JP2007501635A - β−ラクタマーゼ阻害剤中間体を合成するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）

［式中、Ｘ、ＹおよびＲは明細書中に定義されたとおりである］
で示される位置異性体の加水分解可能なエステルの混合物の選択的酵素加水分解によるβ−ラクタマーゼ阻害剤の調製に有用な式（Ｉ）

［式中、ＸおよびＹは明細書中に定義されたとおりである］
で示される中間体、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸の酵素的製法に関する。

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤の調製において有用な中間体二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸の、位置異性体の加水分解可能なエステルの混合物の選択的酵素加水分解による酵素的製造方法に関する。

発明の背景
ヒトの疾患治療のために、新たに改良された抗生物質が継続的に求められている。抗生物質耐性生物は、引き続いて問題であり、特に院内における最後の防御物質であるバンコマイシンでは、バンコマイシン耐性株が院内で単離された病原体のなかで増えてきている。近年の調査では、現在、合衆国の病院において腸球菌の７．９％がバンコマイシン耐性である（"Nosocomial Enterococci Resistant to Vancomycin" Morbidity and Mortality Weekly Report 42(30): 597-598 (1993)）。バンコマイシンおよびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）に対する他の抗生物質のさらなる耐性が報告されている（Handwergersら、Clin. Infect. Dis. 1993(16), 750-755）。耐性生物は、また、ペニシリンを包含する他の重要な抗生物質についても問題である。耐性生物を克服する目的、および特定の酵素ベータ−ラクタマーゼ（これは、細菌のある特定の薬物耐性株によって生産される）の活性を阻害することによって抗生物質の効力を増強する目的で、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤が抗生物質と併用または同時投与されている。

明らかに、抗生物質耐性は、公衆衛生において益々大きな問題となってきており、新規な抗生物質を利用可能とすることが、治療計画において、内科医に付加的な選択肢を提供するであろう。さらに、医学界では、継続してさらなる抗生物質に対する要望があることが認められており、同時に、耐性が発現している現在利用可能な抗生物質を増強するために、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤が有用であることが認められている。
新規なベータ−ラクタマーゼ阻害剤の調製には、最終的なベータ−ラクタマーゼ産物の調製に必要な中間体を効率良く製造することができる方法が必要とされる。多くの合成法の場合と同様に、化合物の混合物が製造され、それは、精製のためにクロマトグラフィー分離を必要とする。

本発明は、位置異性体エステル混合物中における１のエステル異性体の選択的酵素加水分解によって、単一のカルボン酸中間体を調製する別法を提供することによって、混合物の精製および分離の問題を克服する。速度論的分割によるキラル分子の分離のためのリパーゼ、エステラーゼまたはプロテアーゼなどの加水分解酵素の使用は、文献において非常によく確立されている（Zaks, A,. Curr. Opinion in Chem Biol. 2001, 5, 130-136.; Wang, C-H and Whitesides G.M. In Enzymes in synthetic organic chemistry: Tetrahedron organic chemistry series vol. 12: pp. 41-130, Pergamon press; Berglund P, and Hult, K. Biocatalytic synthesis of enantiopure compounds using lipases, pp 633-657, In "Stereoselective biocatalysis", ed. Patel, R.N. Marcel Dekker Inc., 2000）。同一分子上に存在するエステル基のうちの１つの酵素による選択的切断（位置選択性ともいう）もまた、既知である（Keller, J.W, Hamilton, B.J., Tetrahedron Letts.1986, 27, 1249.; Pirrung M.C., and Krishnamurthy N., J. Org. Chem. 1993, 58, 954）。

しかしながら、本発明において記載される酵素加水分解による位置異性体エステルの選択的加水分解および所望の得られるカルボン酸中間体化合物の分離は、知られていない。

発明の概要
本発明は、式

［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７の製法であって、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６（式中、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである）の酵素加水分解、または式

［式中、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物中における二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の選択的酵素加水分解により、式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を製造し、次いで、該二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離することを特徴とする製法に関する。

アルキルは、１〜６個の炭素原子からなる直鎖または分枝鎖アルキル基である。

アリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）は、アリール基で置換された１〜６個の炭素原子からなるアルキル基を意味し、ここに、アリール基は、６〜１２個の炭素原子からなる芳香族炭化水素基として定義され、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、ビフェニレニルおよびアセナフテニルからなる群から選択される。アリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）基は、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、３−フェニルエチル、２−フェニルプロピル、４−ニトロベンジル等を包含する。

初期の特許出願では、位置異性体エステル混合物からの、エステルのクロマトグラフィー分離、適当なエステルのアルコールへの還元、およびアルコールのアルデヒドへの酸化による二環式ヘテロアリール−２−カルバルデヒドの製法が開示されている（２００２年５月１日に出願された米国特許出願番号第６０／３７７０５２号、Ｗｙｅｔｈ Ｃａｓｅ ＡＭ１００８６２Ｌ１を参照のこと）。本明細書に記載の合成は、クロマトグラフィーの必要性を省く。

本発明では、専ら、１のエステル異性体を酵素的に切断し、それにより、効果的に、ベーターラクタマーゼ阻害剤の調製に有用な所望の中間体カルボン酸の第２のエステル異性体からの分離を容易にする。

５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸は、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、（５Ｒ，６Ｚ）−６−（５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−イル−メチレン）−７−オキソ−４−チア−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタ−２−エン−２−カルボン酸の調製における重要な中間体であり、該重要な中間体は、位置異性体混合物の化学的加水分解または個々の位置異性体のクロマトグラフィー分離、次いで、化学的加水分解によって生成されうる。しかしながら、異性体混合物の化学的加水分解後、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸を単離するために、別途、困難なクロマトグラフィー分離が必要となる。

本明細書中に記載されるように、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸は、水性溶媒中における所望のエステルの酵素加水分解によって、エステル異性体混合物から選択的に合成される。化学的方法によるエステルの分離は、望ましくないエステルの非選択的加水分解を導き、その結果、低異性体純度の酸をもたらすであろう。さらに、酵素加水分解は、結晶化工程を省くことができる。５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸の単離酸純度は、９９％より高く、記載の酵素的方法による収率は、少なくとも８２％であり、水性溶媒の有機溶媒抽出による望ましくないエステルの分離、水性溶媒の酸性化およびろ過による不溶性酸の単離という非常に単純な製造工程を含む。この単純な製造条件および安価な酵素は、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸の調製のためのプロセス効率を向上する。

特に、本発明は、式

［式中、ＸおよびＹは下記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を選択的に製造するための式

［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物の酵素加水分解法であって、
ａ）二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物（ここに、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである）を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；
ｂ）塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
ｃ）有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
ｄ）水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；
ｅ）式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を遊離酸として、または医薬上許容される塩として単離することを特徴とする方法である。

特に、リパーゼ、アシラーゼおよびプロテアーゼ酵素が５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルよりも、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルに対して選択性を示す。

本発明は、さらに、式

［式中：
Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
ｎは１または２であり；
ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１の製法であって、

ａ．式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるアミノ酸１をニトロソ化試薬でニトロソ化して式２

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるニトロソ化合物を形成させ；

ｂ．ニトロソ化合物２と脱水剤とを反応させ、無機塩基で中和して式３

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるイリドを形成させ；

ｃ．式３のイリドと式４

［式中、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである］
で示されるプロピオール酸エステルとを非プロトン性溶媒中で反応させて、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物

［式中、Ｒ_１、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を形成させ；

ｄ．二環式−ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；
ｅ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
ｆ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
ｇ．水性溶媒を分離し、任意で、無機酸によってｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；

ｈ．式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離し；

ｉ．二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその医薬上許容される塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８

［式中、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基であり、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を形成させ；

ｊ．活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるアミドを提供し；

ｋ．式１０のアミドを還元剤で還元して、二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を提供し、次いで、二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１を単離する工程を含む製法を提供する。

本発明のさらなる具体例は、二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１

［式中、
Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
ｎは１または２であり；
ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
の製法であって、

ａ．二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりであり、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである］
を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；

ｂ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
ｃ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
ｄ．水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；

ｅ．式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその医薬上許容される塩を単離し；

ｆ．二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８

［式中、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基であり、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を形成させ；

ｇ．活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０

［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
で示されるアミドを提供し；

ｈ．式１０のアミドを還元剤で還元して、式１１

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを提供し、次いで、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを単離する工程を含む製法を提供する。

本発明は、さらに、式

［式中、
ＡおよびＢのうち１つは水素を示し、他方は、基

を示し；
Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
ｎは１または２であり；
ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２であり；
Ｒ_３は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルであり；
Ｒ_６は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキル、−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステル、または医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩である］
で示される二環式ヘテロアリールペネム−２−カルボン酸１６保護酸、医薬上許容される塩または好ましくは、アルカリ金属塩の製法であって、

ａ．式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるアミノ酸１をニトロソ化試薬でニトロソ化して、式２

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるニトロソ化合物を形成させ；

ｂ．ニトロソ化合物２を脱水剤と反応させ、無機塩基で中和して、式３

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示されるイリドを形成させ；

ｃ．式３のイリドと式４

［式中、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである］
で示されるプロピオール酸エステルとを非プロトン性溶媒中で反応させて、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物

［式中、Ｒ_１、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を形成させ；

ｄ．二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物（ここに、Ｘ、ＹおよびＲ_１は上記のとおりである）を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；
ｅ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
ｆ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル５を除去し；
ｇ．水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；

ｈ．式

［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離し；

ｉ．二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその医薬上許容される塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８

［式中、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基であり、ＸおよびＹは上記のとおりである］
を形成させ；

ｊ．活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０

［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
で示されるアミドを提供し；

ｋ．式１０のアミドを還元剤で還元して、式１１

［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを提供し；

ｌ．二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１を式

［式中、Ｒ_６は、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルおよび−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステルまたはさらにベンジルもしくはｐ−ニトロベンジル保護基である］
で示されるブロモ−ペネム１３と、ルイス酸、エーテル化合物および弱塩基の存在下で縮合して、式

［式中、Ｘ、ＹおよびＲ_６は上記のとおりである］
で示されるアルドール１４を形成させ；

ｍ．アルドール１４を酸塩化物または無水物、（Ｒ_４）Ｃｌまたは（Ｒ_４）_２Ｏあるいはテトラハロメタン、Ｃ（Ｘ_１）_４、およびトリフェニルホスフィンと反応させて、中間体化合物１５

［式中、Ｒ_４は、アルキルＳＯ_２、アリールＳＯ_２、アルキルＣＯ、またはアリールＣＯであり；Ｘ_１は、Ｂｒ、ＩまたはＣｌであり；Ｘ、ＹおよびＲ_６は、上記のとおりであり；Ｒ_５は、Ｘ_１またはＯＲ_４である］
を形成させ；

ｎ．中間体化合物１５を還元的脱離過程によって、式

［式中、Ｒ_６はＨである］
で示される二環式−ヘテロアリール−ペネム−２−カルボン酸１６に変換し、また、所望により、その医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩、または式中、Ｒ_６がＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルまたは−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６であるエステルに変換してもよく、次いで、二環式ヘテロアリール−ペネム−２−カルボン酸１６を単離する工程を含む製法を提供する。

本発明は、また、式６の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステルの酵素加水分解、または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物における選択的な式６の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステルの酵素加水分解により、式７の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸を製造することを特徴とする式７の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸の製法を包含する。得られる式７の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸は、例えば、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその反応性誘導体を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（ここに、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示されるアミンまたはその反応性誘導体と反応させて式１０のアミドを得、次いで、式１０のアミドを還元剤で還元することによって、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドに変換してもよい。式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドは、式１６の化合物に変換してもよい。式１６の化合物は、ＷＯ０３／０９３２７９に記載の方法において、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドから調製してもよい。

好ましい具体例の記載
スキームＩに記載のように、アミノ酸１（Ｌ、Ｄまたはラセミ体）（式中、Ｘ、Ｙ、Ｒおよびｎは上記のとおりである）を、亜硝酸ナトリウムを包含するニトロソ化試薬および塩酸の存在下でニトロソ化して、１−ニトロソ−アミノ酸２を得、それをさらに、重炭酸カリウムまたは炭酸カリウム等の無機塩基の水性溶液あるいは炭酸カリウム粉末等の無水無機塩基との反応混合物中に形成されたトリフルオロ酢酸の中和、およびクロマトグラフィーの必要のないジクロロメタン等の溶媒を用いる所望の生産物の抽出を包含する改良した後処理と共に、記載の方法（Ranganathan, D.; Shakti, B. "A Novel Proline Derived Meso-Ionic Synthon" Tetrahedron Letts. 1983: 24 (10); 1067-1070）を用いることによって、限定するものではないが無水トリフルオロ酢酸を包含する脱水剤と反応させて、イリド３を調製する。置換芳香族炭化水素（例えば、クロロベンゼン、メシチレンなど）、置換アミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなど）、スルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシドなど）およびエーテル（例えば、１，２−ジエチル、１，２−ジメチルなどのエチレングリコールのエーテルなど）を包含する非プロトン性溶媒中、イリド３とプロピオール酸エステル４（式中、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、好ましくは、メチルまたはエチルである）、例えば、プロピオール酸エチルとの、方法（Ranganathan, D.; Shakti, B. "A Novel Proline Derived Meso-Ionic Synthon" Tetrahedron Letts. 1983: 24 (10); 1067-1070)を用いる反応により、二環式−ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６（式中、Ｒ_１、ＸおよびＹは上記のとおりである）の混合物を提供する。好ましい反応温度は、約１００−１６５℃である。好ましい溶媒は、エチレングリコールのエーテル（ジエチル、ジメチルなど）、置換アミド（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）および置換芳香族炭化水素、例えば、クロロベンゼンであり、ここに、所望の二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６に有利な比率のエステル混合物が、約１．５：１〜約３：１の比率で形成される。特に好ましい溶媒は、ジエチルエチレングリコール（１，２−ジエトキシエタン，ＤＥＥ）またはクロロベンゼンを包含し、ここに、該反応は、約１２０−１２５℃にて約８−１２時間で完了し、ポリマー原料由来の混入もほとんどなく、二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式−ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物を所望の二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６に有利な約１．５：１〜約２．５：１の比率で提供する。

二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式−ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物を加水分解酵素と接触させ、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５よりも二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６を選択的に加水分解して、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７（式中、ＸおよびＹは上記のとおりである）を提供する。加水分解酵素は、リパーゼ、アシラーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼを包含する。加水分解酵素は、まず、好ましいｐＨ範囲６．５〜７．８内で緩衝化させてもよい水性溶媒中に溶解させる。酵素活性のために、好ましいｐＨは、エステル加水分解能を有する使用されている特定の酵素の活性状態を促進する有効なｐＨ範囲内にある。加水分解酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼおよびプロテアーゼを包含する。好ましいバッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、リン酸カリウムバッファーまたは約ｐＨ７．２５の他のバッファーを包含する。水性溶媒中における酵素の濃度は、３ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍｌのような範囲で変化してもよく、約６ｍｇ／ｍｌが典型的である。共溶媒を任意で加えてもよい。共溶媒は、アセトニトリルおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、好ましくは、１０％アセトニトリルを包含する。共溶媒としてのアセトニトリルは、その効果について、酵素反応混合物中０〜３０％で試験される。アセトニトリルは、エステル混合物の水性反応系中でのより良好な分布を助ける。結果は、アセトニトリルは酵素選択性に影響を及ぼさないが、１０％を超える濃度では、ほんのわずかに酵素反応速度を遅くすることを示した。化学合成後、さらに精製することなく、粗エステル混合物を酵素反応に用いる場合、１０％（最終濃度）のアセトニトリルの反応への添加により、酵素活性および選択性に負の影響を及ぼすことなく、エステル基質の均一な分布を助ける。固定化酵素調製を用いるので、反応の最後に、酵素の分離が容易である。有効なｐＨ範囲は、約４．０〜約１０．０である。しかしながら、酵素加水分解のｐＨが５．０以下に達すると、酵素活性が阻害され、不完全な基質加水分解をもたらすかもしれない。反応の進行に伴い、塩基、特に、水酸化ナトリウム、または任意で、水酸化アンモニウム等の添加によって、ｐＨを約７．０、好ましくは、約６．５〜約７．８の範囲に維持する。酵素反応時間は、加水分解酵素の種類および反応混合物中で使用される基質濃度により、９〜７２時間の範囲で変更する。基質加水分解の程度は、ＨＰＬＣによって、または反応のｐＨを約７．０に維持するためのアルカリの消費をモニターすることによって、モニターされる。所望のエステル加水分解の程度は、所望の酸生成物の異性体純度に影響を及ぼさないが、基質エステル加水分解が不完全な場合、酸生成物の収率が低くなるであろう。非加水分解エステル二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５からの二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７の精製は、非加水分解エステルの有機溶媒抽出によって容易に達成される。適当な有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチル、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、または非加水分解エステルが溶解できるいずれか他の水と不混和性の有機溶媒、好ましくは、酢酸エチルを包含する。二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７は、分離した水相の凍結乾燥または蒸発によって単離してもよい。二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７は、任意で、分離した水相のｐＨを無機酸、好ましくは、塩酸で約２．０〜約３．０に調整後に、単離してもよい。

スキームＩにさらに記載されるように、二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸７、任意で、そのアルカリ金属塩（ナトリウム、カリウム、リチウムなど）の活性化中間体８への変換は、いくつかの方法によって達成される。好ましくは、適当な非プロトン性溶媒（例えば、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、トルエン、ジメトキシエタン等）中、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルアミド触媒、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下、適当な温度（−１０−３０℃）での二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸７と、塩化オキサリル、塩化チオニルおよび臭化チオニル等の酸ハロゲン化物試薬ＳＯ_２Ｑ_２またはＱＣＯＣＯＱ（ここに、Ｑは、クロロまたはブロモである）との反応により、活性化中間体８（ここに、Ｑはクロロまたはブロモである）が提供される。かくして生成した活性化中間体８をジクロロメタン、トルエン、ジメトキシエタン等の適当な溶媒中、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下、約−１０−５０℃にて、置換ヒドロキシルアミンＲ_３ＮＨＯＲ_２ ９（ここに、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）［すなわち、Ｒ_３、Ｒ_２＝ＭｅであるＲ_３ＮＨＯＲ_２、すなわち、Ｏ，Ｎ−ジメチルヒドロキシルアミン等］と反応させて、アミド１０（ここに、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである）を提供する。好ましい方法は、ジクロロメタン中、約０−２５℃にて、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下で塩化オキサリルを用いて、ＱがＣｌである活性化中間体８を生成し、次いで、ＱがＣｌである該活性化中間体８をピリジンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの存在下、約０−２５℃にて、置換ヒドロキシルアミン塩酸塩９と反応させて、アミド１０（ここに、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである）を得ることを含む。

別法では、ＱがＣｌまたはＢｒである活性化中間体８は、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチル等と水のような２相系において、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどの存在下、置換ヒドロキシルアミン塩酸塩９と反応させてもよい。アミド１０（ここに、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである）を形成するための特に好ましい方法は、ショッテン−バウマン（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍｅｎ）条件を用いることであり、ここに、２−カルボン酸の活性化中間体８（ここに、ＱはＣｌである）のジクロロメタン中溶液（塩化チオニル／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから生成する）を無機塩基、好ましくは、炭酸カリウムの存在下、約１０−２０℃にて、置換ヒドロキシルアミン９の水溶液と反応させる。特に、Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボキサミドが単離後のさらなる精製を必要とすることなく、ショッテン−バウマン条件によって調製される。

アミド１０（ここに、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである）を合成するために、二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸７（５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボン酸を包含する）と置換ヒドロキシルアミン９とのカップリング（スキームＩ）は、いくつかの手法を用いて達成することができる。

典型的なカップリング手法において、二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸７および置換ヒドロキシルアミン９を適当なカップリング試薬と反応させる。適当なカップリング試薬は、カルボン酸基を活性な中間体８（ここに、Ｑは、カップリング試薬から形成される脱離基である）に変換し、その結果、カルボン酸と置換ヒドロキシルアミンとの間にアミド結合が形成される。

適当なカップリング試薬の例は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＥＣ／ＨＢＴ）、カルボニルジイミダゾール、カルボニルジイミダゾール／ヒドロキシベンゾトリアゾール ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＨＢＴ、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物、塩化ジフェニルホスフィニル（ＤＰＰＣｌ）、無水プロパンホスホン酸（プロパンホスホン酸無水物，ＰＡＡ）、シアン化ジエチルホスホリル、フェニルジクロロホスフェートおよびイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ−試薬）、Ｎ，Ｎ’ビス［２−オキソ−３−オキサゾリジニル］ホスホロジアミド酸塩化物（N,N' bis[2-oxo-3-oxazolidinyl]phosphorodiamidic chloride）（ＢＯＢ Ｃｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを包含する。カップリング反応は、所望により、数段階または短縮した工程であってもよい。

典型的なカップリング反応は、一般に、不活性溶媒、好ましくは、非プロトン性溶媒中、約−２０℃〜約５０℃で約１〜約４８時間、任意で第３級アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピロリジン、トリエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジン、ピリジン等の存在下で行われる。適当な溶媒は、アセトニトリル、ジクロロメタン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたはクロロホルムまたはその混合物を包含する。

多段カップリング過程の一例において、二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸７をカップリング試薬と反応させて活性化中間体８（ここに、Ｑは脱離基である）を形成させ、任意でそれを単離してもよい。第２工程において、活性化中間体８を次いで、置換ヒドロキシルアミン９と反応させてアミド１０を形成させる。酸を活性化中間体に変換するカップリング試薬のさらなる例は、塩化チオニル、臭化チオニル、塩化オキサリル、酸フッ化物（ＱはＦである）を形成するシアヌル酸フッ化物、または（第３級アミン塩基の存在下で）カルボン酸の混合無水物を形成するクロロギ酸アルキル、例えば、クロロギ酸イソブチルもしくはイソプロペニルを包含する。混合無水物を調製するためのカップリング試薬の付加的な例は、塩化２，４，６−トリクロロベンゾイルである［Inanaga et al. Bull. Chem. Soc. Jpn. 52, 1989 (1979)］。カップリング反応は、一般に、不活性溶媒、好ましくは、非プロトン性溶媒中、約−２０℃〜３０℃にて、約１〜約２４時間、任意で第３級アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピロリジン、トリエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジン、ピリジン等の存在下で行われる。適当な溶媒は、アセトニトリル、ジクロロメタン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたはクロロホルムまたはその混合物を包含する。活性化中間体８のカップリングのための第２工程は、上記のとおりであり、ここに、活性化中間体は、カルボン酸の塩から調製される。第２工程において、活性化中間体が混合無水物である場合、上記の適当な溶媒中におけるアミンを、上記の適当な塩基の存在下、活性化に用いられる温度にて、該混合無水物溶液に加え、温度をゆっくりと約３０℃に調整する。活性化に用いられる温度でアミンを該溶液に加え、温度をゆっくりと約３０℃に調整する。反応時間は、約１−４８時間である。

カルボン酸を活性化中間体（任意で単離されてもよい）、例えば、活性化エステルに変換するカップリング試薬の他の例は、活性化フェノール性エステルを提供するトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルを包含する。特に、常法を用いて５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボン酸と対応するアルコールとの反応によって調製されるメチル、エチルおよびプロピルなどの単純なエステルもまた、活性化中間体として作用しうる。活性化中間体を提供するカップリング試薬、例えば、アジ化アシルは、さらに、アジ化ジフェニルホスホリルを包含する。活性化中間体を提供するカップリング試薬、例えば、シアン化アシルは、シアン化ジエチルホスホリルを包含する。

カップリング反応は、一般に、約−３０℃〜６０℃、好都合には、０℃以下で行われる。第２工程において、活性化に用いられた温度で、置換ヒドロキシルアミンを活性化中間体の溶液に加え、温度をゆっくりと約３０℃に調整する。反応時間は、約１−９６時間である。さらなるカップリング試薬は、上記のとおりである。

二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１を製造するためのアミド１０（ここに、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである）の還元は、テトラヒドロフラン、エーテルおよびトルエンなどの溶媒中、約−１０〜２５℃にて、水素化アルミニウムリチウムおよび水素化ジイソブチルアルミニウム［ＤＩＢＡＬ（Ｈ）］などの過剰量の水素化試薬を包含する還元剤を用いて行ってもよい。約０−２５℃にて、テトラヒドロフラン中における水素化アルミニウムリチウムの使用が好ましい。特に好ましい方法は、還元剤が水素化アルミニウムリチウム［アミド１モルにつき０．５モル］であり、反応溶媒がテトラヒドロフランであると記載される。反応温度は、約１８時間、約０−５℃に維持される。反応混合物の水でのクエンチングで生じる副産物、アルコール１２の量を減少させるために、反応混合物をテトラヒドロフランおよび水の溶液に加えることによって、反応混合物を優先的にクエンチする。ジクロロメタンを用いる酸抽出が好ましい。特に好ましくは、水溶性重亜硫酸ナトリウム複合体を介する二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１の精製であり、それは、特に、残留アルコール１２を効果的に除去する。

スキームＩＩにさらに記載されるように、二環式ヘテロアリールペネム−２−カルボン酸１６保護酸またはその医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩［式中、ＡおよびＢのうち一方は水素を示し、他方は基

（式中、ＸおよびＹは上記のとおりである）
を示す］は、スキームＩに記載のように調製された二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１をルイス酸、好ましくは、無水ハロゲン化（ＢｒまたはＣｌ）マグネシウム、より好ましくは、無水ＭｇＢｒ_２またはＭｇＢｒ_２：エーテル化合物および弱塩基、例えば、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、またはジイソプロピルエチルアミンの存在下、低温、好ましくは、約−２０℃〜−４０℃にて、保護酸を有する６−ブロモ−ペネム１３（式中、Ｒ_６は、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルおよび−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステル、または付加的に、ベンジルもしくはｐ−ニトロベンジル保護基である）と縮合して、アルドール１４を得、それを酸塩化物または無水物を用いて、好ましくは、アセタート、トリフラートまたはトシラートに官能基化するか、または任意で、適当な有機溶媒、好ましくは、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、室温にて、テトラハロメタンおよびトリフェニルホスフィンとの反応によってハロゲン誘導体に変換することができ、それにより、中間体１５を得ることによって調製できる。アルドール１４と酸塩化物または無水物（Ｒ_４）Ｃｌまたは（Ｒ_４）Ｏ、あるいはテトラハロメタンＣ（Ｘ_１）_４およびトリフェニルホスフィンとの反応により、中間体化合物１５（ここに、Ｒ_４はアルキルＳＯ_２、アルキルＣＯまたはアリールＣＯであり；Ｘ_１はＢｒ、ＩまたはＣｌであり；ＡおよびＲは上記のとおりであり；Ｒ_６はＸ_１またはＯＲ_４である）が形成される。中間体１５は、活性化亜鉛などの金属および穏やかな温度、好ましくは約２０℃〜３５℃にて約ｐＨ６．５〜８．０のリン酸バッファーを用いる還元的脱離過程によって、または触媒、好ましくは、炭上のパラジウムによる水素化によって、所望の二環式−ヘテロアリール−ペネム−２−カルボン酸１６保護酸、またはその医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩に変換することができる。還元的脱離工程は、カルボキシル基の脱保護が起こるように行うことができることに注目すべきである。カルボン酸酸素上の保護基がパラ−ニトロベンジル置換基である場合、還元的脱離および脱保護は、一段階で達成できる。しかしながら、保護基がパラ−ニトロベンジル置換基以外である場合、保護基の性質にもよるが、２段階手法を行うことができる。生成物は、遊離酸または医薬上許容される塩として、好ましくは、アルカリ金属塩として単離できる。上記の２段階手法は、中間体１５を単離することなく全過程を実施することによって、一段階で行うことができる。さらに、遊離酸またはアルカリ金属塩は、Ｒ_６がＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルまたは−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６であるエステルに変換してもよい。

該開示において、多くの用語を使用し、下記の定義を提供する。

本明細書中で使用する場合、アリールは、６−１２個の炭素原子からなる芳香族炭化水素基をいう。
本明細書中で使用する場合、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルなる語は、５〜６個の炭素原子を有する単環式飽和環をいう。例示的なシクロアルキル環は、シクロペンチルまたはシクロヘキシルを包含する。

本明細書中で使用する場合、「水性溶媒」なる語は、水を意味する。

本明細書中で使用する場合、「反応させる」なる語は、実施したい化学反応を引き起こすような条件下に、化学反応体を一緒に付すことを示すことが意図される。

「脱離基」なる語は、一般に、アミンなどの求核分子によって容易に置き換わることのできる基をいう。かかる脱離基は、当該分野で周知である。かかる脱離基の例は、限定するものではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、フッ素、塩素、臭素、１，１’−カルボニルジイミダゾールなどを包含する。

本明細書中で使用する場合、「接触させる」なる語は、酵素反応を起こさせるように、加水分解酵素の存在下、水性媒体中にエステル反応体を共存させることを意図する。

本明細書中で使用する場合、「加水分解可能なエステル」なる語は、本明細書中に記載される加水分解酵素で加水分解することのできるカルボン酸を保護するために慣用的に使用されるいずれかのエステルを示す。

本明細書中で使用する場合、有効な加水分解酵素なる語は、エステル反応体またはエステル反応体の混合物から検出可能な量のカルボン酸生成物を生成することのできる酵素を意味する。有効な加水分解酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼまたはプロテアーゼからなる群から選択される。特定の例は、カンジダ・アンタークティカ（C. antarctica）リパーゼＢ、アスペルギルス アシラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）プロテアーゼＭ、カンジダ・ルゴサ（C.rugosa）リパーゼ、およびシュードモナス（Pseudomonas）属由来のリパーゼを包含する。

本明細書中で使用する場合、有効量の有効な加水分解酵素なる語は、エステル基質から検出可能な量の酸生成物を生じることのできる酵素の量を意味する。一般に、有効量とは、約３ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、約６ｍｇ／ｍｌである。

本明細書中で使用する場合、酵素反応に有効なｐＨ範囲は、所定の酵素がエステル基質に対して触媒活性を示すｐＨである。ｐＨ範囲は、使用される特定の酵素によって変化し、使用される特定の酵素に依存する。例えば、リパーゼの場合、有効なｐＨ範囲は、約５．０〜１０．０である。同様に、プロテアーゼの場合、有効なｐＨ範囲は、約ｐＨ４．０〜１０．０であり、アシラーゼの場合、有効なｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜１０．０である。好ましいｐＨ範囲は、約６．５〜約７．８である。また、約７．２〜約７．５のｐＨ範囲も好ましい。より好ましくは、約ｐＨ７．０である。

本明細書中で使用する場合、酵素反応の有効温度は、所定の酵素が所定の基質に対して活性を示す温度である。例えば、該温度は一般に、使用される酵素にもよるが、約２０℃〜約６５℃である。好ましくは、有効温度は、約３７℃である。

本明細書中で使用する場合、酵素選択的なる語は、１の官能基（例えば、エステル基）が分子上の異なる位置を置換することができ（位置異性体）、該位置のうち１つのみにおいて反応が選択的におこる反応をいう。

本明細書中で使用する場合、酵素加水分解に有効な時間は、約９〜７２時間である。

本明細書中で使用する場合、本発明の製法によって調製される基本的な化合物の医薬上許容される塩は、乳酸、クエン酸、酢酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸および同様に既知の許容される酸などの有機および無機酸から誘導される塩である。カルボキシル基が存在する場合、本発明の製法によって調製される化合物の塩は、アルカリ金属（Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ）またはアルカリ土類金属（ＣａまたはＭｇ）などの塩基と形成されてもよい。

本明細書中で使用する場合、無機酸は、硫酸、塩酸などを意味する。

本発明は、ここに、例示として提供され、本発明を限定するものではない下記の実施例において、より詳細に記載される。

実験方法：
一般的な酵素条件
エステル、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルの混合物を酵素活性をスクリーニングするために、１ｍｌ反応器中で試験し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって反応を分析する。典型的には、基質濃度は、５〜１０ｍｇの酵素、または液体ならば、１０μｌの酵素を含有する０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ７．２５中、１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。反応物は、３７℃で一晩インキュベートする。エステルが加水分解されると、反応液の開始ｐＨが約６．０に低下することによって示される。ＨＰＬＣ条件：試料は、Ｗａｔｅｒｓ^ＴＭ（登録商標）Ｓｙｍｍｅｔｒｙ^ＴＭＣ１８カラム３．５ｍ（４．６ｘ７５ｍｍ）を用い、下記の溶媒勾配を用いるＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＴ：２７９５）で分析する。溶媒Ａ：５％アセトニトリル、水中における１０ｍＭ酢酸アンモニウム；溶媒Ｂ：８０％アセトニトリル、水中における１０ｍＭ酢酸アンモニウム。勾配条件は、９０％Ａ：１０％Ｂ〜６０％Ａ：４０％Ｂを１０分；１００％Ｂを１５分；１００％Ｂで２０分まで続け、９０％Ａ：１０％Ｂに切り替える。化合物は、２１５または２２６ｎｍで検出した。流速は、１ｍＬ／分であった。試験された種々の酵素を表１に挙げる。試験した酵素のうち、アスペルギルス属由来のアシラーゼならびにシュードモナス属およびカンジダ・アンタークティカ（Candida. antarctica）由来のリパーゼは、所望のエステルの選択的加水分解を示し、所望の酸異性体を生成した。ブタカンゾウ由来のエステラーゼは、両異性体の非選択的加水分解を示した。

実施例１
真菌アシラーゼを用いるエステル加水分解
Ｎ−アセチルアミノ酸誘導体を対応するアミノ酸に加水分解するアシラーゼを、エステル基質混合物に対して試験する。反応混合物は、約８．５ｍｇアシラーゼ（約２５５アシラーゼ単位）、１ｍｌリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０中における０．１５ｍＭ塩化コバルトを含有する。これに、約１０ｍｇの基質エステル混合物を加え、３７℃でインキュベートする。酵素反応の進行は、ＨＰＬＣで少量の試料を分析することによってモニターする。所望のエステル異性体５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルが酵素により加水分解され、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルは、加水分解されない。

実施例２
シュードモナス属由来のリパーゼを用いる加水分解
上記の一般的な酵素条件に基づいて、１．５０ｇの混合エステル、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルを、バッファー中における基質の一様な分布のために０．５ｍｌアセトニトリルを加えた５０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ７．２５中、約１００ｍｇのシュードモナス属リパーゼ（Ｌ−６）で加水分解する。反応は、３７℃で混合する。酵素加水分解後に放出される酸は、反応ｐＨを低下させる。定期的に反応物のｐＨをチェックし、もし、それが７．０以下ならば、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを約７．３０にする。かくして、ｐＨは、７．０より高く維持される。７２時間インキュベーション後、ＨＰＬＣ分析に基づき、所望のエステル加水分解が約７０％に達した。酵素反応物を０．２μ膜でろ過して、不溶物質を粗酵素調製物から除去する。透明の酵素反応混合物をｐＨ７．０にて、酢酸エチル（１：１）で２回抽出し、それにより、全ての残留エステルを除去し、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸のみが水相に残留する。酸生成物を含有する水相を凍結乾燥し、回収した固体をメタノール中に溶解する。メタノール中に溶解しなかった塩を分離し、廃棄する。５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボン酸を含有するメタノール（薄黄色）を蒸発させ、約０．５ｇの５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸を回収する。ＬＣ−ＭＳおよびＮＭＲデータは一致し、所望の酸のみが異性体純度１００％で存在することを示した。ＨＰＬＣによる酸純度は、９７％を越える。ＨＰＬＣ条件は、Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ３カラム４．６ｘ４５０ｍｍである。溶媒Ａ：水中における０．０２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。溶媒Ｂ：アセトニトリル中における０．０２％ＴＦＡ。使用される勾配は、０時間で９０％Ａおよび１０％Ｂ、２０分で、５％Ａおよび９５％Ｂに達する勾配であり、２５分まで持続する。

実施例３
リパーゼによるエステル異性体の非選択的加水分解
過剰量の加水分解酵素および低濃度の基質などのある特定の条件下、反応物の長期間のインキュベーションは、他の状態では所望のエステル異性体の非常の良好な選択的加水分解を示す同じリパーゼによって、非選択的な両エステル異性体の加水分解を導くであろう。固定化形態のカンジダ・アンタークティカ リパーゼＢの場合、かかる非選択的基質加水分解条件の例は、１ＬのバッファーｐＨ７．２５中における３７℃で６６時間の２３ｇ（１００００Ｕ／ｇ）の酵素と２．５ｇのエステル混合物とのインキュベーションである。固定化酵素調製物について、活性単位は、エステル合成単位として下記のように定義付けられる。１単位は、１分間でプロパノールおよびラウリン酸から１マイクロモルのラウリン酸プロピルエステルを合成できる酵素量である。同様に、可溶性形態のカンジダ・アンタークティカ リパーゼＢの場合、非選択的エステル基質加水分解のための条件は、１Ｌのリン酸バッファーｐＨ７．２５中における３７℃で１８時間の５ｇ酵素（〜１２００００Ｕ／ｇ）と２．５ｇのエステル混合物とのインキュベーションである。可溶性形態の酵素について、活性単位は、２５℃で１分間でトリブチリンから１マイクロモルの酪酸を遊離することのできる酵素量として定義付けられる。
上記の条件下、カンジダ・アンタークティカ リパーゼＢの２つの調製物が、両エステル異性体５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルの非選択的加水分解を示す。

実施例４
カンジダ・アンタークティカ リパーゼＢを用いるプロセス開発
ｐＨ７．２５のバッファー中において固定化カンジダ・アンタークティカ リパーゼＢおよびエステル混合物５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルを用いる実験は、該リパーゼが所望のエステル異性体を選択的に加水分解することができることを示した。典型的な酵素加水分解反応は、６ｇ／Ｌ酵素を含有し、ｐＨスタットおよび３Ｎ水酸化アンモニウムを用いるｐＨ調節下、基質エステル混合物は、１０〜１３３ｇ／Ｌの範囲であった。ｐＨが制御されない場合、酵素反応物から放出される酸がｐＨを低下させ、ｐＨ収率低下をもたらしたであろう。所望のエステル異性体の完全な加水分解を得るために、ｐＨを約７．０に維持する。

実施例５
カンジダ・アンタークティカ リパーゼＢと１３３ｇ／Ｌの混合物５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステルの反応
大規模変換のためのプロセス条件を試験するために、エステル基質混合物をその合成反応物からさらに精製することなく用いる。１０％アセトニトリルを含有する最終容量３０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中、４．０５ｇの混合物５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−２−カルボン酸エチルエステルおよび５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ（１，２−ｂ）ピラゾール−３−カルボン酸エチルエステル、および０．２ｇのリパーゼ ノボザイム（Novozym）４３５を３７℃にて、ｐＨを７．２０−７．５０に調節しながらインキュベートする。水酸化アンモニウム（３Ｎ）を用い、ｐＨを維持するためにアルカリ添加を自動調節するｐＨ−スタットを用いて、ｐＨを調節する。反応は、ｐＨ滴定装置（Brinkmann、モデル７１８ Ｔｉｔｒｉｎｏ）中において、ジャケット付きガラス容器中で準備する。水酸化アンモニウム消費が止み、もはやエステル加水分解由来の酸が形成されないことが示された後、溶媒抽出によって反応を停止する。反応混合物は、水相が透明になるまで、ほぼ中性のｐＨにて、等量（〜３０ｍｌ）の酢酸エチルで３回抽出する。酢酸エチル抽出は、残留している望ましくないエステルを他の着色物質と一緒に反応液から除去した。濃ＨＣｌを用いて、水相のｐＨを〜３．０に下げ、カルボン酸生成物が沈殿し始める。ｐＨが〜２．０に達するまで、さらにＨＣｌを添加し、攪拌を継続した。ガラス容器は、４℃で１時間インキュベートする。酸沈殿物を中サイズのろ紙（ブフナー漏斗）でろ過し、風乾する。上記の条件を用いる特定の実施例を表２に示す。

１．Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
２．１，２−ジエトキシエタン（ＤＥＥ）

化学的分析は、酸（表１のエントリー２）が９９．８％純粋（ＨＰＬＣ法）であることを示し、それは、１１％水分および０．３８７％灰分を含有した。プロトンＮＭＲ、ＬＣ−ＭＳおよびＩＲデータにより、得られた物質が酵素反応から予想された所望の酸であることを確認した。

実施例６
５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボン酸からのＮ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］−ピラゾール−２−カルボキサミドの合成

５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボン酸（３．８ｇ，２５ミリモル）を４０ｍｌのジクロロメタン中における２Ｍ塩化オキサリル中でスラリー化し、該スラリーに２、３滴のジメチルホルムアミドを加える。得られた混合物を窒素雰囲気下、１５−２２℃で１０−１２時間攪拌する。得られた酸塩化物を暗色溶液として蒸発させて、乾燥残渣を得る。該残渣をトルエン（５０ｍｌ）中に溶解し、もう１回蒸発させて、粗酸塩化物を得る。ジクロロメタン（１００ｍｌ）中における該粗酸塩化物およびＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２．７ｇ、２７．５ミリモル）の攪拌混合物に、０−５℃にて、窒素雰囲気下、温度を約０−５℃に維持しながら、ピリジン（４．７ｇ、３．２ｍｌ、６０ミリモル）を滴下する。得られた攪拌混合物を４時間かけて１５−２０℃に温め、反応完了について、ＨＰＬＣによってモニターする（Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ３ ４．６ｘ１５０ｍｍカラム、０．０２％トリフルオロ酢酸を含有する９０：１０〜１０：９０水／アセトニトリルの１０分勾配を用い、２５４ｎｍでのＵＶ検出を用いる。アミドの保持時間は１．１分であった）。混合物を水（５０ｍｌ）で洗浄し、濃縮し、クロロホルムでの溶出を用いるシリカゲルの短いカラムで精製し、揮発性物質を蒸発させて、Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］−ピラゾール−２−カルボキサミド（４．１ｇ、８６％）を薄茶色結晶性固体として得（ｍ．ｐ．４５−５０℃）、それをＮＭＲ、質量スペクトルおよび元素分析によって特徴付ける。

実施例７
５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルバルデヒド

氷／水浴中における０−５℃に冷却したＮ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボキサミド（２．５ｇ，１２．８ミリモル）のテトラヒドロフラン（３５ｍＬ）中溶液に、数回にわけて、水素化アルミニウムリチウムペレット（０．２１１ｇ，５．５３ミリモル）を７時間かけて加える。反応混合物を一晩（１６時間）で室温に温める。薄層クロマトグラフィー［ＴＬＣ：溶媒（２０：１）ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＣＨ_３ＯＨを用いるＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅシリカゲル６０Ｆ−２５４プレート；Ｒｆ０．６６（５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルバルデヒド）、０．３８（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボキサミド）］は、少量のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルボキサミドを示した。
反応混合物を氷／水浴中で０−５℃に冷却し、新たに水素化アルミニウムリチウム（６４ｍｇ，１．６８ミリモル）を加える。０−５℃でさらに３時間後、硫酸ナトリウム（１．０ｍＬ）の飽和溶液を滴下して反応をクエンチする。１５分後、灰色がかったゲルが形成され、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）および硫酸マグネシウム（２ｇ）を加える。混合物を１０分間攪拌し、次いで、ろ過する。ろ液を減圧下で濃縮して、１．６ｇの透明の無色油状物を得る。該無色油状物に、ジクロロメタン（２５ｍＬ）および１．５Ｎ塩酸（５ｍＬ）を加える。有機層を減圧下で濃縮し、オイルポンプ真空下で乾燥させて、１．３１ｇ（７７％収率）の５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルバルデヒドを白色固体として得、それは、^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）２．６７−２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．２２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．５２（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｓ，１Ｈ）を有する。

Claims (63)

1. 式
   

   

   ［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
   で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７の製法であって、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６
   

   

   ［式中、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである］
   を酵素的加水分解して式
   

   

   ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
   で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を製造し、次いで、該二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離することを特徴とする製法。
2. 式
   

   

   ［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
   で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物中において二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６を酵素的加水分解して、選択的に、式
   

   

   ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
   で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を製造することを特徴とする二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７
   

   

   ［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
   の製法であって、
   ａ）二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物（ここに、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである）を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の有効な加水分解酵素と接触させ；
   ｂ）塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
   ｃ）有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
   ｄ）水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；
   ｅ）式
   

   

   ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
   で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７をカルボン酸として、またはその医薬上許容される塩として単離する工程を含む製法。
3. 有効な加水分解酵素が、リパーゼ、アシラーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される請求項２記載の製法。
4. 有効な加水分解酵素がカンジダ・アンタークティカ リパーゼＢ、アスペルギルス アシラーゼ、アスペルギルス・オリゼ プロテアーゼＭ、カンジダ・ルゴサ リパーゼ、およびシュードモナス属由来のリパーゼから選択される請求項３記載の製法。
5. 有効な加水分解酵素の有効量が約３ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である請求項２記載の製法。
6. 有効な加水分解酵素の有効量が約６ｍｇ／ｍｌである請求項５記載の製法。
7. さらに、約２０〜６５℃の有効温度を特徴とする請求項２記載の製法。
8. 有効温度が約３７℃である請求項７記載の製法。
9. 有効なｐＨ範囲が約４．０〜約１０．０である請求項２記載の製法。
10. 塩基の添加によって、反応の有効ｐＨを約６．５〜７．８に維持する請求項９記載の製法。
11. 塩基の添加によって、反応の有効ｐＨを約７．０に維持する請求項１０記載の製法。
12. 任意のバッファーがリン酸塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーから選択される請求項２記載の製法。
13. バッファーがＴｒｉｓ−ＨＣｌである請求項１２記載の製法。
14. 任意の共溶媒がアセトニトリルまたはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから選択される請求項２記載の製法。
15. 共溶媒がアセトニトリルである請求項１４記載の製法。
16. 共溶媒アセトニトリルが約１０％濃度で存在する請求項１５記載の製法。
17. 塩基が水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムから選択される請求項１１記載の製法。
18. 塩酸を用いてｐＨを約２．０〜約３．０に調整する請求項２記載の製法。
19. 有効時間が約９〜７２時間である請求項２記載の製法。
20. 式
    

    

    ［式中、
    Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
    ｎは１または２であり；
    ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
    Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
    但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
    で示される二環式ヘテロアリールカボキサルデヒド１１の製法であって、
    ａ．式
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるアミノ酸１をニトロソ化試薬でニトロソ化して式２
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるニトロソ化合物を形成させ；
    ｂ．ニトロソ化合物２と脱水剤とを反応させ、無機塩基で中和して式３
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるイリドを形成させ；
    ｃ．式３のイリドと式４
    

    

    ［式中、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである］
    で示されるプロピオール酸エステルとを非プロトン性溶媒中で反応させて、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物
    

    

    ［式中、Ｘ、ＹおよびＲ_１は上記のとおりである］
    を形成させ；
    ｄ．二環式−ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物（ここに、Ｘ、ＹおよびＲ_１は上記のとおりである）を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；
    ｅ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
    ｆ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
    ｇ．水性溶媒を分離し、任意で、無機酸によってｐＨを少なくとも約２．０〜約３．０に調整し；
    ｈ．式
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離し；
    ｉ．該二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７（ここに、ＸおよびＹは上記のとおりである）またはその塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８
    

    

    ［式中、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基であり、Ｘ、ＹおよびＱは上記のとおりである］
    を形成させ；
    ｊ．活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０
    

    

    ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
    で示されるアミドを提供し；
    ｋ．式１０のアミドを還元剤で還元して、二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    を提供し、次いで、二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１を単離する工程を含む製法。
21. ニトロソ化試薬が塩酸中の亜硝酸ナトリウムである請求項２０記載の製法。
22. Ｒ_１がメチルまたはエチルである請求項２０記載の製法。
23. 脱水剤が無水トリフルオロ酢酸である請求項２０記載の製法。
24. 非プロトン性溶媒が約１００−１６５℃でのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、クロロベンゼンまたは１，２−ジエトキシエタンである請求項２０記載の製法。
25. 非プロトン性溶媒が約１２０−１２５℃の１，２−ジエトキシエタンまたはクロロベンゼンであり、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物を約１：１．５〜約１：２．５の比率で形成する請求項２４記載の製法。
26. 酸ハロゲン化物試薬がＳＯ_２Ｑ_２またはＱＣＯＣＯＱであり、ここに、Ｑがクロロまたはブロモである請求項２０記載の製法。
27. 酸ハロゲン化物試薬が臭化チオニル、塩化チオニルおよび塩化オキサリルから選択される請求項２６記載の製法。
28. 酸ハロゲン化物試薬が塩化オキサリルである請求項２７記載の製法。
29. カップリング試薬が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＥＣ／ＨＢＴ）、カルボニルジイミダゾール、カルボニルジイミダゾール／ヒドロキシベンゾトリアゾール ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＨＢＴ、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物、塩化ジフェニルホスフィニル（ＤＰＰＣｌ）、無水プロパンホスホン酸（プロパンホスホン酸無水物，ＰＡＡ）、シアン化ジエチルホスホリル、フェニルジクロロホスフェートおよびイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ−試薬）、Ｎ，Ｎ’ビス［２−オキソ−３−オキサゾリジニル］ホスホロジアミド酸塩化物（ＢＯＢ Ｃｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、塩化チオニル、臭化チオニル、塩化オキサリル、シアヌル酸フッ化物、クロロギ酸イソブチル、クロロギ酸イソプロペニル、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル、アジ化ジフェニルホスホリル、およびシアン化ジエチルホスホリルから選択される請求項２０記載の製法。
30. 有機塩基がトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびピリジンから選択される請求項２０記載の製法。
31. 置換ヒドロキシルアミンをショッテン−バウマン条件下で反応させる請求項２０記載の製法。
32. 還元剤が水素化物試薬である請求項２０記載の製法。
33. 水素化物試薬が水素化アルミニウムリチウムおよび水素化ジイソブチルアルミニウム ［ＤＩＢＡＬ（Ｈ）］から選択される請求項３２記載の製法。
34. Ｘが−ＣＨ_２−である請求項２０記載の製法。
35. 請求項２０記載の製法によって調製された化合物５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルバルデヒド。
36. 有効時間が約９−７２時間である請求項２０記載の製法。
37. 二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１
    

    

    ［式中、
    Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
    ｎは１または２であり；
    ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
    Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
    但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
    の製法であって、
    ａ．二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物
    

    

    ［式中、Ｘ、ＹおよびＲ_１は上記のとおりである］
    を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と反応させ；
    ｂ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
    ｃ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
    ｄ．水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；
    ｅ．式
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離し；
    ｆ．二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８
    

    

    ［式中、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基であり、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    を形成させ；
    ｇ．活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０
    

    

    ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
    で示されるアミドを提供し；
    ｈ．式１０のアミドを還元剤で還元して、式１１
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを提供し、次いで、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを単離する工程を含む製法。
38. 酸ハロゲン化物試薬がＳＯ_２Ｑ_２またはＱＣＯＣＯＱであり、ここに、Ｑがクロロまたはブロモである請求項３７記載の製法。
39. 酸ハロゲン化物試薬が臭化チオニル、塩化チオニル、および塩化オキサリルから選択される請求項３８記載の製法。
40. 酸ハロゲン化物試薬が塩化オキサリルである請求項３９記載の製法。
41. カップリング試薬が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＥＣ／ＨＢＴ）、カルボニルジイミダゾール、カルボニルジイミダゾール／ヒドロキシベンゾトリアゾール ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＨＢＴ、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物、塩化ジフェニルホスフィニル（ＤＰＰＣｌ）、無水プロパンホスホン酸（プロパンホスホン酸無水物，ＰＡＡ）、シアン化ジエチルホスホリル、フェニルジクロロホスフェートおよびイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ−試薬）、Ｎ，Ｎ’ビス［２−オキソ−３−オキサゾリジニル］ホスホロジアミド酸塩化物（ＢＯＢ Ｃｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、塩化チオニル、臭化チオニル、塩化オキサリル、シアヌル酸フッ化物、クロロギ酸イソブチル、クロロギ酸イソプロペニル、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル、アジ化ジフェニルホスホリル、およびシアン化ジエチルホスホリルから選択される請求項３７記載の製法。
42. 有機塩基がトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびピリジンから選択される請求項３７記載の製法。
43. 置換ヒドロキシルアミンをショッテン−バウマン条件下で反応させる請求項３７記載の製法。
44. 還元剤が水素化物試薬である請求項３７記載の製法。
45. 水素化物試薬が水素化アルミニウムリチウムおよび水素化ジイソブチルアルミニウム［ＤＩＢＡＬ（Ｈ）］から選択される請求項４４記載の製法。
46. Ｘが−ＣＨ_２−である請求項３７記載の製法。
47. 請求項３７記載の製法によって調製された化合物５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−２−カルバルデヒド。
48. 有効時間が約９〜７２時間である請求項３７記載の製法。
49. 式
    

    

    ［式中、
    ＡおよびＢのうち１つは水素を示し、他方は、基
    

    

    を示し；
    Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；
    ｎは１または２であり；
    ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；
    Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；
    但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２であり；
    Ｒ_３は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルであり；
    Ｒ_６は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキル、−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステル、または医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩である］
    で示される二環式ヘテロアリールペネム−２−カルボン酸１６保護酸、医薬上許容される塩、または好ましくはアルカリ金属塩の製法であって、
    ａ．式
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるアミノ酸１をニトロソ化試薬でニトロソ化して、式２
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるニトロソ化合物を形成させ；
    ｂ．ニトロソ化合物２を脱水剤と反応させ、無機塩基で中和して、式３
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示されるイリドを形成させ；
    ｃ．式３のイリドと式４
    

    

    ［式中、Ｒ_１は、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである］
    で示されるプロピオール酸エステルとを非プロトン性溶媒中で反応させて、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物
    

    

    ［式中、Ｘ、ＹおよびＲ_１は上記のとおりである］
    を形成させ；
    ｄ．二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５および二環式−ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の混合物を水性溶媒中、有効なｐＨ範囲にて、有効な時間、任意でバッファー中、および任意で共溶媒の存在下、有効量の加水分解酵素と接触させ；
    ｅ．塩基の添加によって、ｐＨを約６．５〜約７．８に維持し；
    ｆ．有機溶媒抽出によって、二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５を除去し；
    ｇ．水性溶媒を分離し、任意でｐＨを約２．０〜約３．０に調整し；
    ｈ．式
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を単離し；
    ｉ．該二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその塩を酸ハロゲン化物試薬またはカップリング試薬と反応させて、活性化中間体８
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりであり、Ｑはカップリング試薬または酸ハロゲン化物試薬から形成された脱離基である］
    を形成させ；
    活性化中間体８または二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は、独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示される置換ヒドロキシルアミンと、有機塩基の存在下で反応させて、式１０
    

    

    ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
    で示されるアミドを提供し；
    ｊ．式１０のアミドを還元剤で還元して、式１１
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを提供し；
    ｋ．二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒド１１を式
    

    

    ［式中、Ｒ_６は保護酸を有し、ここに、Ｒ_６は、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルおよび−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステルまたはさらにベンジルもしくはｐ−ニトロベンジル保護基である］
    で示されるブロモ−ペネム１３と、ルイス酸、エーテル化合物および弱塩基の存在下で縮合して、式
    

    

    ［式中、Ｘ、ＹおよびＲ_６は上記のとおりである］
    で示されるアルドール１４を形成させ；
    ｌ．アルドール１４を酸塩化物または無水物、（Ｒ_４）Ｃｌまたは（Ｒ_４）_２Ｏあるいはテトラハロメタン、Ｃ（Ｘ_１）_４、およびトリフェニルホスフィンと反応させて、中間体化合物１５
    

    

    ［式中、Ｒ_４は、アルキルＳＯ_２、アリールＳＯ_２、アルキルＣＯ、またはアリールＣＯであり；Ｘ_１は、Ｂｒ、ＩまたはＣｌであり；Ｘ、ＹおよびＲ_６は、上記のとおりであり；Ｒ_５は、Ｘ_１またはＯＲ_４である］
    を形成させ；
    ｍ．中間体化合物１５を還元的脱離過程によって、二環式−ヘテロアリール−ペネム−２−カルボン酸１６
    

    

    ［式中、Ｒ_６はＨであり、ＡおよびＢは上記のとおりである］
    に変換し、また、式中、Ｒ_６がＣ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキルまたは−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６であるエステル、医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩に変換してもよく、次いで、該二環式ヘテロアリール−ペネム−２−カルボン酸１６を単離する工程を含む製法。
50. ルイス酸が無水ハロゲン化マグネシウムである請求項４９記載の製法。
51. ルイス酸が無水ＭｇＢｒ_２である請求項５０記載の製法。
52. 弱塩基がトリエチルアミン、ＤＭＡＰまたはジイソプロピルエチルアミンである請求項４９記載の製法。
53. 低温が約−２０℃〜約−４０℃である請求項４９記載の製法。
54. 中間体化合物１５がアセタート、トリフラートまたはトシラートである請求項４９記載の製法。
55. 中間体化合物１５が単離されない請求項４９記載の製法。
56. 還元的脱離過程が活性化亜鉛および約ｐＨ６．５〜８．０のリン酸バッファーを用いて行われるか、または触媒で水素化して行われる請求項４９記載の製法。
57. 触媒が炭上のパラジウムである請求項５６記載の製法。
58. 還元的脱離過程が約２０℃〜３５℃である請求項４９記載の製法。
59. 式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドが水溶性重亜硫酸ナトリウム複合体として精製される請求項４９記載の製法。
60. 式７
    

    

    ［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；Ｘは−ＮＲ、Ｏ、Ｓまたは−ＣＨ_２−であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸の製法であって、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６（ここに、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである）の酵素加水分解、または式
    

    

    ［式中、Ｘ、ＹおよびＲは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６および二環式ヘテロアリール−３−カルボン酸エステル５の混合物中における二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸エステル６の選択的酵素加水分解により、式７
    

    

    ［式中、ＸおよびＹは上記のとおりである］
    で示される二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７を製造することを特徴とする製法。
61. 式１１
    

    

    ［式中：Ｙは（ＣＨ_２）_ｎであり；ｎは１または２であり；ＸはＮＲ、Ｏ、ＳまたはＣＨ_２であり；Ｒは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、またはアリールアルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）であり；但し、ＸがＮＲまたはＯである場合、ｎは２である］
    で示される二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドの製法であって、請求項６０記載の製法にしたがって式７の化合物を調製し、次いで、式７の二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸を式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドに変換することを特徴とする製法。
62. 式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドが、二環式ヘテロアリール−２−カルボン酸７またはその反応性誘導体を式Ｒ_３ＮＨＯＲ_２ ９（式中、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、１〜６個の炭素原子からなるアルキルである）で示されるアミンまたはその反応性誘導体と反応させて式１０
    

    

    ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ_２およびＲ_３は上記のとおりである］
    で示されるアミドを提供し、次いで、式１０のアミドを還元剤で還元することによって調製される請求項６１記載の製法。
63. 式
    

    

    ［式中、ＡおよびＢのうち１つは水素を示し、他方は、基
    

    

    （式中、ＸおよびＹは、請求項６１に記載のとおりである）
    を示し；
    Ｒ_６は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_５−Ｃ_６シクロアルキル、−ＣＨＲ_３ＯＣＯＣ_１−Ｃ_６からなる群から選択されるイン・ビボで加水分解可能なエステル、ベンジルまたはｐ−ニトロベンジル保護基、または医薬上許容される塩、好ましくはアルカリ金属塩である］
    で示される二環式ヘテロアリールペネム−２−カルボン酸１６保護酸、医薬上許容される塩または好ましくは、アルカリ金属塩の製法であって、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを請求項６１または６２に記載の製法によって調製し、次いで、式１１の二環式ヘテロアリールカルボキサルデヒドを式１６の化合物に変換することを特徴とする製法。