JP6654635B2 - 新規なシストバクタミド - Google Patents

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Description

シストバクタミド（Cystobactamide）は、粘液細菌の一種であるシストバクター・ヴェラタス（ＭＣｙ８０７１；内部名：シストバクター・フェルギネウス）から単離された新規な天然の生成物である。シストバクタミドは、特に選択されたグラム陰性菌（例えば、大腸菌、緑膿菌、およびアシネトバクター・バウマニ（A. baumannii）など）に対して優れた抗生物質活性を示し、またグラム陽性菌に対しても広いスペクトル活性を示す。
本発明は、式（Ｉ）の化合物、前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物、あるいは医薬的に許容される製剤を提供する。
（Ｉ）

（式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルで表される基であり、
Ｒ２は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルで表される基であり、
Ｒ３は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルで表される基であり、
Ｒ４は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルで表される基であり、
Ｒ５は、水素原子、または下記式で表される基であり、

または

ここで、Ｒ６はＯＨまたはＮＨ２である。
用語「Ｃ１−６アルキル」は、炭素数１〜６の飽和直鎖炭化水素基または飽和分岐炭化水素基を指す。用語「Ｃ１−４アルキル」は、炭素数１〜４の飽和直鎖炭化水素基または飽和分岐炭化水素基を指す。例えば、メチル（Ｍｅ）基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチル基である。
式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基であり、
Ｒ２は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基であり、
Ｒ３は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基であり、
Ｒ４は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基であり、
Ｒ５は下記式で表される基であり、

または

ここでＲ６はＯＨまたはＮＨ２である、
式（Ｉ）の化合物、あるいは前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物、もしくは医薬的に許容される製剤が好ましい。
好ましくは、Ｒ１がＯＨである式（Ｉ）の化合物である。
また、好ましくは、Ｒ１が式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基、特にＲ１が式−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）２で表される基である式（Ｉ）の化合物である。
さらに好ましくは、Ｒ２が水素である式（Ｉ）の化合物である。
また、好ましくは、Ｒ２がＯＨである式（Ｉ）の化合物である。
さらに好ましくは、Ｒ３が水素である式（Ｉ）の化合物である。
また、好ましくは、Ｒ３がＯＨである式（Ｉ）の化合物である。
さらに好ましくは、Ｒ３が式−Ｏ−Ｃ１−４アルキルで表される基である式（Ｉ）の化合物である。
また、好ましくは、Ｒ４が水素である式（Ｉ）の化合物である。
さらに好ましくは、Ｒ４がＯＨである式（Ｉ）の化合物である。
特に好ましくは、Ｒ５が下記式で表される基である式（Ｉ）の化合物である。

ここで、Ｒ６は、ＯＨまたはＮＨ２である。
また、特に好ましくは、Ｒ５が下記式で表される基である式（Ｉ）の化合物である。

ここで、Ｒ６は、ＯＨまたはＮＨ２である。
特に好ましくは、式（ＩＩ）の化合物、あるいは前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物、もしくはその医薬的に許容される製剤である。
（ＩＩ）

ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５は、上記式（Ｉ）の化合物で定義されたものと同様である。
また、特に好ましくは、式（ＩＩＩ）の化合物、あるいは前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物、もしくはその医薬的に許容される製剤である。
（ＩＩＩ）

ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は上記式（Ｉ）の化合物で定義されたものと同様である。
また、特に好ましくは、式（ＩＶ）の化合物、あるいは前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物、もしくはその医薬的に許容される製剤である。
（ＩＶ）

ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、上記式（Ｉ）の化合物で定義されたものと同様である。
最も好ましくは、以下の化合物である。

















特に好ましい態様によれば、本明細書で記載する本発明の化合物は、Ｒ５基で以下の立体化学を示す。

または

ここで、Ｒ６は、ＯＨまたはＮＨ２である。
好ましくは、以下の化合物は本願の範囲から除外される。




さらに好ましい態様によれば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は同時に水素ではない。
また、好ましくは、以下の化合物は本願の範囲から除外される。
さらに、本発明は、任意で１種以上の担体物質および／または１種以上のアジュバントと組み合わせて、本明細書で記載する１種以上の化合物あるいはその医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物を含む医薬品組成物を提供する。
さらにまた、本発明は、特に大腸菌、緑膿菌、Ａ．バウマニ、他のグラム陰性菌、およびグラム陽性菌によって引き起こされるバクテリア感染の治療および／または予防に用いられる、本明細書で記載する化合物または医薬品組成物を提供する。
また、好ましくは、本発明は、特に緑膿菌および他のグラム陰性菌によって引き起こされるバクテリア感染の治療および／または予防に用いられる化合物を提供する。
さらに、本発明の目的は、特に選択されたグラム陰性菌およびグラム陽性菌によって引き起こされるバクテリア感染の治療および／または予防のための薬剤を調製するための本明細書で記載する化合物または本明細書で規定する医薬品組成物を提供することである。
メトキシアスパラギン（またはアスパラギン酸塩）の断片を含むシストバクタミドでは、その質量スペクトルにおいて４１３（４１４）フラグメントイオンを示す。 イソアミノ酸を含むシストバクタミドでは、メトキシアスパラギン（アスパラギン酸塩）が存在しても、この４１３（４１４）フラグメントイオンを示さない。
十分に塩基性である化合物の薬理学的に許容される塩としては、例えば、生理学的に許容される鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸など）の塩、または有機酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、乳酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、およびサリチル酸など）の塩である。さらに、十分に酸性である化合物は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、またはマグネシウム塩）、アンモニウム塩、または有機塩基塩（例えば、メチルアミン塩、ジメチルアミン塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、エチレンジアミン塩、エタノールアミン塩、水酸化コリン塩、メグルミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン塩、リシン塩またはアルギニン塩）を形成してもよい。これらはすべて、本明細書で記載する化合物の塩のさらなる例でもある。本明細書で記載する化合物は、溶媒和物、特に水和物であってもよい。水和（hydratization／hydration）は、生成過程で起こってもよいし、あるいは初めは水を含まない化合物の吸湿性の結果として、起こってもよい。これら溶媒和物および／または水和物は、例えば、固体または液体として存在してもよい。
本明細書で記載する化合物、その薬理学的に許容される塩、溶媒和物、および水和物を治療での使用することもまた、それらそれぞれの製剤および医薬品組成物に加えて、本発明の範囲内である。
本発明による医薬品組成物は、少なくとも１種の本明細書で記載する化合物、および任意で１種以上の担体物質および／またはアジュバントを含む。
上述のように、本明細書で記載する化合物、その溶媒和物、塩、または製剤を含む治療に有用な薬剤もまた、本発明の範囲に含まれる。一般に、本明細書で記載する化合物は、当該分野で知られておりかつ許容される方法単独で、または任意の他の治療薬と組み合わせて投与される。
経口投与の場合、このような治療に有用な薬剤は以下の経路のうちの１つにより投与してもよい：経口投与（例えば、錠剤、糖衣錠、被覆錠剤、丸薬、半固体、ソフトカプセルおよびハードカプセル（例えば、ソフトゼラチンカプセルおよびハードゼラチンカプセル）、水性溶液、油性溶液、乳液、懸濁液、またはシロップ）、非経口投与（静脈内投与、筋肉内注射、および皮下注射を含む）（例えば、注射可能な溶液または懸濁液）、直腸投与（例えば、坐薬）、吸入または送気（例えば、粉末製剤、マイクロ結晶、液状エアロゾルなどのスプレーとして）、経皮投与（例えば、薬効成分を含む絆創膏などの経皮送達システム（ＴＤＳ）を介して、または経鼻内投与）。丸薬、半固体、被覆錠剤、糖衣錠、およびハード（例えば、ゼラチン）カプセルなどの錠剤の製造では、治療に有用な生成物は、薬学的に不活性な無機または有機賦形剤と混合してもよく、その例としては、ラクトース、スクロース、グルコース、ゼラチン、麦芽、シリカゲル、澱粉またはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩、乾燥スキムミルクなどが挙げられる。ソフトカプセルの製造では、例えば、植物油、石油、動物油、合成油、ワックス、脂肪、およびポリオールなどの賦形剤を用いてもよい。溶液、乳液または懸濁液、あるいはシロップの製造では、例えば、水、アルコール、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、ポリオール、グリセリン、脂質、リン脂質、シクロデキストリン、植物油、石油、動物油または合成油などの賦形剤を用いてもよい。脂質が特に好ましく、リン脂質（天然由来のものが好ましい、粒径が３００〜３５０ｎｍのものが特に好ましい）の、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７〜８、好ましくは７．４）溶液がより好ましい。坐薬では、例えば、植物油、石油、動物油または合成油、ワックス、脂肪、およびポリオールなどの賦形剤を用いてもよい。エアロゾル製剤では、この目的に適した圧縮ガス（例えば、酸素、窒素、および二酸化炭素）を用いてもよい。これらの薬学的に有用な薬剤はまた、保存や安定化のための添加剤（例えば、ＵＶ安定化剤、乳化剤、甘味料、芳香剤、浸透圧を変化させる塩、緩衝液、コーティング添加剤、および酸化防止剤など）を用いてもよい。
一般に、体重が約８０ｋｇの成人に経口投与または非経口投与を行う場合、１日の投与量は、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ〜約１，０００ｍｇが適切であるが、必要に応じてこの上限を超えてもよい。１日の投与量は、単回投与量または分割投与量として投与してもよく、非経口投与の場合は連続注入または皮下注射として投与してもよい。
本発明の化合物は、発酵（例えば、系統種MCy8071 DSM27004の発酵）により調製しても、あるいは当業者に周知の手順を用いた化学合成応により調製してもよい。
本発明の化合物は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００１９２５（ＷＯ２０１５／００３８１６）、特に８７ページから１３８ページに記載された手順（参照により本明細書に組み込まれる）により合成してもよい。
例えば、本発明の化合物は以下の手順により調製してもよい。
１．発酵
生成条件
生成のための系統種
系統種シストバクター・ヴェラタスＭＣｙ８０７１は、ミクソコッカス目（粘液細菌）、シストバクター亜目、シストバクター科、シストバクター属に属する。16S rRNA遺伝子配列の部分を公共データベース（国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information, NCBI)によって提供されるBasic Local Alignment Search Tool, BLAST）の配列と比較したところ、シストバクター・ヴェラタス系統種ＤＳＭ１４７１８との１００％の類似性を示した。
ＭＣｙ８０７１は、Helmholtz Centre for Infection Research (HZI, 前GBF)で、１９８２年に採取された中国の土壌試料から単離された。この系統種は、２０１３年３月にブラウンシュヴァイクのGerman Collection of Microorganisms（ＤＳＭ）に記号表記ＤＳＭ２７００４として供託された。
培養
この系統種ＭＣｙ８０７１は、酵母菌−寒天（ＶＹ／２：０．５％の出芽酵母、０．１４％のＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２／ｌ、１．５％の寒天、ｐＨ：７．４）、ＣＹ寒天（カシトン（casitone）：０．３％、酵母菌抽出物：０．１％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ：０．１％、寒天：１．５％、ｐＨ：７．２）、およびＰ寒天（peptone Marcor：０．２％、澱粉：０．８％、単細胞タンパク質probione：０．４％、酵母菌抽出物：０．２％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ：０．１％、ＭｇＳＯ４：０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：８ｍｇ／ｌ、１．５％：寒天、ｐＨ：７．５）でよく成長する。実際の培養は、液体培地ＣＹ／Ｈ（５０％のＣＹ培地＋５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０％のＨ培地：大豆粉が０．２％、グルコースが０．８％、澱粉が０．２％、酵母菌抽出物が０．２％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏが０．１％、ＭｇＳＯ４が０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡが８ｍｇ／ｌ、ＨＥＰＥＳが５０ｍＭ、ｐＨ：７．４）中で育成した。液体培地を３０℃、１８０ｒｐｍで振とうした。保存のため、３日目の培地の一部（２ｍｌ）を−８０℃で保存した。上記の寒天プレート上または２０ｍｌのＣＹ／Ｈ培地（プラグおよびアルミニウムキャップ付きの１００ｍｌの三角フラスコ中）で数年後に再活性化しても問題はなかった。１日または２日後に２０ｍｌの培地を１００ｍｌにスケールアップしてもよい。
形態学的な記述
液体培地ＣＹ／Ｈに入れて２日後に、系統種ＭＣｙ８０７１の棒状細胞の長さは９．０〜１４．５μｍ、幅は０．８〜１．０μｍであった。上記寒天プレート上での遊走は円形である。ＶＹ／２−寒天上では、遊走は薄く透明である。ＶＹ／２−寒天上では酵母菌の分解が見られる。ＣＹ−寒天上では、培地は透明なオレンジ色に見える。Ｐ寒天上では、細胞の大量生産が際立っており、遊走挙動は減少する。コロニーの色はオレンジがかった茶色である。Ｐ寒天の澱粉は分解される。
ＭＣｙ８０７１は以下の抗生物質に耐性がある：アンピシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、スペクチノマイシン、ネオマイシン、およびフシジン酸。セファロスポリンおよびカスガマイシンとはわずかに成長することができ、チオストレプトン、トリメトプリム、カナマイシン、およびオキシテトラサイクリンとは全く成長することができない（すべての抗生物質の最終濃度は５０μｇｍｌ−１に調整した）。
シストバクタミドの産生
この系統種は、複合媒体で産生する。この系統種は、窒素を含む栄養素（例えば、単細胞タンパク質（Ｐｒｏｂｉｏｎ）、およびタンパク質分解物の生成物（例えば、ペプトン、トリプトン）、酵母菌抽出物、大豆粉、および肉抽出物）を好む。本明細書では、この生成物は、１種よりも上記タンパク質混合物の数種を含む方がよい。
シストバクタミドは、成長の定常期まで対数的に産生される。１００リットルの発酵（培地Ｅ）で２日後には、この生成物の量は、もはや増えなくなっていた。
シストバクタミドを培地に供給して、ＸＡＤ吸着剤樹脂に結合する。ＸＡＤを金属篩にかけて、アセトンに溶出する。異なる産生温度（２１℃、３０℃、３７℃、および４２℃）で試験した。これにより、４２℃では産生不能であることが分かった。最適な温度は、給気を最大にして３０℃であった。
ＭＣｙ８０７１の発酵は、１００リットルの培地Ｅ（スキムミルク：０．４％、大豆粉：０．４％、酵母菌抽出物：０．２％、澱粉：１．０％、ＭｇＳＯ４：０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：８ｍｇ／ｌ、グリセリン：０．５％；ｐＨ：７．４）を含む１５０リットルの発酵槽、および７０リットルの培地Ｍ（大豆ペプトン：１．０％、マルトース：１．０％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ：０．１％、ＭｇＳＯ４：０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：８ｍｇ／ｌ；ｐＨ：７．２）を含む１００リットルの発酵槽で４日間３０℃で行った。ｐＨは、水酸化カリウム（２．５％）および硫酸で７．２〜７．４に調節した。攪拌器の速度は、圧縮空気を０．０５ｖｖｍで供給しながら１００〜４００ｒｐｍであった。発酵液内の溶存酸素量は、攪拌器のスピードにより、ｐＯ２：４０％に調節した。シストバクタミドを結合させるため、１％の吸着剤樹脂を発酵液に添加した。発酵槽に、５リットルの３日経った予備培地（Ｅ培地またはＭ培地をそれぞれ）を接種した。発酵過程中の生成物をＨＰＬＣ−ＭＳ分析およびメタノール抽出物の大腸菌に対する一連の希釈試験により調べた。この系統種は、シストバクタミドを産生する。
（ＷＯ２０１５／００３８１６＝ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／００１９２５で記載されているシストバクタミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦに加えて）以下のシストバクタミドが、単離され、ＮＭＲおよびＭＳにより構造解析された。
シストバクタミド９３５−２：
シストバクタミド８１９−１：
シストバクタミド８４５−２：
シストバクタミド８４６−１：
シストバクタミド８６１−１：
シストバクタミド８６２−１：
シストバクタミド８６２−２：
シストバクタミド８９１−１：
シストバクタミド９０３−１：
シストバクタミド９０３−２：
シストバクタミド９０５−１：
シストバクタミド９０５−２：
シストバクタミド９２０−１：
シストバクタミド９３３−１：
シストバクタミド９３３−２：
シストバクタミド９３４−１：
シストバクタミド９３４−２
シストバクタミド９１９−２：
＊これらの構造単位に対応する信号は、ＤＭＳＯ−ｄ６中でのＮＭＲスペクトルの信号ブロードニング効果により帰属することができなかった。「構造の解明」の項および図Ｓ４２〜Ｓ４５も参照のこと。
通常のペプチド中と同様にメトキシアスパラギン（またはアスパラギン酸塩）の断片を含むシストバクタミドでは、その質量スペクトル（図１）において４１３（４１４）フラグメントイオンを示す。イソアミノ酸を含むシストバクタミドでは、メトキシアスパラギン（アスパラギン酸塩）が存在しても、この４１３（４１４）フラグメントイオンを示さない（図２）。シストバクタミドの質量スペクトルでこのフラグメントイオンの存在に基づいて、イソアミノ酸および非イソアミノ酸の存在を解明することができる。
２．シストバクタミドの生物学的評価
抗細菌活性
シストバクタミド（Ｃｙｓ）９１９−２、９２０−１、９３４−２、９３５−２、８９１−２、および９０５−２を既に記載した誘導体（８６１−２、８７７−２、９２０−２）と共にグラム陰性菌の選択された集合に対して評価した。誘導体８６１−２、８７７−２、９１９−１、および９２０−２は、ＷＯ２０１５／００３８１６に記載されているシストバクタミドＦ、Ｈ、Ａ、およびＢに対応する。最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration、ＭＩＣ）値を、μｇ／ｍｌで示す。シプロフロキサシン（ＣＰ）を参照として用いた。
シストバクタミド９１９−２および８９１−２を既に記載した誘導体８６１−２（Ｆ）および９１９−１（Ａ）と共に、より大きな細菌群およびＣＨＯ−Ｋ１細胞株で試験した。
抵抗性頻度
シストバクタミド８６１−２および９１９−２について４倍のＭＩＣ値で大腸菌ＤＳＭ−１１１６を用いて決定した抵抗性頻度は１０−７〜１０−８であった。
インビトロ活性
シストバクタミド９１９−２およびシプロフロキサシン（ＣＰ）と比較してシストバクタミド８６１−２の大腸菌ギラーゼおよび緑膿菌ギラーゼのＤＮＡ超らせん形成（supercoiling、ｓｃ）活性を決定した。
遺伝毒性
２０μｇ／ｍｌのシストバクタミド８６１−２、シストバクタミド９１９−２、およびシプロフロキサシンについてＣＨＯ−Ｋ１細胞株との小核形成アッセイでは検出可能な遺伝毒性の影響は観察されなかった。マイトマイシンＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として用いた。すべての実験は、同じものを３つ用意して行い、染色した核の顕微鏡画像を評価した。小核形成は、マイトマイシンＣで処理したＣＨＯ−Ｋ１細胞でははっきりと観察されたが、未処理の対照、シプロフロキサシンで処理した細胞、およびシストバクタミドで処理した細胞では観察されなかった。
材料および方法
ＭＩＣの決定
感受性アッセイに用いた指示系統種は、本発明者らの収集した系統種の一部か、あるいはGerman Collection of Microorgansims and Cell Cultures (DSMZ)またはアメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection, ATCC)から購入したものであった。大腸菌系統種ＷＴおよび対応する大腸菌変異体は、ハンブルグ大学医薬生物学および微生物学部教授のP. Heisig博士の厚意により提供を受けた。大腸菌系統種ＪＷ０４０１−１（ＷＴ）およびΔｔｓｘはE. coli Genetic Stock Center (CGSC)のコレクションから得た。
ＭＩＣ値は、標準微量希釈アッセイで決定した。一晩培養した培地を適切な成長培地で希釈して、接種量１０４〜１０６ｃｆｕ／ｍＬを得た。酵母菌はＭｙｃ培地（１％のフィトンペプトン、１％のグルコース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ：７．０）中で生長させ、肺炎レンサ球菌およびエンテロコッカス属菌は、トリプトシン大豆ブロス（ＴＳＢ：１．７％のペプトンカゼイン、０．３％のペプトン大豆かす、０．２５％のグルコース、０．５％のＮａＣｌ、０．２５％のＫ２ＨＰＯ４；ｐＨ：７．３）中で成長させ、Ｍ．スメグマティスは、１０％のMiddlebrook ADCエンリッチメントおよび２ｍｌ／ｌのグリセリンを補充したMiddlebrook 7H9培地中で成長させた。ここで挙げたすべての他の細菌は、Muller-Hintonブロス（０．２％の牛肉煎出物固体、１．７５％のカゼイン加水分解物、０．１５％の澱粉、ｐＨ：７．４）で成長させた。シストバクタミドおよび対照薬物を殺菌した９６ウェルプレートの培地（同じものを２つ用意して）に直接加えて、一連の希釈液を調製した。肺炎レンサ球菌を除く微生物をマイクロプレートシェーカー（７５０ｒｐｍ、３０〜３７℃、１８〜４８時間）で成長させた。肺炎レンサ球菌は非振とう条件（３７℃、５％のＣＯ２、１８時間）で成長させた。目視による観察により成長阻害を評価し、ＭＩＣを目に見える成長を阻害する化合物の最低濃度として定義した。
細胞毒性
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＤＳＭＺから入手して、供託者により推奨された条件で培養した。細胞を、９６ウェルプレートの１８０μｌの完全培地に６×１０３細胞／ウェルで播種して、２時間の平衡後に一連の希釈をした化合物で処理した。各試料と内部ＤＭＳＯ対照を、同じ物を２つ用意して検査した。５日間インキュベーションした後、ウェルあたり、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド）のＰＢＳ溶液２０μｌを加えて、さらに３７℃で２時間インキュベートした。次いで、この培地を捨てて、１００μｌのＰＢＳで細胞を洗浄した。その後、ホルマザン顆粒を溶解するために１００μｌの２−プロパノール／１０ＮのＨＣｌ（２５０：１）を加えた。マイクロプレートリーダー(Tecan Infinite M200Pro)を用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞生存率を各メタノール対照に対する百分率として表した。
耐性率
シストバクタミドに対する自然抵抗性頻度を決定するため、対数期の細菌細胞懸濁液をMuller-Hintonブロスで最終濃度を１０１０ＣＦＵ／ｍＬに調整し、異なる体積の液を大腸菌ＤＳＭ−１１１６に対するＭＩＣの４倍の濃度のシストバクタミドを含む二つの同じ寒天プレート上に流し込んだ。また、大腸菌培地を数回希釈したものを抗生物質を含まないプレートに流し込んだ。１日後、シストバクタミドを含むプレートのＣＦＵ数を抗生物質を含まないプレートのＣＦＵ数で除して抵抗性頻度を決定した。
酵素阻害
シストバクタミドの抗ギラーゼ活性を試験するため、市販の大腸菌ギラーゼおよび緑膿菌ギラーゼ超らせん形成キット(Inspiralis、英国ノリッジ)を用いた。標準反応として、０．５μｇの弛緩プラスミドを１倍の反応緩衝液中で１単位のギラーゼと混合して（キットのマニュアルを参照のこと）、３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＤＮＡゲルローディングバッファーを加えて停止した。試料を１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上で分離して、ＥｔＢｒを用いてＤＮＡを可視化した。すべての天然生成物原液および希釈液を１００％のＤＭＳＯで調製して、超らせん形成反応物に添加し、最終ＤＭＳＯ濃度を２％（ｖ／ｖ）にした。
遺伝毒性研究
チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＣＣ−１１０）をＤＳＭＺから入手して、供託者により推奨された条件で保持した。遺伝毒性研究では、光学底部を有する黒色９６ウェルプレートに細胞を５×１０３細胞／ウェルで播種して、化合物を添加する前に１日間付着させた。ＣＰ、シストバクタミド、およびマイトマイシンＣを添加して、最終濃度２０μｇ／ｍｌ（ギラーゼ阻害剤）および１００ｎｇ／ｍｌ（マイトマイシンＣ）とした。細胞を４８時間処理して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ：７．４）で二度洗浄し、ＡｃＯ／ＭｅＯＨ（１：１、−２０℃）を用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳによる洗浄を繰り返した後、光を遮断して室温で１５分間、核を５μｇ／ｍＬのHoechst33342のＰＢＳ溶液で染色した。洗浄後、Hoechstに適した１組のフィルターを有する自動顕微鏡(Pathway855, BD Biosciences)を用いて試料を画像観察（２００倍）した。すべての試料を、２つの独立した実験で同じものを３つ調製して小核形成について分析した。
３．シストバクタミドＣ誘導体の合成
３．１．用いられた個々の環の合成
ここで、シストバクタミドＣ誘導体の合成に用いられた異なる個々の環の調製について記載する。
環Ｃの調製
環Ｂの調製
３．２．調製された異なるＢＣ断片を得るための環ＢおよびＣのカップリング
３．３シストバクタミドＣ誘導体（１ｓ）〜（３ｓ）を合成するための環ＡとＢＣ断片（ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３）とのカップリング
３．４．化合物４ｓの調製
３．５．実験
３．５．１．実験の一般情報
出発物質および溶媒は、供給業者から購入して、さらなる精製は行わずに用いた。すべての化学収率は、精製された化合物について言及しており、最適化されていない。反応の進行は、ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムシートを用いて追跡し、２５４ｎｍのＵＶにより可視化した。フラッシュクロマトグラフィーはシリカゲル６０Å（４０〜６３μｍ）を用いて行った。分取ＲＰ−ＨＰＬＣを２７６７試料マネジャー、２５４５二元グラジエントモジュール、２９９８ＰＤＡ検出器、および３１００エレクトロンスプレー質量分析計を備えたウォーターズ社のセットアップで実施した。精製はWaters XBridgeカラム（Ｃ１８、１５０×１９ｍｍ、５μｍ）、溶離液として二元溶媒系ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％のギ酸を含む水、Ｂ＝０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ）を用いて行い、流量を２０ｍＬ／分、６０％〜９５％のＢを８分間のグラジエントで行った。融点は、Stuart Scientific融点装置ＳＭＰ３(Bibby Sterilin, 英国)で決定して、補正は行っていない。ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX-500（１Ｈ、５００ＭＨｚ；１３Ｃ、１２６ＭＨｚ）分光計またはBruker Fourier 300（１Ｈ、３００ＭＨｚ；１３Ｃ、７５ＭＨｚ）分光計のいずれかを用いて３００Ｋで記録した。内部標準物質としての重水素化物溶媒の水素化残留物（ＣＤＣｌ３：δ＝７．２６、７７．０２；ＤＭＳＯ−ｄ６：δ＝２．５０、３９．９９）を参照して化学シフトをδ値（単位：ｐｐｍ）で記録した。分裂パターンは明らかな多重度を記述し、ｓ（一重線）、br s（ブロード一重線）、ｄ（二重線）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）として表される。カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で表される。生物学的アッセイで用いられるすべての化合物の純度は、LC/MS Finnigan Surveyor MSQ Plus（Thermo Fisher Scientific, 独国ドライアイヒ）で測定したところ、９５％以上であった。このシステムは、ＬＣポンプ、オートサンプラー、ＰＤＡ検出器、およびシングル四重極ＭＳ検出器、および操作のための標準ソフトウェアＸｃａｌｉｂｕｒからなる。RP C18 Nucleodur 100-5(１２５×３mm)カラム(Macherey-Nagel GmbH, 独国ディーレン)を固定相として、二元溶媒系ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％のＴＦＡを含む水；Ｂ＝０．１％のＴＦＡを含むＭｅＣＮ）を移動相として用いた。グラジエント操作では、Ｂの百分率を、０分での初期濃度０％から１５分で１００％まで上げ、５分間１００％を維持した。注入量は１０μＬであり、流量は８００μＬ／分に設定した。ＭＳ（ＥＳＩ）分析をスプレー電圧３８００Ｖ、細管温度３５０℃、およびソース衝突誘起解離(collision- induced dissociation, CID)１０Ｖで行った。スペクトルを正モードで１００〜１０００ｍ／ｚの範囲で取得し、ＵＶでのトレースは２５４ｎｍで行った。
３．５．２．一般的な合成手順：
ａ）当該酸（２５ｍｍｏｌ）、臭化イソプロピル（５２ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（５２ｍｍｏｌ）の混合物のＤＭＦ（１００ｍｌ）溶液を９０℃で一晩加熱した。次いで、過剰のＤＭＦを減圧下で除去して、残留物を水と酢酸エチルで分離した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水して、次いで、過剰な溶媒を減圧下で除去して純粋な生成物を得た。
ｂ）当該ニトロ誘導体（１０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（６０ｍＬ）撹拌溶液に、鉄粉末（２．８０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を５５℃で加えて、次いで、ＮＨ４Ｃｌ（２６６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の水（３０ｍＬ）溶液を加えた。この反応溶液を１〜２時間還流して、熱いうちに鉄を濾過した。濾液を、乾燥するまで真空下で濃縮した。残留物を水（３０ｍＬ）で希釈して、ＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）で塩基性にしてｐＨを７〜８とした。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄して、脱水し（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留により除去した。得られた粗材料をｎ−ヘキサンと共に粉末にして、ろ過により回収した。
ｆ）当該アルデヒド（４ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（０．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）の水（５０ｍＬ）撹拌溶液に、ＡｇＮＯ３（３．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。この反応溶液を一晩還流して、放冷し、セライトを用いて濾過した。濾液を氷槽で冷却して、ＨＣｌ（３７％）で酸性にしてｐＨを３〜４とした。析出した固体をろ過で回収して、冷水、次いでｎ−ヘキサンで洗浄した。
ｈ）窒素雰囲気下で当該酸（２ｍｍｏｌ）およびアミン（２．４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）撹拌溶液にジクロロトリフェニルホスホラン（３．０ｇ、９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を８０℃で５時間加熱した。溶媒を真空蒸留により除去した。次いで、フラッシュクロマトグラフィーを用いて残留物を精製した。
ｉ）以下で報告された手順１に従ってアミドを形成した。当該酸（１ｍｍｏｌ）およびアミン（１ｍｍｏｌ）のキシレン（２．５ｍｌ）沸騰溶液をＰＣｌ３のＣＨ２Ｃｌ２（０．４ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液で処理した。２時間後、過剰の溶媒を蒸発させて、カラムクロマトグラフィーを用いて残留物を精製した。
ｊ）以下で報告された手順２に従ってエステル加水分解を行った。当該エステル（０．１ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム１Ｍ（３ｍＬ）、および無水メタノールを４５℃で一晩加熱した。冷却時に、反応混合物を酸性にしてｐＨ１（３ｍＬ、塩酸１Ｍ）とし、ジクロロメタン（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で溶媒を除去して純粋な生成物を得た。
３．５．３．具体的な合成手順：
酢酸２−ホルミル−６−メトキシフェニル
３−メトキシサリチルアルデヒド（４．５６ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびピリジン（２．４３ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）撹拌溶液に塩化アセチル（２．３６ｇ、３０ｍｍｏｌ）を滴下した。この反応溶液を室温で一晩撹拌し、次いで、溶媒を真空蒸留により除去した。残留物を希釈した冷ＨＣｌ中で砕いて、濾過し、冷水、次いでｎ−ヘキサンで洗浄した。
収率９４％（オフホワイト固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）１９５［Ｍ＋Ｈ］＋
酢酸６−ホルミル−２−メトキシ−３−ニトロフェニル
酢酸２−ホルミル−６−メトキシフェニル（１．９４ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＫＮＯ３（１．０１ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）の撹拌した氷冷懸濁液にトリフルオロ無水酢酸（１２ｍＬ）を加えた。この反応液を氷槽で２時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。この反応溶液を水（５０ｍＬ）で注意しながら希釈して、ＣＨＣｌ３で抽出した。合わせた有機抽出物を脱水して（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留により除去した。残留物をトルエンに溶解して、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝３：１）を用いて精製した。収率４５％（黄色半固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２３９［Ｍ］＋
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−ニトロベンズアルデヒド
酢酸６−ホルミル−２−メトキシ−３−ニトロフェニル（９５７ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の撹拌水（３０ｍＬ）懸濁液にＮａＯＨ（０．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を２時間還流して、次いで、室温で一晩撹拌した。この溶液を氷槽で冷却して、２ＭのＨＣｌで酸性にしてｐＨを３〜４とした。析出した固体をろ過により回収して、冷水、次いでｎ−ヘキサンで洗浄した。収率９０％（黄色がかった茶色の固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）１９７［Ｍ］＋
２，３−ジヒドロキシ−４−ニトロベンズアルデヒド
氷槽で０℃に冷却した１８（１．２ｇ、５ｍｍｏｌのＤＣＭ（１０ｍＬ）撹拌溶液に、ＢＢｒ３（１ＭのＤＣＭ溶液、２０ｍＬ）を窒素雰囲気下で注意しながら加えた。この反応混合物を室温まで戻して、さらに一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去した。残留物を注意しながら水（５０ｍＬ）で希釈して、必要に応じて、媒質を２ＮのＨＣｌで酸性化してｐＨを４〜５とした。この混合物をＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を塩水で洗浄して、無水ＭｇＳＯ４で脱水し、溶媒を真空蒸留により除去した。残留物をＣＨＣｌ３に溶解して、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＤＣＭ−ＭｅＯＨ＝９８：２）を用いて精製した。
３．５．４．誘導体（１ｓ−４ｓ）の実験データ
４−（４−（４−アミノベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアミド）−３−イソプロポキシ安息香酸（１ｓ）
収率８５％；淡黄色結晶；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.79 (br s, 1H), 11.38 (br s, 1H), 10.98 (br s, 1H), 9.22 (br s, 1H), 8.56 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.73 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.65 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.59 (dd, J=8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.57 (d, J=1.6 Hz, 1H), 6.69 (d, J=8.5 Hz, 2H), 5.39 (br s, 2H), 4.76 (septet, J=6.0 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 1.39 (d, J=6.0 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ166.99, 165.03, 163.28, 151.46, 149.53, 146.13, 139.38, 136.34, 133.45, 129.43, 125.62, 125.55, 122.65, 121.21, 119.28, 115.71, 113.89, 113.75, 113.43, 71.72, 60.40, 21.73; m/z (ESI+) 479.99 [M + H]+; tR=14.53分.
４−（４−（４−アミノベンズアミド）−２，３−ジイソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシ安息香酸（２ｓ）
収率８１％；薄茶色固体；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.82 (br s, 1H), 10.36 (br s, 1H), 9.06 (br s, 1H), 8.60 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.01 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.75 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.61 (dd, J=8.5, 1.9 Hz, 1H), 7.58 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.63 (d, J=8.8 Hz, 2H), 5.90 (br s, 2H), 4.75 (septet, J=6.0 Hz, 1H), 4.63 (septet, J=6.3 Hz, 1H), 4.52 (septet, J=6.0 Hz, 1H), 1.35 (d, J=6.0 Hz, 6H), 1.31 (d, J=6.0 Hz, 6H), 1.27 (d, J=6.3 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ166.88, 164.45, 162.79, 152.66, 148.60, 145.71, 141.15, 137.69, 132.89, 129.08, 125.58, 125.44, 123.52, 122.83, 119.87, 118.64, 117.50, 113.94, 112.87, 77.12, 75.70, 72.02, 22.25, 21.90, 21.79; m/z (ESI+) 549.86 [M + H]+; tR=13.10分.
４−（４−（４−アミノベンズアミド）−３−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアミド）−３−イソプロポキシ安息香酸（３ｓ）
収率７９％；薄茶色固体；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.67 (br s, 1H), 10.90 (s, 1H), 10.12 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 8.65 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.80-7.71 (m, 2H), 7.64-7.54 (m, 4H), 6.67-6.59 (m, 2H), 5.95 (br s, 2H), 4.86 (septet, J=6.2 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 1.41 (d, J=6.0 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 166.97, 166.24, 162.25, 152.99, 147.98, 145.57, 141.60, 133.01, 132.60, 129.79, 125.45, 122.58, 121.24, 119.02, 118.71, 118.20, 112.99, 112.96, 112.69, 71.00, 61.60, 21.71. m/z (ESI+) 480.08 [M + H]+; tR=10.70分.
４−（４−（４−アミノベンズアミド）−３−イソプロポキシ−２−メトキシベンズアミド）−３−イソプロポキシ安息香酸（４ｓ）
収率４３％；薄茶色固体；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.82 (br s, 1H), 10.90 (br s, 1H), 9.09 (br s, 1H), 8.62 (d, J=8.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.60 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J=1.6 Hz, 1H), 6.63 (d, J=8.5 Hz, 2H), 5.92 (br s, 2H), 4.85 (septet, J=6.0 Hz, 1H), 4.47 (septet, J=6.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 3H), 1.40 (d, J=6.0 Hz, 6H), 1.32 (d, J=6.0 Hz, 6H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 166.96, 164.45, 161.87, 152.74, 151.59, 145.55, 140.72, 138.04, 133.03, 129.11, 125.79, 125.47, 122.67, 120.61, 119.78, 118.58, 117.31, 113.14, 112.87, 76.50, 71.14, 61.78, 22.36, 21.66; m/z (ESI+) 522.04 [M + H]+; tR=15.58分.
参考資料：
1) Alina Fomovska, Richard D. Wood, Ernest Mui, Jitenter P. Dubey, Leandra R. Ferreira, Mark R. Hickman, Patricia J. Lee, Susan E. Leed, Jennifer M. Auschwitz, William J. Welsh, Caroline Sommerville, Stuart Woods, Craig Roberts, and Rima McLeod. Salicylanilide Inhibitors of Toxoplasma gondii（トキソプラズマ原虫のサリチルアニド阻害剤）. J. Med. Chem., 2012, 55(19), pp 8375-8391.
2) Valeria Azzarito, Panchami Prabhakaran, Alice I. Bartlett, Natasha Murphy, Michaele J. Hardie, Colin A. Kilner, Thomas A. Edwards, Stuart L. Warriner, Andrew J. Wilson. 2-O-Alkylated Para-Benzamide α-Helix Mimetics: The Role of Scaffold Curvature（2-O-アルキル化パラベンズアミドα−ヘリックス模倣物：足場曲率の役割）. Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 6469.

Claims (15)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-6アルキルで表される基であり、
    Ｒ2は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-6アルキルで表される基であり、
    Ｒ3は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-6アルキルで表される基であり、
    Ｒ4は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-6アルキルで表される基であり、
    Ｒ5は、下記式で表される基であり、
    または
    （ここで、Ｒ6はＯＨまたはＮＨ2である）、
    または、前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
  2. Ｒ1は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基であり、
    Ｒ2は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基であり、
    Ｒ3は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基であり、
    Ｒ4は、水素、ＯＨ、または式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基であり、
    Ｒ5は、下記式で表される基である、
    または
    （ここで、Ｒ6はＯＨまたはＮＨ2である）、
    請求項１に記載の化合物、前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物または水和物。
  3. Ｒ1はＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｒ1は、式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基であり、特に、Ｒ1は式−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）2で表される基である、請求項１または２に記載の化合物。
  5. Ｒ2は水素である、請求項１〜４の何れか一項に記載の化合物。
  6. Ｒ2はＯＨである、請求項１〜４の何れか一項に記載の化合物。
  7. Ｒ3は水素である、請求項１〜６の何れか一項に記載の化合物。
  8. Ｒ3はＯＨである、請求項１〜６の何れか一項に記載の化合物。
  9. Ｒ3は式−Ｏ−Ｃ1-4アルキルで表される基である、請求項１〜６の何れか一項に記載の化合物。
  10. Ｒ4は水素である、請求項１〜９の何れか一項に記載の化合物。
  11. Ｒ4はＯＨである、請求項１〜９の何れか一項に記載の化合物。
  12. 以下の化合物から選択される化合物：
  13. 請求項１〜１２の何れか一項に記載の化合物、および任意で１種以上の担体物質および／または１種以上のアジュバントを含む、医薬品組成物。
  14. バクテリア感染の治療または予防に用いられる請求項１〜１２の何れか一項に記載の化合物。
  15. バクテリア感染の治療または予防に用いられる請求項１３に記載の医薬品組成物。
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