottle, under argon protection Stir at room temperature for 20 minutes. After cooling to 0°C (internal temperature), isobutyraldehyde (144 g, 2 mol) was slowly added dropwise. Stir at room temperature for 12 hours. Filter, filter cake washes twice (100mL x 2) with EA.
  • Step 2 Add DMF (1L) to a 3L one-mouth bottle containing ethyl 4-methyl-2-pentenoate (300g, 2.1mol), and add potassium carbonate (579g, 4.2mol) and pyrazole under stirring (287g, 4.2mol), stirred at 65°C for 18 hours, and spin-dried directly. The remaining solid was slurried with acetonitrile (150 mL) and filtered to give a white solid. Filter, and the filter cake is washed twice with EA (500mL x2).
  • Embodiment 2 the preparation of compound v2
  • Step 1 Add compound v3 (6.6g, 4.02mmol, 1.0equiv) into a 100mL three-necked flask, add anhydrous methanol (50mL, 7.5v/w), hydroxylamine hydrochloride (3.33g, 4.8mmol, 1.2equiv) and pyridine ( 3.97g, 5.03mmol, 1.25equiv), heated to 65°C, and reacted for 1 hour.
  • anhydrous methanol 50mL, 7.5v/w
  • hydroxylamine hydrochloride 3.33g, 4.8mmol, 1.2equiv
  • pyridine 3.97g, 5.03mmol, 1.25equiv
  • Step 2 Dissolve compound v4 (4.5g, 25.1mmol, 1.0equiv) in 120mL anhydrous methanol, add 10wt% Pd/C500mg; The pressure was 20-25 atm; the hydrogen absorption was stopped after about 2 hours of reaction; the filtrate was filtered and the filtrate was spin-dried to obtain compound v5 (3.5 g of colorless oil, ee value 88.3%).
  • Embodiment 17 the synthesis of compound Ia
  • Step 1 Dissolve 2-(9-(pyridin-2-yl)-6-oxaspiro[4.5]decane-9-yl)acetonitrile (25.0 g, 100 mmol, 1.0 equiv) in 500 mL of anhydrous THF; ice bath, make the inner temperature 5-10°C, add LiAlH4 (23.8g, 0.63mol, 6.3equiv) in batches; water, and then add 23.8g15%wtNaOH solution; filter, and wash the filter cake with 100mL tetrahydrofuran; base) ethylamine (12.5 g of light yellow oil, about 50% yield).
  • Step 2 Dissolve 2-(9-(pyridin-2-yl)-6-oxaspiro[4.5]decane-9-yl)ethylamine (2.6g) in absolute ethanol (15mL), weigh ( S)-binaphthol phosphate (3.50g) was added to the system; after spin-drying, add 4mL of absolute ethanol to heat up to dissolve, add 30mL of toluene, cool down to room temperature, and a white solid precipitates; filter, and wash the filter cake with a small amount of toluene, After drying, Compound Ia (1.3 g white solid, yield 21.3%, purity 98.0%, ee value 83.2%) was obtained.
  • Embodiment 18 the synthesis of compound Ib
  • Embodiment 19 the synthesis of compound I
  • the cell lines used in the following test cases are CHO-K1 OPRM1 ⁇ -Arrestin Cell Line, source: DiscoverX, number: 93-0213C2, batch number: 13K0402.
  • the cells are digested and subcultured with the cell digestion solution:
  • step 1 (a-h) in step 2 until the cells reach the P8 generation. Count the cells, then resuspend the cells with 2 ⁇ /1mM IBMX stimulation buffer to make the cell density 1.2*10 ⁇ 6/ml.
  • 1 ⁇ Stimulation buffer solution Add 1ml of 5 ⁇ Stimulation buffer storage solution to 4ml of distilled water, and mix well;
  • cAMP-Cryptate (donor, lyophilized) reaction solution Add 1ml 5 ⁇ cAMP-Cryptate storage solution to 4ml 1 ⁇ Lysis&Detection Buffer, and mix gently.
  • Anti-cAMP-d2 (acceptor, lyophilized) reaction solution Add 1ml 5 ⁇ Anti-cAMP-d2 storage solution to 4ml 1 ⁇ Lysis&Detection Buffer, and mix gently.
  • Test example 2 ⁇ -Arrestin cell experiment
  • the cells are digested and subcultured with the cell digestion solution:
  • step 1 (a-h) in step 2 until the cells reach the P8 generation.

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Abstract

提供了一种吡唑衍生物及其中间体和制备方法，该方法具有操作简单、选择性高、成本低、环境友好等特点，适用于工业化生产。

Description

吡唑衍生物及其中间体和制备方法 技术领域
本发明涉及有机化学合成领域，具体地涉及吡唑衍生物及其中间体和制备方法。
背景技术
阿片受体是一类重要的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)，是内源性阿片肽及阿片类药物结合的靶点，内源性阿片肽是哺乳动物体内天然生成的阿片样活性物质，目前已知的内源性阿片肽大致分为脑啡肽、内啡肽、强啡肽和新啡肽几类。中枢神经系统中存在其相应的阿片受体，即μ(MOR)、δ(DOR)、κ(KOR)受体等。研究发现，内源性阿片肽镇痛作用的强弱，主要取决于阿片受体表达的多少，阿片受体是阿片类药物以及内源性阿片肽镇痛作用的靶点。
目前已有多篇文献报道了不同结构的MOR激动剂，包括WO2017106547、WO2017063509、WO2012129495、WO2017106306等，也同时公开了这些化合物的制备方法。开发针对新的具有更好活性及选择性的MOR激动剂的高效、低成本、易放大、可重复性好的合成工艺对制药领域及工业化生产都有着很重要的意义。
发明内容
本发明的目的是开发适用于工业化生产的吡唑衍生物、其中间体及其制备方法，该制备方法具有高效、成本低、选择性高、易放大、可重复性好等特点。
本发明第一方面提供了具有以下结构的化合物v2：
Figure PCTCN2022105411-appb-000001
本发明第二方面提供了一种化合物v2的制备方法，包括以下步骤：
S200：使化合物v1在脂肪酶的催化下进行水解反应，制得化合物v2；
Figure PCTCN2022105411-appb-000002
在一些实施例中，所述脂肪酶选自源自假丝酵母的脂肪酶和源自南极假丝酵母的脂肪酶中的一种或多种。
在一些实施例中，所述源自南极假丝酵母的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B和南极假丝酵母脂肪酶A中的任何一种或两种。
在一些实施例中，所述源自南极假丝酵母的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B。
在一些实施例中，所述南极假丝酵母脂肪酶B为未经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B(在一些实施例中，未经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B为
Figure PCTCN2022105411-appb-000003
CALB L)和经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B中的任何一种或两种。在一些实施例中，经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B为诺维信435或在Immobead 150上固定化的南极假丝酵母脂肪酶B。在一些实施例中，经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B为诺维信435。
在一些实施例中，所述源自假丝酵母的脂肪酶为Candiada sp假丝酵母。
在一些实施例中，所述脂肪酶为诺维信435。
在一些实施例中，所述化合物v1和脂肪酶的质量比为100:1～1:1，例如100:1、80:1、75:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、25:1、20:1、10:1、5:1、4:1、1:1等。在一些实施例中，所述化合物v1和脂肪酶的质量比为20:1～2:1，例如，20:1、18:1、15:1、7:1、2:1等。在一些实施例中，所述化合物v1和脂肪酶的质量比为10:1～2:1，例如，10:1、8:1、7.5:1、6:1、5:1、3.5:1、3:1、2:1等。在一些实施例中，所述化合物v1和脂肪酶的质量比为6:1～3:1，例如，6:1、5:1、4:1、3:1、2:1等。在一些实施例中，所述化合物v1和脂肪酶的质量比为5:1。
在一些实施例中，所述水解反应中，所采用的溶剂包括：水、缓冲液和有机溶剂中的一种或多种，且所述溶剂中至少含有水。
在一些实施例中，所述水解反应中，所采用的溶剂选自：水、缓冲液和有机溶剂的混合溶液。
在一些实施例中，所述水解反应中，所采用的溶剂选自水、缓冲液、水和有机溶剂的混合溶液、缓冲液和有机溶剂的混合溶液；在另一些实施例中，所采用的溶剂选自水、缓冲液、缓冲液和有机溶剂的混合溶液；在另一些实施例中，所采用的溶剂选自缓冲液、缓冲液和有机溶剂的混合溶液；在另一些实施例中，所采用的溶剂为缓冲液。所述缓冲液含有水。
在一些实施例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在一些实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH＝3～10，例如，3、4.7、6、7、7.22、8、8.8、9、10等；在一些实施例中，pH＝4～9；在一些实施例中，pH＝7～8，在一些实施例中，pH＝7.8。
在一些实施例中，所述有机溶剂为水溶性有机溶剂。
在一些实施例中，所述有机溶剂选自PEG400、二氧六环、乙醇、甲苯、四氢呋喃和乙腈中一种或多种；在一些实施例中，有机溶剂为PEG400或二氧六环。
在一些实施例中，所述水解反应中，所采用的溶剂为磷酸盐缓冲液和有机溶剂组成的混合液；在一些实施例中，所述磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比为10:1～3:1，例如，10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3.5:1、3:1等；在一些实施例中，体积比为5:1～3:1；在一些实施例中，体积比为3:1。
在一些实施例中，所述水解反应中，所采用的溶剂为磷酸盐缓冲液；其中所述磷酸盐缓冲液的pH＝3～10，例如，3、4.7、6、7、7.22、8、8.8、9、10等；在一些实施例中，pH＝4～9；在一些实施例中，pH＝7～8；在一些实施例中，pH＝7.8。
在一些实施例中，所述水解反应温度为5-80℃，例如，5℃、10℃、20℃、45℃、50℃、 60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等；在一些实施例中，温度为20-60℃，在一些实施例中，温度为40-60℃，在一些实施例中，温度为45℃。
以化合物v1为起始原料，经过脂肪酶水解催化，即可获得高ee选择性的化合物v2，这能够降低手性拆分的难度、提高选择性并降低生产成本。
本发明第三方面提供了一种化合物v3的制备方法，包括以下步骤：
化合物v1通过一步或二步以上反应制备得到化合物v3；
Figure PCTCN2022105411-appb-000004
在一些实施例中，制备化合物v3包括以下步骤：
S310：使化合物v1进行反应，得到化合物v2；以及
S320：使化合物v2进行反应，得到化合物v3；
Figure PCTCN2022105411-appb-000005
在一些实施例中，所述v2化合物采用本发明第二方面所述的制备方法制备得到。
在一些实施例中，所述化合物v2通过环化反应制备得到化合物v3。
在一些实施例中，所述化合物v2的环化反应中，采用正丁基锂的正己烷溶液。
在一些实施例中，所述化合物v2的环化反应在-75～-10℃(优选-75℃)条件下进行。
在一些实施例中，所述化合物v2的环化反应在无水THF溶液中进行。
本发明第四方面提供了一种化合物v5的制备方法，包括以下步骤：
化合物v3通过一步或二步以上反应制备得到化合物v5；
Figure PCTCN2022105411-appb-000006
在一些实施例中，制备化合物v5的步骤中，包括采用本发明第二方面所述的制备方法制备化合物v2的步骤。
在一些实施例中，化合物v5的制备方法包括以下步骤：
Figure PCTCN2022105411-appb-000007
S410：使化合物v3和盐酸羟胺进行缩合反应，制得化合物v4；以及
S420：使化合物v4进行还原反应，制得化合物v5。
在一些实施例中，所述化合物v3采用本发明第三方面所述的方法制备得到。
在一些实施例中，所述步骤S410中，缩合反应在碱(在一些实施例中，碱为吡啶)和醇溶剂(在一些实施例中，醇溶剂为甲醇)的混合体系中进行。
在一些实施例中，所述步骤S410中，化合物v3和盐酸羟胺的摩尔比为1:1.1-1:1.5(优选为1:1.2)。
在一些实施例中，所述步骤S410中，化合物v3和碱(在一些实施例中，碱为吡啶)的摩尔比为1:1.1-1:1.5(在一些实施例中，摩尔比为1:1.25)。
在一些实施例中，所述步骤S410中，缩合反应的温度为50-70℃(在一些实施例中，温度为65℃)。
在一些实施例中，所述步骤S420中，采用的还原剂选自：Pd/C和氢气、硼氢化钠、三仲丁基硼氢化锂、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、锌和醋酸。
在一些实施例中，步骤S420后还包括使化合物v5进行成盐反应制得化合物v5的盐的步骤；在一些实施例中，化合物v5的盐为化合物v5的L-酒石酸盐。
本发明第五方面提供了一种化合物Ia的制备方法，包括以下步骤：
S510：将化合物Ia-1进行手性拆分，制得化合物Ia；
Figure PCTCN2022105411-appb-000008
在一些实施例中，所述手性拆分的方法为仪器拆分或化学拆分。
在一些实施例中，所述手性拆分采用的拆分试剂为D-酒石酸、D-二苯甲酰酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-樟脑磺酸或S-联萘酚磷酸酯；在一些实施例中，拆分试剂为S-联萘酚磷酸酯。
以消旋体化合物Ia-1为起始原料，经过手性拆分，获得化合物Ia化合物，能够大幅度降低生产成本。
在一些实施例中，化合物Ia的制备方法包括以下步骤：
S520：将(R)-2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙腈进行还原反应，制得化合物Ia，
Figure PCTCN2022105411-appb-000009
在一些实施例中，步骤S520中，采用LiAlH 4进行还原。
在一些实施例中，化合物Ia的制备方法包括以下步骤：
S531：将2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙腈进行还原反应制得化合物1a-1； 以及
S532:将化合物1a-1进行拆分，制得化合物1a，
Figure PCTCN2022105411-appb-000010
在一些实施例中，所述手性拆分的方法为仪器拆分或化学拆分。
在一些实施例中，步骤S532中采用(S)-联萘酚磷酸酯进行拆分。
本发明第六方面提供了一种化合物I的制备方法，包括以下步骤：
S610：将化合物Ia和化合物v3进行还原胺化反应，制得化合物I；
Figure PCTCN2022105411-appb-000011
在一些实施例中，所述化合物v3采用本发明第三方面所述的制备方法制备得到。
在一些实施例中，所述化合物Ia采用本发明第五方面所述的方法制备得到。
在一些实施例中，制备化合物I的步骤中，包括采用本发明第二方面所述的制备方法制备化合物v2的步骤。
在一些实施例中，步骤S610中，所述化合物Ia和化合物v3的还原胺化反应在催化剂、有机溶剂和还原剂的反应体系下进行。
在一些实施例中，所述催化剂是钛酸四乙酯和/或钛酸四异丙酯。
在一些实施例中，所述有机溶剂选自C 1-4烷基醇(优选甲醇、乙醇)、甲苯、二甲苯、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醚、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、乙腈、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其组合。
在一些实施例中，所述还原剂选自硼氢化四丁基胺盐、丙二酰氧基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾和硼烷中的一种或多种。
本发明第七方面又提供了一种化合物I的制备方法，包括以下步骤：
S620：使化合物Ib和化合物v5进行还原胺化反应，制得化合物I：
Figure PCTCN2022105411-appb-000012
在一些实施例中，所述化合物v5采用本发明第四方面所述的方法制备得到。
在一些实施例中，所述化合物v5采用以下合成路线制备得到：
Figure PCTCN2022105411-appb-000013
在一些实施例中，步骤S620中，所述化合物Ib和化合物v5的还原胺化反应在有机溶剂和还原剂的反应体系下进行；在一些实施例中，所述有机溶剂选自C 1-4烷基醇(优选甲醇)、甲苯、二甲苯、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醚、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、乙腈、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其组合；在一些实施例中，所述还原剂选自硼氢化四丁基胺盐、丙二酰氧基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化钾及硼烷。
在一些实施例中，步骤S620中，还包括采用以下方法制备化合物Ib的步骤：
Figure PCTCN2022105411-appb-000014
S621：将(R)-2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸基-9-基)乙腈进行还原反应，制得化合物Ib。
在一些实施例中，步骤S621中，采用二异丁基氢化铝溶液进行还原反应。
本发明通过反应路线的优化，能够以较高收率地获得具有较高ee值的式I所示化合物，且上述方法的各步骤反应条件较为温和，后处理简单方便，环境友好，易于放大生产，具有较高的工业应用价值。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的实施例14中化合物v2与苄胺的盐所培养的晶体的单晶结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不旨在限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域中公知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，否则本文所用的术语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或同等的方法及材料皆可应用于本发明中。
如本文所用的缩写的解释如下：THF为四氢呋喃，EA为乙酸乙酯，PE为石油醚，DMF为二甲基甲酰胺，DMSO为二甲基亚砜，r.t.为室温，DCM为二氯甲烷，DBU为1,8-二氮杂 二环十一碳-7-烯，TEMPO为2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物，Oxone为过氧单磺酸钾，IBX为2-碘酰基苯甲酸，MeOH为甲醇，EtOH为乙醇，IPA为异丙醇，ACN为乙腈，MTBE为甲基叔丁基醚，PEG400为聚乙二醇400，equiv表示当量。
如本文所用，室温是指约为20-25℃。
如本文所用，“源自南极假丝酵母的脂肪酶”包括2种脂肪酶，分别为南极假丝酵母脂肪酶A和南极假丝酵母脂肪酶B。南极假丝酵母脂肪酶B可以经固定化处理，例如吸附固定于大孔丙烯酸树脂的南极假丝酵母脂肪酶B(诺维信435)、在Immobead 150上固定化的南极假丝酵母脂肪酶B。南极假丝酵母脂肪酶B也可以不经固定化处理，例如市售的
Figure PCTCN2022105411-appb-000015
CALB L。
以下实施例中所用缓冲液的配制：
缓冲液pH7.22：250mL水+2.4g K 2HPO 4+0.83g KH 2PO 4
缓冲液pH 8.8：150mL水+0.5g K 2HPO 4
缓冲液pH4.7：200mL水+0.5g KH 2PO 4
缓冲液pH7.8：64.5mL水+1.5g K 2HPO 4+0.25g KH 2PO 4
以下实施例中所用脂肪酶均来自市售的商品，具体如下：
Figure PCTCN2022105411-appb-000016
实施例1：化合物v1的制备
Figure PCTCN2022105411-appb-000017
步骤1：向3L单口瓶中加入三乙基膦酰乙酸酯(476mL,2.4mol)，DBU(365g，2.4mol)，氯化锂(127g，3mol)和乙腈(1.2L)，氩气保护下室温搅拌20分钟。冷却到0℃(内温)， 缓慢滴加异丁醛(144g，2mol)。室温搅拌12小时。过滤，滤饼用EA洗涤两次(100mL x 2)。加入水(1L),用EA萃取两次(1.5L x 2)，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干得4-甲基-2-戊烯酸乙酯(175g，无色液体)，直接用于下一步反应。
步骤2：向装有4-甲基-2-戊烯酸乙酯(300g,2.1mol)的3L单口瓶中加入DMF(1L)，搅拌下，加入碳酸钾(579g,4.2mol)和吡唑(287g,4.2mol)，65℃，搅拌18小时，直接旋干。剩余固体用乙腈(150ml)打浆，过滤得白色固体。过滤，滤饼用EA洗涤两次(500mL x2)。饱和食盐水洗涤三次(300mL x3)，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析纯化(含5％EA的PE为流动相)，得到化合物v1(258g，产率为58％，无色液体)。MS m/z(ESI):211.1[M+1]。
实施例2：化合物v2的制备
Figure PCTCN2022105411-appb-000018
将150mg化合物v1、50mg脂肪酶和3mL缓冲液pH 7.22放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应60小时，检测化合物v1的水解反应情况，反应条件和反应结果如表1所示。
表1
Figure PCTCN2022105411-appb-000019
实施例3
将150mg化合物v1、75mg
Figure PCTCN2022105411-appb-000020
CALB L南极假丝酵母脂肪酶B、3mL缓冲液pH 7.22和1mL PEG400放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应36小时，检测化合物v1的水解率为41.3％，水解所得化合物v2的ee值为97.3％。
实施例4
将150mg化合物v1、75mg Candiada sp假丝酵母和3mL缓冲液pH 7.22放入10ml试管 中，调节外温至35℃左右，反应36小时，检测化合物v1的水解率为54.7％，水解所得化合物v2的ee值为97.2％。
实施例5
将150mg化合物v1、75mg诺维信435和3mL缓冲液pH8.8放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为54.0％，水解所得化合物v2的ee值为95.7％。
实施例6
将150mg化合物v1、75mg诺维信435和3mL缓冲液pH 4.7放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为56.4％，水解所得化合物v2的ee值为96.8％。
实施例7
将150mg化合物v1、75mg诺维信435和3mL缓冲液pH 7.8放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为66.8％，水解所得化合物v2的ee值为93.3％。
实施例8
将300mg化合物v1、50mg诺维信435和6mL缓冲液pH 7.8放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应20小时，检测化合物v1的水解率为40.9％。
实施例9
将300mg化合物v1、100mg诺维信435和6mL缓冲液pH 7.8放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应6小时，检测化合物v1的水解率为72.3％。
实施例10
将150mg化合物v1、30mg诺维信435和3mL缓冲液pH 7.8放入10ml试管中，调节外温至45℃左右，反应5小时，检测化合物v1的水解率为49.3％，水解所得化合物v2的ee值为96.5％。
实施例11
将150mg化合物v1、75mg诺维信435和3mL纯水放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为53.9％。
实施例12
将150mg化合物v1、75mg诺维信435、3mL缓冲液pH 7.8和1mL PEG400放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为59.4％，水解所得化合物v2的ee值为94.2％。
实施例13
将150mg化合物v1、75mg诺维信435、3mL缓冲液pH 7.8和1mL二氧六环放入10ml试管中，调节外温至35℃左右，反应16小时，检测化合物v1的水解率为48.2％，水解所得化合物v2的ee值为96.5％。
实施例14
Figure PCTCN2022105411-appb-000021
将缓冲液pH7.8(2.8L水、10.8g KH 2PO 4、65.1g K 2HPO 4)和化合物v1(140g)加入3L三口瓶中，加入诺维信435(28.0g)，搅拌加热至45～50℃反应6-8小时，反应液垫硅藻土过滤，滤液依次用碳酸钠固体调节pH至8～9，用MTBE萃取三次(500ml×3)，取水相，依次用浓盐酸调节至pH 5～6，用MTBE萃取(500mL×3)，取有机相，将有机相旋干得化合物v2(粘稠的淡黄色油状化合物，60.9g，收率50％，ee值87.38％，纯度98.4％)。MS m/z(ESI):183.1[M+1]。
化合物v2与苄胺的盐的培养晶体：称取30mg的化合物v2溶于1mL MTBE中，加入20mg苄胺，室温搅拌10分钟，析出白色固体。过滤，滤饼加入0.5mL甲醇溶解，静置过夜后，析出无色晶体，送单晶衍射。通过布鲁克公司D8venture X单晶衍射仪对本实施例所得无色透明晶体进行单晶X-ray分析，所得产物的晶体结构图如图1所示。化合物v2可由化合物v2与苄胺的盐的单晶结构推断其绝对构型为(S)构型。
仪器参数：
Figure PCTCN2022105411-appb-000022
实施例15
Figure PCTCN2022105411-appb-000023
在氮气保护下，向三口瓶(5L)中加入化合物v2(77.3g，ee值为87.38％)和无水THF(1.5L)，降温到-75℃。缓慢滴加2.5M的正丁基锂的正己烷溶液(424mL,1.06mol,2.5equiv)，控制温度不高于-65℃，滴加完毕继续搅拌3小时。滴加400mL饱和氯化铵，再滴加水(400mL)，搅拌10min后分液，用250mL乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，浓缩得棕色油状物。柱层析纯化(PE:EA＝10:1)得到化合物v3(14.8g,Y:21.4％，淡黄色固体，纯度92.5％，ee值92.1％)。MS m/z(ESI):165.1[M+1]。
实施例16
Figure PCTCN2022105411-appb-000024
步骤1：将化合物v3(6.6g,4.02mmol,1.0equiv)加入100mL三口瓶中，加入无水甲醇(50mL,7.5v/w)、盐酸羟胺(3.33g,4.8mmol,1.2equiv)和吡啶(3.97g,5.03mmol,1.25equiv)，升温至65℃，反应1小时。反应液旋干，加水60mL搅拌，再加入二氯甲烷30mL萃取；分液，水相再用二氯甲烷萃取两次(30mL×2)；合并有机相，有机相浓缩后，柱层析纯化(PE：EA＝4:1，v/v)得到化合物v4(淡黄色固体，5.5g,产率76.4％，纯度97.1％)。
步骤2：将化合物v4(4.5g,25.1mmol,1.0equiv)溶于120mL无水甲醇，加入10wt％Pd/C500mg；氢气置换三次，维持高压釜内温55℃到65℃之间，保持釜内压力20～25atm；反应2h左右停止吸氢；过滤，滤液旋干得化合物v5(无色油状物3.5g，ee值88.3％)。将化合物v5溶于5mL无水乙醇中，将L-酒石酸(3.9g，26.0mmol，1.2equiv)溶于25mL乙醇并缓慢加入上述乙醇溶液中，室温搅拌2h，析出大量固体；过滤，得化合物v5的酒石酸盐(5.8g白色晶体，手性纯度95.9％)；5.8g固体在45mL无水甲醇中回流打浆2h，再降至室温搅拌1h，过滤，得5.2g进一步纯化的化合物v5的酒石酸盐(收率77.8％，纯度99.6％，ee值为99.6％)。将进一步纯化的化合物v5的酒石酸盐(5.9g)溶于水(25mL)中，用饱和碳酸钠水溶液调节pH至11左右，用二氯甲烷萃取六次(10mL×6)，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸除溶剂，得化合物v5(ee值为99.6％)。
实施例17：化合物Ia的合成
方法1：
Figure PCTCN2022105411-appb-000025
将(R)-2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙腈(5.0g,19.5mmol,1.0equiv)溶于50mL无水THF；冰浴，使内温为5～10℃，分批加入LiAlH 4(2.2g,58.5mmol,3.0equiv)；冰浴，使内温为5～10℃，反应液加入4.4g水，再加入4.4g 15％wt NaOH溶液；继续加入13.2g水，搅拌10min过滤；滤液旋干，柱层析(DCM：MeOH＝10:1，v/v)得橙黄色油状物Ia(3.3g，收率65％，纯度98.3％)。
方法2：
Figure PCTCN2022105411-appb-000026
步骤1：将2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙腈(25.0g,100mmol,1.0equiv)溶于500mL无水THF；冰浴，使内温为5～10℃，分批加入LiAlH4(23.8g,0.63mol,6.3equiv)；室温反应过夜，无原料；冰浴，使内温为5～10℃，反应液加入23.8g水，再加入23.8g15％wtNaOH溶液；过滤，滤饼用100mL四氢呋喃洗涤；滤液旋干，得2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙胺(淡黄色油状物12.5g，收率约50％)。
步骤2：取2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸烷-9-基)乙胺(2.6g)溶于无水乙醇(15mL)， 称取(S)-联萘酚磷酸酯(3.50g)加入体系中；旋干后，加入4mL无水乙醇升温溶清，加入30mL甲苯，降至室温，析出白色固体；过滤，滤饼用少量甲苯洗涤，烘干，得化合物Ia(1.3g白色固体，收率21.3％，纯度98.0％，ee值83.2％)。
实施例18：化合物Ib的合成
Figure PCTCN2022105411-appb-000027
将(R)-2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸基-9-基)乙腈(11g，43mmol，购于上海予成医药科技有限公司，CAS编号1401031-38-6)溶于DCM(100ml)溶液中，在-78℃下滴加二异丁基氢化铝溶液(1.0M，86ml)，-78℃下搅拌1小时。反应液加入十水合硫酸钠(30g)，室温搅拌半小时，过滤，减压浓缩滤液得到黄色油状中间体。将中间体溶于乙醇(100ml)溶液中，加入盐酸(6N，100ml)溶液，100℃搅拌36小时。减压浓缩，用制备液相色谱纯化所得残余物，得到(R)-2-(9-(吡啶-2-基)-6-氧杂螺[4.5]癸基-9-基)乙醛1b(6.5g，收率59％)。MS m/z(ESI):260.2[M+1]。
实施例19：化合物I的合成
方法1：
Figure PCTCN2022105411-appb-000028
将化合物Ia(1.82g,7.0mmol,1.0equiv)和化合物v3(1.15g,7.0mmol,1.0equiv)加入50mL三口瓶中；加入25mL乙醇溶解；氮气保护，室温加入Ti(OiPr) 4(5.0g,17.6mmol,2.5equiv)；升温至65～70℃，反应2h；降至室温，加入NaBH 4(0.99g,26.3mmol,3.75equiv)；室温反应2h；反应液加入100mL水中，利用硅藻土助滤，滤饼用少量MTBE洗涤；分液，水相用MTBE萃取2次(50mL×2)；有机相旋干，手性纯度83.9％；柱层析(DCM：MeOH＝10:1，v/v)，得2.0g无色油状物I，MS m/z(ESI):409.2[M+1]； 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.51(ddd,J＝4.9,1.8,0.8Hz,1H),7.79–7.71(m,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(d,J＝1.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝7.5,4.9,1.0Hz,1H),5.87(dd,J＝1.9,0.6Hz,1H),4.07(ddd,J＝21.0,11.7,6.2Hz,2H),3.81–3.69(m,2H),2.73–2.58(m,2H),2.52(dd,J＝14.0,2.3Hz,1H),2.48–2.35(m,2H),2.12–1.97(m,2H),1.95–1.82(m,2H),1.78–1.65(m,3H),1.64–1.36(m,5H),1.14–1.04(m,1H),0.99(d,J＝7.0Hz,3H),0.79–0.65(m,4H).
方法2：
Figure PCTCN2022105411-appb-000029
将化合物1b(50mg，0.3mmol)溶解于(5mL)甲醇中，加入化合物v5(78.3mg，0.3mmol)和氰基硼氢化钠(94mg，1.5mmol),20℃搅拌反应3小时。向反应液中加入20mL水，用DCM萃取两次(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩物用制备色谱法纯化(制备柱：21.2X250mm C18柱，体系：10mM NH 4HCO 3H 2O波长：254/214nm，梯度：30％-60％乙腈变化)，得到化合物I(10.12mg)。MS m/z(ESI):409.2[M+1]； 1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ8.51(ddd,J＝4.9,1.8,0.8Hz,1H),7.79–7.71(m,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(d,J＝1.9Hz,1H),7.22(ddd,J＝7.5,4.9,1.0Hz,1H),5.87(dd,J＝1.9,0.6Hz,1H),4.07(ddd,J＝21.0,11.7,6.2Hz,2H),3.81–3.69(m,2H),2.73–2.58(m,2H),2.52(dd,J＝14.0,2.3Hz,1H),2.48–2.35(m,2H),2.12–1.97(m,2H),1.95–1.82(m,2H),1.78–1.65(m,3H),1.64–1.36(m,5H),1.14–1.04(m,1H),0.99(d,J＝7.0Hz,3H),0.79–0.65(m,4H).
生物测试
以下测试例所使用的细胞株为
Figure PCTCN2022105411-appb-000030
CHO-K1 OPRM1 β-Arrestin Cell Line，来源：DiscoverX，编号：93-0213C2,批号：13K0402。
所使用的试剂、其供应商、货号和存储温度如下：
Assay Complete  TM Cell Culture Kit 107，DiscoverX，92-3107G，-20℃；
AssayComplete TM Thawing Reagent，DiscoverX，92-4002TR，-20℃；
AssayComplete TM Cell Detachment Reagent，DiscoverX，92-0009，-20℃；
Assay Complete TM Cell Plating Reagent，DiscoverX，93-0563R2，-20℃；
PathhunterDetection Kit，DiscoverX，93-0001，-20℃；
PBS(1×)0.0067M(PO4)，Hyclone，SH30256.01，4℃；
DMSO，Sigma，D5879-100ML，常温；
NKH477，Sigma，1603，-20℃；
IBMX，Tocris，I5879，-20℃。
所使用的仪器、其型号和供应商如下：
Countsatr BioMed，IM1200，ALIT；
Microscope，IX51，OLYMPUS；
Centrifuge，5804，Eppendorf；
Thermostatic Water Bath，DK-S420，ShanghaiShenxian thermostatic equipment factory；
Cell Incubator，3111，Thermo；
Biological Safety Cabinet，BSC-1300IIA2，AIRTECH；
OptiPlate-384White Opaque，6007290，Perkin Elmer；
Multimode plate Reader，Victor X5，PerkinElmer；
Culture Plate-384White Opaque,TC-treated，6007680，PerkinElmer。
测试例1 HTRF-cAMP细胞实验
实验方法和步骤
一、细胞复苏
1、将复苏液从4℃冰箱中取出放37℃水浴锅中预热15分钟。
2、从液氮罐中取出P6代细胞，将冰冻的细胞冻存管迅速放在37℃水浴锅中轻轻晃动30秒到1分钟，直到看见小冰晶或细胞即将完全融化。
3、用70％的酒精进行彻底的消毒擦干。
4、离心去除冻存液，用预先预热的新鲜复苏液重悬细胞：
a、吸取3ml预先预热的细胞复苏液到15ml离心管；
b、1300rpm离心3分钟；
c、去除上清冻存液，用4ml预热的复苏液重悬细胞。
5、将细胞混悬液转移到T25细胞培养瓶中培养24小时，37℃，5％CO 2。
6、培养24小时后，将细胞培养瓶中的复苏液换成预热好的细胞培养基。
二、细胞传代
1、当细胞在T25培养瓶中的生长密度>70％时,用细胞消化液对细胞进行消化传代培养：
a、吸出培养瓶中的培养基，加入4ml预先预热的PBS，轻轻晃动润洗细胞，吸弃PBS；
b、吸取1ml细胞消化液加入到T25培养瓶中；
c、反复摇晃培养瓶使消化液彻底覆盖培养瓶，放在37℃,5％CO 2培养箱中5分钟；
d、取出细胞培养瓶，在显微镜下观察细胞，看细胞是否被分离；
e、加入3ml预热好的细胞培养基，终止消化；
f、用细胞培养基反复轻轻冲洗培养瓶，收集细胞悬液到15ml离心管；
g、1300rpm离心3分钟，去除上清；
h、用3ml细胞培养基重悬。
2、按1：3的比例进行细胞传代(每瓶加入1ml的细胞重悬液+3ml的细胞培养基，传至T25瓶)。
三、细胞种板
1、重复步骤二中的步骤1(a-h)，直到细胞传到P8代。细胞计数，然后用2×/1mM IBMX stimulation buffer液重悬细胞，使细胞密度为1.2*10^6/ml.
2、使用多通道移液器，将1.2*10^6/ml的细胞溶液，以每孔10μl的体积(即每孔12000个细胞)种在384孔板内。
四、c-AMP试验
1、配置相关试剂，按药物稀释配置表，配置化合物：
a、1×Stimulation buffer液：取1ml的5×Stimulation buffer存储液加到4ml的蒸馏水中，混匀；
b、2×/1mM IBMX stimulation buffer液5ml：取10ul 500mM IBMX存储液加到4990μl细胞培养基中，轻轻吹打混匀；
c、阳性药吗啡的梯度稀释配置表：
Figure PCTCN2022105411-appb-000031
d、化合物稀释之前，先将化合物用DMSO溶解，使其存储浓度为10mM；
阳性药TRV130和各化合物稀释配置表：
Figure PCTCN2022105411-appb-000032
Figure PCTCN2022105411-appb-000033
e、50uM NK477 1ml：取1μl 50mM NKH477存储液加到999μl 1×Stimulation buffer液中，震荡混匀；
f、检测试剂
A.cAMP-Cryptate(donor,lyophilized)反应液：取1ml 5×cAMP-Cryptate存储液加到4ml 1×Lysis&Detection Buffer液中，轻轻混匀。
B.Anti-cAMP-d2(acceptor,lyophilized)反应液：取1ml 5×Anti-cAMP-d2存储液加到4ml 1×Lysis&Detection Buffer液中，轻轻混匀。
2、cAMP试验步骤
a、在10μl含2xIBMX stimulation缓冲液中每孔接种12000个细胞；
b、在每孔细胞中加入8μl的化合物样品稀释液；
c、每孔中加入配置好的2μl 10xNKH477液；
d、37℃孵育45mins；
e、加入10μl cAMP-d2和10μl抗cAMP Cryptate反应液；
f、室温避光孵育60mins。
3、RFU检测读板
孵育60分钟后，所有的样品将通过均相时间分辨荧光的方法检测读板。
数据分析
将数据从多功能读板仪连接的电脑中对应软件导出，包括665nm和620nm两个信号值。比率的计算公式为：比率＝665nm信号值/620nm信号值×10000。用GraphPad Prism软件对数据进行分析。最佳拟合曲线选用log(agonist)vs.response。利用计算机辅助剂量-反应曲线的非线性回归分析方式确定化合物的EC 50值；pEC50＝-logEC50(EC50值的单位是摩尔)；％吗啡的最大效应值＝(化合物样品比率-空白孔比率)/TOP×100(注：TOP值是吗啡样品比率-空白孔比率后通过软件Graphpad Prism分析拟合的曲线Top值)。结果如表2所示：
表2 化合物对cAMP的活性
Figure PCTCN2022105411-appb-000034
Figure PCTCN2022105411-appb-000035
测试例2 β-Arrestin细胞实验
实验方法和步骤
一、细胞复苏
1、将复苏液从4℃冰箱中取出放37℃水浴锅中预热15分钟。
2、从液氮罐中取出P6代细胞，将冰冻的细胞培养管迅速放在37℃水浴锅中轻轻晃动30秒到1分钟，直到看见小冰晶或细胞即将完全融化。
3、用70％的酒精进行彻底的消毒擦干。
4、离心去除冻存液，用预先预热的新鲜复苏液重悬细胞：
a、吸取3ml预先预热的细胞复苏液到15ml离心管；
b、1300rpm离心3分钟；
c、去除上清，用4ml预热的复苏液重悬细胞。
5、将细胞混悬液转移到T25细胞培养瓶中培养24小时，37℃，5％CO 2。
6、培养24小时后，将细胞培养瓶中的复苏液换成预热好的细胞培养基。
二、细胞传代
1、当细胞在T25培养瓶中的生长密度>70％时,用细胞消化液对细胞进行消化传代培养：
a.吸出培养瓶中的培养基，加入4ml预先预热的PBS，轻轻晃动润洗细胞，吸弃PBS；
b.吸取1ml细胞消化液加入到T25培养瓶中；
c.反复摇晃培养瓶使消化液彻底覆盖培养瓶，放在37℃,5％CO 2培养箱中5分钟；
d.取出细胞培养瓶，在显微镜下观察细胞，看细胞是否被分离；
e.加入3ml预热好的细胞培养基，终止消化；
f.用细胞培养基反复轻轻冲洗培养瓶，最后将细胞悬液转移到15ml离心管；
g.1300rpm离心3分钟，去除上清；
h.用3ml细胞培养基重悬。
2、按1：3的比例进行细胞传代(每瓶加入1ml的细胞重悬液+3ml的细胞培养基，传至T25瓶)。
3、重复步骤二中的步骤1(a-h)，直到细胞传到P8代。
三、细胞种板
1、用移液器取20μl的细胞悬液用细胞计数仪测量细胞数。
2、1300rpm离心3分钟，沉淀细胞。
3、去除上清，加入相应细胞铺板液使细胞浓度为2×10^5/ml。
4、使用多通道移液器，根据实验设计，将2×10^5/ml的细胞溶液，以每孔20ul的体积(即每孔4000个细胞)种在384孔板内。
5、将种好细胞的384孔板放到37℃,5％CO 2培养箱中培养24h。
四、β-arrestin试验
1、按照下列稀释表配置化合物：
a.阳性药吗啡的梯度稀释配置表：
Figure PCTCN2022105411-appb-000036
b.化合物稀释之前，先将化合物用DMSO溶解，使其存储浓度为10mM。
阳性药TRV130和各化合物稀释配置表：
Figure PCTCN2022105411-appb-000037
2、取5μl上述配置好的各化合物样品稀释液加到384孔板中。
3、加完样后，将384孔板放回37℃,5％CO 2培养箱中培养90分钟。
五、RLU检测
1、化合物孵育结束前，按下列比例配置Working Detection溶液(注意避光)。然后每孔加入12.5μl，避光、常温、摇床孵育1h。
Figure PCTCN2022105411-appb-000038
2、化合物孵育结束，每孔加入12.5μl上述工作液，避光、常温、80rpm摇床孵育1h。
3、孵育结束，运用多功能读板仪进行读板。
数据分析
将数据从多功能读板仪连接的电脑中对应软件导出，用GraphPad Prism软件对数据进行分析。最佳拟合曲线选用log(agonist)vs.response。利用计算机辅助剂量-反应曲线的非线性回归分析方式确定化合物的EC50值；PEC50＝-logEC50(EC50值的单位是摩尔)；％吗啡的最大效应值＝(化合物样品的RLU值-空白孔的RLU值)/TOP×100(注：TOP值是吗啡样品的RLU值-空白孔的RLU值后通过软件Graphpad Prism分析拟合的曲线Top值)。RLU为相对光单位值。结果如表3所示：
表3 化合物对β-arrestin的测试结果
Figure PCTCN2022105411-appb-000039
从表2和表3可以看出，化合物I对cAMP具有较高的抑制活性，以及较高的Emax值，对β-arrestin具有较低的Emax值，偏向性好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

Claims (20)

  1. 由以下结构式表示的化合物v2或其盐：
    Figure PCTCN2022105411-appb-100001
  2. 一种化合物v2的制备方法，包括：
    使化合物v1在脂肪酶的催化下进行水解反应，制得化合物v2；
    Figure PCTCN2022105411-appb-100002
    所述脂肪酶选自：源自假丝酵母的脂肪酶和源自南极假丝酵母的脂肪酶中的一种或多种。
  3. 如权利要求2所述的制备方法，其中，所述源自南极假丝酵母的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B和南极假丝酵母脂肪酶A中的任何一种或两种。
  4. 如权利要求3所述的制备方法，其中，所述南极假丝酵母脂肪酶B为未经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B和经固定化处理的南极假丝酵母脂肪酶B中的任何一种或两种。
  5. 如权利要求2所述的制备方法，其中，所述水解反应中的溶剂包括：水、缓冲液和有机溶剂中的一种或多种，且所述溶剂至少包含水。
  6. 如权利要求2所述的制备方法，其中，所述化合物v1和所述脂肪酶的质量比为100:1～1:1。
  7. 如权利要求2所述的制备方法，其中，所述水解反应在5-80℃的温度进行。
  8. 一种化合物v3的制备方法，包括：使化合物v1通过一步或二步以上反应制备得到化合物v3；
    Figure PCTCN2022105411-appb-100003
  9. 如权利要求8所述的制备方法，其中，所述方法：
    Figure PCTCN2022105411-appb-100004
    使化合物v1进行反应，制得化合物v2；以及
    使化合物v2进行反应，制得化合物v3。
  10. 如权利要求9所述的制备方法，其中，所述化合物v2采用权利要求2至7中任一项所述的方法制备得到。
  11. 如权利要求9所述的制备方法，其中，所述化合物v2通过环化反应制备得到化合物v3。
  12. 一种化合物v5的制备方法，包括：使化合物v3通过一步或二步以上反应制备得到化合物v5；
    Figure PCTCN2022105411-appb-100005
  13. 如权利要求12所述的制备方法，其中，所述方法包括：
    Figure PCTCN2022105411-appb-100006
    使化合物v3和盐酸羟胺进行缩合反应，制得化合物v4；以及
    使化合物v4进行还原反应，制得化合物v5。
  14. 如权利要求12所述的制备方法，其中，所述化合物v3采用权利要求8至11中任一项所述的方法制备得到。
  15. 一种化合物I的制备方法，包括：使化合物Ia和化合物v3进行还原胺化反应，制得化合物I；
    Figure PCTCN2022105411-appb-100007
  16. 如权利要求15所述的制备方法，其中，所述化合物v3采用权利要求8至11中任一项所述的方法制备得到。
  17. 如权利要求15所述的制备方法，其中，还包括：将化合物Ia-1进行手性拆分，制得化合物Ia；
    Figure PCTCN2022105411-appb-100008
  18. 如权利要求17所述的制备方法，其中，所述手性拆分中，所采用的手性拆分剂选自D-酒石酸、D-二苯甲酰酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-樟脑磺酸或S-联萘酚磷酸酯。
  19. 一种化合物I的制备方法，包括：使化合物Ib和化合物v5进行还原胺化反应，制得化合物I：
    Figure PCTCN2022105411-appb-100009
    其中，所述化合物v5采用权利要求12至14中任一项所述的方法制备得到。
  20. 如权利要求19所述的制备方法，其中，所述化合物v5采用以下合成路线制备得到：
    Figure PCTCN2022105411-appb-100010
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