CN108078982B

CN108078982B - 脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途

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Publication number: CN108078982B
Application number: CN201611043306.0A
Authority: CN
Inventors: 高清志; 刘欣雨; 马玉茹
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2036-11-21
Also published as: CN108078982A

Abstract

本发明公开了脯氨酸衍生物在制备β‑内酰胺酶抑制剂中的用途，脯氨酸衍生物用式(I)所示：

其中，式(I)中酰胺键包含其自然存在的顺式或反式旋转异构体；R₁为OH或NH₂；R₂为邻磺酸基苯基，邻磺酰胺基苯基，间磺酸基苯基，间磺酰胺基苯基，对磺酸基苯基，对磺酰胺基苯基或邻羧基苯甲基。经活性测试证明式(I)所示的脯氨酸衍生物对β‑内酰胺酶，特别是NDM‑1具有较好的抑制作用。通过抑制β‑内酰胺酶，特别是NDM‑1活性,减少甚至消除NDM‑1对β‑内酰胺类抗生素的水解,缓解NDM‑1引起的耐药性,恢复抗生素对细菌的疗效,从而能够治疗由NDM‑1引起的耐药细菌感染。

Description

脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途

技术领域

本发明涉及脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

背景技术

自抗生素药物在二十世纪四十年代应用于临床以来，人类的感染性疾病的发病率和死亡率均得到了明显的改善和提高。但是，随着人类对抗生素的滥用和误用，大多数的病原菌已经转变成为抗生素耐药菌，因此抑制病原菌的耐药恢复抗菌药物的疗效成为当务之急。

2010年8月11日，著名医学杂志《柳叶刀》刊文报导了一种特殊的肠杆菌科细菌，对所有β-内酰胺类抗菌药物具有耐药性的病例。该报道引起了全世界的广泛关注，深入研究发现该类细菌携带肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneμMoniae)编码的一种新型金属β-内酰胺酶，在其活性部位结合有锌离子，能够水解临床上应用的几乎所有抗生素。因为第一例病例在印度新德里发现，所以研究者们将它定义为新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1：New Delhimetallo-β-1actamase 1)。NDM-1属于B类β-内酰胺酶超家族中的一员，具有多重抗药性，除了多粘菌素(Colistin)和替加环素(Tigecycline)以外，对其余所有抗生素都表现高度耐药性，且耐受大多数β-内酰胺酶抑制剂，如舒巴坦、他唑巴坦、克拉维酸等。更值得关注的是，其携带的blaNDM-1基因位于质粒上，可在不同菌种之间水平转移，导致其它菌种也具有抗生素耐药性。因此，找到能够抑制产NDM-1耐药细菌的活性的药物具有非常重要的意义。

2014年南开大学报道了作为降血压药物的卡托普利以及其多种衍生物具有抑制金属β-内酰胺酶NDM-1的作用(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 24(2014)386–389)，研究还披露了评价针对NDM-1的药效评价方法。2015年Proschak等详细报道了作为不同适应症已经上市的临床药物中发现的多种对NDM-1具有抑制作用的化合物(J.Med.Chem.2015,58,3626-3630)。但是上述公开的对NDM-1具有抑制作用的上市药物或者化合物，其分子结构中大多数都含有巯基分子结构，巯基的存在不仅会使药物产生不愉快的气味，并且由于巯基与金属的强配位能力使得含巯基化合物作为药物使用时会对人体内多种含金属离子的酶产生无选择的抑制作用从而导致药物毒副作用。例如，如图1所示由Proschak归纳报道的多数含巯基药物均被认为不适于作为临床药物用于抑制超级耐药菌金属β-内酰胺酶NDM-1(J.Med.Chem.2015,58,3626-3630)。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

本发明的第二个目的是提供一种脯氨酸衍生物的医学上容许的盐在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

本发明的第三个目的是提供脯氨酸衍生物的的溶剂化物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

本发明的第四个目的是脯氨酸衍生物的与医学上容许的载体组成的组合物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途，所述脯氨酸衍生物用式(I)所示：

其中，式(I)中酰胺键包含其自然存在的顺式或反式旋转异构体；R₁为OH或NH₂；

R₂为邻磺酸基苯基，邻磺酰胺基苯基，间磺酸基苯基，间磺酰胺基苯基，对磺酸基苯基，对磺酰胺基苯基或邻羧基苯甲基。

式(I)优选为：

脯氨酸衍生物的医学上容许的盐在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

脯氨酸衍生物的溶剂化物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

脯氨酸衍生物与医学上容许的载体组成的组合物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

本发明的优点：

经活性测试证明式(I)所示的脯氨酸衍生物对β-内酰胺酶，特别是NDM-1具有较好的抑制作用。本发明的脯氨酸衍生物可以通过抑制β-内酰胺酶，特别是NDM-1活性,减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解,缓解NDM-1引起的耐药性,恢复抗生素对细菌的疗效,从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染,具有良好的药物应用前景。

附图说明

图1为Proschak归纳报道的多数含巯基药物结构式。

具体实施方式

本发明以人体内存在的天然氨基酸L-脯氨酸为出发点，经过科学探索发现了以式(I)表示的具有β-内酰胺酶抑制作用的脯氨酸衍生物中不含有巯基，是β-内酰胺酶，特别是新型NDM-1金属β-内酰胺酶抑制剂。

本发明首先以蛋白质数据库中NDM-1的结晶构造为模型(PDB：1Q6X)，应用计算机辅助药物设计软件SYBYL 2.0，采用分子对接的方式评价预先设计的式(I)所示的脯氨酸衍生物与NDM-1配体结合部位的亲核能。预先设计的式(I)中R₁定义为NH₂或者OH，R₂定义为能够从SIGMA-ALDRICH商业购买的所有的酰氯化合物以及所有的羧酸化合物。

具体操作如下：

【活性化合物的设计与筛选】

将含有氨苄青霉素水解产物配体的NDM-1(PDB：1Q6X)下载至工作站，利用SYBYL2.0中的Surflex-dock程序并遵循软件所规定的方法，对蛋白质进行分子对接准备。这些准备工作包括移除水分子，修正定义不合理的氨基酸，将金属锌原子赋予二价电荷，对蛋白质赋予AMBER力场，对所有配体化合物赋予TRIPOS力场。遵循软件的分子对接操作程序，针对每个被评估分子结构实施分子对接和打分。打分包括总积分(Total Score)，D-score，PMF-Score，G-Score以及CHEM-Score，本发明采用将Total-Score和CHEM-Score两个打分与天然配体氨苄青霉素水解产物的打分相比较，打分优于氨苄青霉素水解产物的被评价化合物被视为具有潜在NDM-1抑制作用的候选化合物。这些被挑选出来的具有潜在活性化合物经过实验室合成与制备，最后用于NDM-1金属β-内酰胺酶抑制活性的筛选。

【NDM-1金属β-内酰胺酶的表达分离及纯化】

依据文献操作方法(李惠如，超级细菌NDM-1基因检测方法、抑菌评价模型的建立及黄连抑菌探索试验的研究，广州中医药大学博士学位论文，2011；谢楠楠，“超级细菌”NDM-1抑制剂筛选与体外抗菌活性测定，南开大学硕士学位论文，2013)，本发明利用大肠杆菌BL21感受态细胞，首先实施NDM-1质粒的转化，将挑选出的单菌落细胞，接种到5mL LB液体培养基，37℃220rpm振荡过夜，然后添加10％甘油将菌种保存于-80℃待用。取上述保存的表达菌50μL接种于50mL含卡那霉素(工作浓度50ug/mL)的LB液体培养基中，37℃220rpm振荡过夜培养，得种子液；以1:100的比例将2mL种子液转接到200mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养；当菌液的OD600值约为0.8时，取1mL菌液，4℃，12000rpm离心2分钟，收集菌体沉淀，于20℃加入200μL的1M IPTG储备液(工作浓度1mM)，于180rpm振荡诱导8小时；取1mL诱导菌液，4℃，12000rpm离心2分钟，收集菌体沉淀，保存于-80℃；取保存的菌体，按照10mL/g的比例加入Binding-Buffer(pH7.4)，加入蛋白酶抑制剂PMSF至浓度为1mM。随后将菌液置于玻璃烧杯，在冰浴下400W超声3秒间歇3秒，每次超声处理15分钟，至菌液透明。菌体破碎后，在4℃，12000rpm离心30分钟，分别收集上清和沉淀。沉淀用上清等体积的PBS溶液重悬。蛋白的纯化采用Ni-NTA柱，柱床体积为2mL，用Binding-Buffer以2mL/min的流速平衡5个柱床体积，将上清过0.45μM滤膜，后加载到Ni亲和柱，流速为1mL/min。用分别含有50,100,200和400mM咪唑的Binding-Buffer(pH7.4)进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱样品，用SDS-PAGE电泳检测NDM-1蛋白的纯化结果，获得纯度大于90％的NDM-1重组蛋白。

下面用具体实施例对本发明作进一步地说明，但不限制本发明。

实施例1：化合物Ia的合成：

(1)在室温条件下将邻羧基苯乙酸(360mg,2mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(384mg,2mmol)和1-羟基苯并三唑(270mg,2mmol)，搅拌15分钟，然后加入L-脯氨酸苄酯盐酸盐(532mg,2.2mmol)和4-二甲氨基吡啶(805mg,6.6mmol)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷稀释反应物，分别用饱和碳酸氢钠、3M盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，得有机相溶剂用无水硫酸钠干燥，减压旋干，用HPLC(甲醇∶水＝7∶3)对反应生成物实施纯化,得白色固体中间体(404mg)，收率为55％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.96(d,J＝7.6Hz,0.8H),7.92(d,J＝7.5Hz,0.2H,rotamer),7.37(m,7.8H),7.02(d,J＝7.6Hz,0.2H,rotamer),5.28–5.21(m,0.4H,rotamer),5.12(dd,J＝40.4,12.3Hz,1.6H),4.73(dd,J＝8.6,2.5Hz,0.2H,rotamer),4.60(dd,J＝8.6,3.7Hz,0.8H),4.02(m,1.6H),3.94(m,0.4H,rotamer),3.87–3.80(m,0.8H),3.73(m,0.8H),3.68–3.64(m,0.2H,rotamer),3.59(m,0.2H,rotamer),2.40–2.31(m,0.3H,rotamer),2.27–1.99(m,3.2H),1.98–1.84(m,0.5H,rotamer).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ172.25,172.15(rotamer),179.12–171.20,136.29,135.69,135.30(rotamer),132.59–132.15,132.15–132.06,131.73,131.35,130.60,128.82–128.35,128.20,128.05,127.19,67.38(rotamer),66.86,59.91(rotamer),59.05,47.43,46.86(rotamer),40.26,31.41(rotamer),29.28,24.80,22.72(rotamer).IR(KBr):3422.62,1359.72,1159.57,1075.22,948.86,860.35,546.18,525.85,463.77.

(2)在室温下,将上述得到的中间体化合物(300mg,0.82mmol),溶于甲醇(5ml)中,然后加入催化量的5％钯/炭催化剂,用氢气置换烧瓶内空气，在室温下反应4h。反应完成后，用硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，用HPLC(甲醇∶水＝4∶6)对反应生成物实施纯化,得浅绿色固体产品Ia(164mg)，收率为72％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ8.03–7.95(m,1H),7.58(m,1H),7.45(m,1H),7.34(m,1H),4.67(m,0.3H,rotamer),4.45–4.37(m,0.7H),4.21(d,J＝16.7Hz,0.7H),4.14(d,J＝7.9Hz,0.4H,rotamer),3.99(m,0.8H),3.93(m,0.3H,rotamer),3.79–3.67(m,1.5H),3.36(m,0.8H,rotamer),2.39–2.27(m,1.1H,rotamer),2.13–1.96(m,3.2H).¹³C NMR(150MHz,D₂O)δ176.59(rotamer),176.34,173.05(rotamer),172.72,170.54,135.91,133.56–133.25,133.03,132.82–132.43,131.15–130.82,127.87(rotamer),127.62,60.51(rotamer),59.22,47.67,46.97(rotamer),40.11,29.12,28.74(rotamer),24.29,23.60(rotamer).IR(KBr):3422.96,2434.13,1397.00,1360.13,1159.64,1075.02,948.67,860.31,546.16,525.69,464.07.MS,m/z:276.10[M-H]^-

实施例2：化合物Ib的合成

(1)在室温条件下将邻羧基苯磺酸(360mg)溶于干燥的二甲基甲酰胺溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(384mg)和1-羟基苯并三唑(270mg)，搅拌15分钟，然后加入L-脯氨酸苄酯盐酸盐(532mg)和4-二甲氨基吡啶(805mg)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷稀释反应物，分别用饱和盐水、3M盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，得有机相溶剂用无水硫酸钠干燥，减压旋干，用HPLC(甲醇∶水＝5∶5)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品(404mg)，直接用于下一步还原反应。

(2)在室温下,将上述得到的化合物(300mg),溶于甲醇(5ml)中,然后加入催化量的5％钯/炭催化剂,用氢气置换烧瓶内空气，在室温下反应4h。反应完成后，用硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，用HPLC(甲醇∶水＝4∶6)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品Ib(164mg)，收率为72％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(600MHz,MeOD)δ7.93(d,J＝6.9Hz,0.7H),7.87(d,J＝7.8Hz,0.3H,rotamer),7.86–7.81(m,1H),7.79–7.70(m,0.5H,rotamer),5.16(m,0.3H,rotamer),4.87(m,0.7H),4.30–4.26(m,0.6H),4.13(m,0.6H),4.04–3.95(m,0.4H,rotamer),3.89(m,0.4H,rotamer),2.495(m,0.4H,rotamer),2.40–2.10(m,2.7H),2.00–1.95(m,0.8H,rotamer).MS,m/z:298.06[M-H]^-

实施例3：化合物Ic、Id的合成

(1)室温条件下,在反应瓶中加入邻磺酰胺苯甲酸(50mg，0.25mmol)于二氯亚砜(3ml)中，将体系升温至回流,反应2小时,低压去除二氯亚砜，把剩余物溶于干燥二氯甲烷中，在0℃条件下，将其加到L-脯氨酸苄酯盐酸盐(60mg,0.25mmol)的干燥二氯甲烷溶液中，然后加入三乙胺(56mg,0.55mmol)，反应液在室温下反应2小时。反应完成后，用二氯甲烷稀释反应物，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤，得有机相溶剂用无水硫酸钠干燥，减压旋干，使用硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)对反应生成物实施纯化,得目标产物中间体(55mg)，收率为57％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.95(d,J＝7.5Hz,0.7H),7.90(d,J＝7.5Hz,0.3H,rotamer),7.85(d,J＝7.8Hz,0.7H),7.73(t,J＝7.5Hz,0.9H),7.67(t,J＝7.6Hz,0.8H),7.61(t,J＝7.0Hz,0.3H,rotamer),7.41–7.27(m,5H),5.23(dd,J＝36.9,12.2Hz,1.6H),5.11(d,J＝11.8Hz,0.4H,rotamer),5.03–4.96(m,1H),4.30–4.23(m,0.7H),4.07(m,1H),3.97(m,0.3H,rotamer),2.47–2.11(m,3.2H),2.07(m,0.8H,rotamer).¹³C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.48,159.03,144.66,144.20(rotamer),135.36,134.54(rotamer),133.06,132.64,129.52–128.75,128.65,128.36,128.18,127.95(rotamer),125.03,123.81(rotamer),122.75,67.97(rotamer),67.46,63.89,61.24(rotamer),52.45(rotamer),49.70,32.41(rotamer),28.59,25.16,21.82(rotamer).IR(KBr):3422.10,1359.38,1158.96,1075.29,947.86,859.97,545.76,463.30.

(2)在室温下,将上述得到的化合物中间体(55mg,0.14mmol),溶于甲醇(5ml)中,然后加入催化量的5％钯/炭催化剂,用氢气置换烧瓶内空气，在室温下反应4h。反应完成后，用硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，用HPLC(甲醇∶水＝7∶13)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品(Ic)(34mg)，收率为82％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(600MHz,MeOD)δ8.15(d,J＝6.9Hz,0.5H),7.93(d,J＝6.9Hz,0.7H),7.89(d,J＝7.8Hz,0.3H,rotamer),7.86–7.79(m,1H),7.79–7.72(m,0.5H,rotamer),5.11(m,0.3H,rotamer),4.81(m,0.7H),4.35–4.26(m,0.6H),4.19(m,0.6H),4.04–3.98(m,0.4H,rotamer),3.89(m,0.4H,rotamer),2.49(m,0.4H,rotamer),2.44–2.14(m,2.7H),2.10–1.97(m,0.8H,rotamer).¹³C NMR(100MHz,MeOD)δ159.19,143.82,143.58(rotamer),132.90,127.98,126.13,125.32(rotamer),121.69,53.44(rotamer),52.37,49.87,31.96(rotamer),28.49,24.72,21.60(rotamer).IR(KBr):3424.69,2429.39,1795.93,1396.80,1359.91,1159.17,1075.32,948.66,860.32,546.11,463.62.MS,m/z:297.08[M‐H]^‐

(3)在室温条件下将上述得到的化合物(Ic)(60mg,)溶于干燥的四氢呋喃溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3‐(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(48mg)和1‐羟基苯并三唑(33mg)，搅拌15分钟，然后加入氨水(148μL)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，旋蒸除去溶剂，用硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品(Id)(40mg)，收率为65％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.07(m,0.8H),8.02–7.99(m,0.2H,rotamer),7.94–7.75(m,1H),7.75–7.65(m,1H),4.63–4.42(m,0.6H),4.50–4.34(m,0.3H,rotamer),3.73(m,0.5H,rotamer),3.70–3.49(m,1.5H),2.49–2.27(m,1.3H,rotamer),2.09–1.79(m,2.7H).MS,m/z:298.10[M+H]⁺

实施例4：化合物Ie的合成

采用与实施例1相同的方法，将起始原料换成间羧基苯磺酸，最终得到化合物Ie。白色固体，200mg，收率85％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.07(m,0.7H),8.00(dd,J＝18.7,5.7Hz,1H),7.91(m,0.3H,rotamer),7.81(d,J＝7.8Hz,0.7H,rotamer),7.71(m,1.3H),4.59(m,0.7H),4.40(m,0.3H),3.72(m,0.6H,rotamer),3.65–3.50(m,

1.4H),2.54–2.30(m,1H,rotamer),2.16–1.85(m,3H).MS,m/z:298.05[M-H]^-

实施例5：化合物If，Ig的合成

(1)室温条件下,在反应瓶中加入间羧基苯磺酰胺(365mg，1.93mmol)于二氯亚砜(5ml)中，将体系升温至回流,反应2小时,低压去除二氯亚砜，把剩余物溶于干燥二氯甲烷中，在0℃条件下，将其加到L-脯氨酸苄酯盐酸盐(483mg,2mmol)的干燥二氯甲烷溶液中，然后加入三乙胺(487mg,4.83mmol)，反应液在室温下反应2小时。反应完成后，用二氯甲烷稀释反应物，分别用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤，得有机相溶剂用无水硫酸钠干燥，减压旋干，使用硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)对反应生成物实施纯化,得白色固体中间体(402mg)，收率为54％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.06(s,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,0.7H),7.89–7.84(m,0.4H,rotamer),7.68(d,J＝7.6Hz,1H),7.52(q,J＝8.0Hz,0.8H),7.42(m,0.3H,rotamer),7.40–7.28(m,5H),5.20(dd,J＝32.0,12.3Hz,1.6H),5.02(dd,J＝37.8,12.1Hz,0.4H,rotamer),4.69(dd,J＝8.4,5.1Hz,0.8H),4.29(d,J＝6.4Hz,0.2H,rotamer),3.83–3.73(m,0.4H,rotamer),3.61(m,0.8H),3.55–3.42(m,0.8H),2.37–2.26(m,0.9H,rotamer),2.07–1.84(m,3.3H).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ170.91(rotamer),170.77,167.96(rotamer),167.17,141.81,136.34(rotamer),135.76,134.58,133.93(rotamer),129.92,129.35(rotamer),128.27,127.64,127.38,127.14,126.93,126.49(rotamer),124.24,123.54(rotamer),66.36(rotamer),66.02,60.49(rotamer),58.43,48.99,45.92(rotamer),28.66(rotamer),28.29,24.27,23.94(rotamer).IR(KBr):3422.57,1358.56,1159.60,1075.08,948.72,860.31,546.24,525.62,463.86.

(2)在室温下,将上述得到的中间体(300mg,1.01mmol),溶于甲醇(5ml)中,然后加入催化量的5％钯/炭催化剂,用氢气置换烧瓶内空气，在室温下反应4h。反应完成后，用硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，用HPLC(甲醇∶水＝7∶13)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品If(228mg)，收率为76％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.07(m,0.7H),8.03(dd,J＝18.7,5.7Hz,1H),7.91(m,0.3H,rotamer),7.84(d,J＝7.8Hz,0.7H,rotamer),7.72(m,1.3H),4.59(m,0.7H),4.40(m,0.3H),3.72(m,0.6H,rotamer),3.65–3.50(m,1.4H),2.54–2.30(m,1H,rotamer),2.16–1.85(m,3H).¹³C NMR(100MHz,D₂O)δ176.35(rotamer),175.94,170.76(rotamer),169.85,141.85,136.45(rotamer),135.95,131.36,130.83(rotamer),130.23(rotamer),130.03,128.01,127.60(rotamer),124.32,123.74(rotamer),62.36(rotamer),59.86,50.48,47.41(rotamer),31.08(rotamer),29.31,24.83,22.53(rotamer).IR(KBr):3423.72,1619.63,1397.74,1357.46,1159.68,1074.99,948.72,860.46,546.37,525.19,464.29.MS,m/z:297.08[M-H]^-

(3)在室温条件下将上述得到的化合物If(64mg,0.22mmol)溶于干燥的四氢呋喃溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(45mg,0.23mmol)和1-羟基苯并三唑(31mg,0.23mmol)，搅拌15分钟，然后加入氨水(148μL)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，旋蒸除去溶剂，用硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品Ig(40mg)，收率为63％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.07(m,0.8H),8.02–7.99(m,0.2H,rotamer),7.94–7.75(m,1H),7.75–7.65(m,1H),4.63–4.42(m,0.6H),4.50–4.34(m,0.3H,rotamer),3.73(m,0.5H,rotamer),3.70–3.49(m,1.5H),2.49–2.27(m,1.3H,rotamer),2.09–1.79(m,2.7H).¹³C NMR(100MHz,D₂O)δ176.84,176.62(rotamer),170.83(rotamer),170.05,141.81,136.30(rotamer),136.01,131.45,130.87(rotamer),130.24,129.98,129.71(rotamer),128.00,127.59,126.56(rotamer),124.42,123.68(rotamer),62.37(rotamer),60.75,50.80,47.84(rotamer),31.58(rotamer),30.12,24.87,22.67(rotamer).IR(KBr):3423.05,1397.86,1360.21,1158.84,1075.50,948.21,860.07,545.76,463.62.MS,m/z:298.10[M+H]⁺

实施例6：化合物Ih的合成

采用与实施例1相同的方法，将起始原料换成对羧基苯磺酸，最终得到化合物Ih。白色固体，180mg，收率78％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.07(m,0.7H),8.00(dd,J＝18.7,5.7Hz,1H),7.91(m,0.3H,rotamer),7.81(d,J＝7.8Hz,0.7H,rotamer),7.71(m,1.3H),4.59(m,0.7H),4.40(m,0.3H),3.72(m,0.6H,rotamer),3.65–3.50(m,1.4H),2.54–2.30(m,1H,rotamer),2.16–1.85(m,3H).MS,m/z:298.06[M-H]^-

实施例7：化合物Ii的合成

(1)在室温条件下将对磺酰胺苯甲酸(274mg,1.36mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(384mg,2mmol)和1-羟基苯并三唑(270mg,2mmol)，搅拌15分钟，然后加入L-脯氨酸苄酯盐酸盐(362mg,1.5mmol)和4-二甲氨基吡啶(580mg,4.75mmol)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，加入150ml蒸馏水，在4℃条件下静置过夜。然后过滤，所得白色固体即为目标产物中间体(412mg)，收率为78％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,二甲基亚砜)δ7.89(d,J＝8.1Hz,1.6H),7.80(d,J＝8.0Hz,0.4H,rotamer),7.68(d,J＝8.0Hz,1.5H),7.49(d,J＝5.8Hz,1.8H,rotamer),7.37(dd,J＝13.4,3.5Hz,3.2H),7.17(d,J＝6.8Hz,0.4H,rotamer),5.29–5.06(m,1.6H),5.01–4.90(m,0.4H,rotamer),4.55(m,0.8H),4.49(m,0.2H,rotamer),3.59(m,0.4H,rotamer),3.49(m,1.6H),2.32(m,1H,rotamer),2.08–1.67(m,3H).¹³C NMR(100MHz,二甲基亚砜)δ172.31(rotamer),171.99,168.57(rotamer),167.71,145.79,145.37(rotamer),140.33(rotamer),139.58,136.47,135.81(rotamer),130.47,129.51–128.11,128.11–128.10,128.10–127.90,127.61,126.61(rotamer),126.25,66.90(rotamer),66.39,61.04(rotamer),59.50,49.87,47.03(rotamer),31.49(rotamer),29.36,25.41,22.73(rotamer).IR(KBr):3422.89,1357.72,1160.04,1074.90,948.95,860.32,545.94,525.77,463.97.

(2)在室温下,将上述得到的化合物(311mg,0.8mmol),溶于甲醇(5ml)中,然后加入催化量的5％钯/炭催化剂,用氢气置换烧瓶内空气，在室温下反应4h。反应完成后，用硅藻土过滤，旋蒸除去溶剂，用HPLC(甲醇∶水＝1∶3)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品脱保护苯甲酸(191mg)，收率为80％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹HNMR(400MHz,CD₃OD)δ7.99(d,J＝8.1Hz,1.5H),7.94(d,J＝8.0Hz,0.5H,rotamer),7.72(d,J＝8.1Hz,1.5H),7.58(d,J＝8.1Hz,0.5H,rotamer),4.65–4.54(m,0.8H),4.40(m,0.2H,rotamer),3.72(m,0.4H,rotamer),3.65–3.45(m,1.6H),2.50–2.31(m,1H),2.17–1.86(m,3H).¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ173.97,172.74(rotamer)170.12(rotamer),169.08,145.35,144.94(rotamer),140.09(rotamer),139.46,127.41,127.08(rotamer),126.02,61.30(rotamer),59.34,51.52(rotamer),49.80,30.94(rotamer),29.18,24.81,22.20(rotamer).IR(KBr):3422.84,1396.70,1358.80,1160.01,1074.94,948.67,860.29,546.02,525.68,464.17.

(3)在室温条件下将上述得到的化合物(50mg,0.16mmol)溶于干燥的四氢呋喃溶液(10ml)当中，先后加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(34mg,0.18mmol)和1-羟基苯并三唑(24mg,0.18mmol)，搅拌15分钟，然后加入氨水(110μL)，反应液在室温下反应12小时。反应完成后，旋蒸除去溶剂，用硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)对反应生成物实施纯化,得白色固体产品Ii(25mg)，收率为53％。核磁检测显示产物为酰胺键旋转异构体混合物。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.02(d,J＝8.5Hz,1.4H),7.99(d,J＝8.5Hz,0.6H,rotamer),7.78(d,J＝8.5Hz,1.4H),7.61(d,J＝8.5Hz,0.6H,rotamer),4.57(dd,J＝8.2,6.1Hz,0.7H),4.41(dd,J＝8.0,3.8Hz,0.3H,rotamer),3.75(m,0.6H,rotamer),3.65–3.51(m,1.4H),2.49–2.33(m,1H),2.08–1.89(m,3H).¹³C NMR(100MHz,D₂O)δ176.84,176.64(rotamer),171.11(rotamer),170.37,143.09,142.83(rotamer),139.47(rotamer),139.20,127.91,127.40(rotamer),126.38(rotamer),126.25,62.28(rotamer),60.60,50.71,47.79(rotamer),31.85(rotamer),30.11,24.81,22.66(rotamer).IR(KBr):3422.47,1397.63,1360.08,1158.76,1075.44,947.92,859.90,545.28,463.66.MS,m/z:298.10[M+H]⁺

实施例8：酶抑制活性测试

以亚胺培南一水合物作为NDM-1的降解底物进行活性检测,该化合物含有一个β-内酰胺环的结构，同时含有O＝C-N-C＝C共轭结构，表明底物可产生紫外吸收。NDM-1可以水解亚胺培南的β-内酰胺环,导致共扼结构被破坏,从而使紫外吸收变弱。通过对比NDM-1与底物反应前后的全波长扫描紫外吸收光谱图,如果被测试化合物对NDM-1有抑制作用，使NDM-1不能够水解亚胺培南底物，从而阻止底物的紫外吸收值的降低，以此可以判断化合物对NDM-1是否具有抑制效果,从而进行NDM-1抑制剂药物的筛选。

NDM-1储备液浓度为50nM，体系缓冲液为30mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH7.3)，10μM的ZnCl2，10ug/mL BSA，使用500μM的亚胺培南，将不同浓度的被测试化合物10μL添加于测试体系中，37℃孵育15分钟，在300nM波长测试紫外吸收。

阳性对照为10μL的1mM乙二胺四乙酸-二甲基亚砜溶液；

阴性对照组为无蛋白和任何抑制剂添加的亚胺培南二甲基亚砜溶液。

NDM-1活性抑制率＝(A_300nm实验组-A_300nm阴性对照组)/(A_300nm阳性对照组-A_300nm阴性对照组)X100％。式中，A_300nm为测试溶液在300nm波长下的紫外吸收值。

(1)降解底物储备液的制备

将亚胺培南一水合物对照底物溶解在30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)中，配制成500μM的储备溶液用于实验。

(2)待测化合物溶液的制备

将待测化合物溶解在95％二甲基亚砜和5％双蒸水混合溶剂中，配制成100mM浓度的溶液，然后将配制好的溶液分别稀释成1mM，500μM，250μM，100μM，10μM，1μM，0.1μM，保存在4℃的冰箱中以备用。

(3)金属β-内酰胺酶NDM-1蛋白缓冲液的配制

将NDM-1溶解在蛋白缓冲液(pH＝6.8)中，配制成50nM的NDM-1蛋白缓冲液。缓冲液的成分包括30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10μM ZnCl₂和10μg/mL的小牛血清蛋白(BSA)。

(4)NDM-1抑制活性

取96微孔板，

在15个复孔中加入500μM的底物亚胺培南溶液(50μL)，

5个复孔作为阳性对照：10μL的1mM乙二胺四乙酸-二甲基亚砜溶液，

5个复孔为阴性对照组为无蛋白和任何抑制剂添加的亚胺培南(50μL，500μM)二甲基亚砜溶液，

加入上述配制好的不同浓度的待测化合物溶液(10μL)，每个浓度5个复孔，振荡，室温孵育1分钟。最后,向阳性对照组和测试组每孔加入500μM的底物亚胺培南溶液(50μL)进行反应。振荡，室温孵育15分钟。检测300nm紫外吸收。绘制NDM-1活性抑制率与样品浓度曲线，计算被测化合物对NDM-1抑制半数浓度IC50值。

表-1：被测化合物对NDM-1的半数抑制浓度

实施例9：临床耐药菌抑制活性测试

针对多种临床耐药菌株，将本发明脯氨酸衍生物分别与临床抗菌药物：头孢他啶以重量比1:2混合使用，与这些临床抗菌药物单独使用相比较，评价脯氨酸衍生物在恢复抗菌药物对耐药菌的抑菌效果。

1，细菌种类：以下前四个测定菌株均分离自临床患者，经微生物与分子生物学方法确认，后两个菌件购于ATCC，所有菌株均来自浙江大学传染病诊治国家重点实验室。

a)产ESBL大肠埃希菌2251(CTX-M-14)、大肠埃希菌3947(CTX-M-55)；

b)产ESBL肺炎克雷伯菌2661(CTX-M-15)、肺炎克雷伯菌2837(CTX-M-14)；

c)产ESBL、KPC酶标准菌株(肺炎克雷伯菌)ATCC70063(产ESBL)；

d)大肠埃希菌ATCC25922。

2，体外抗菌活性方法

体外抗菌活性测定按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)琼脂稀释法进行。

1)药物的溶解稀释

头孢他啶用灭菌水溶解，酶抑制剂(本发明脯氨酸衍生物，以下称酶抑制剂)用二甲基亚砜溶解。

首先将头孢他啶和酶抑制剂Ia-Ii分别配制成10mg/mL存储液。配制单药头孢他啶，取0.512mL抗菌药物配制成1mL溶液，取0.5mL加到20mL调好阳离子浓度的培养基中，即初始浓度为128mg/L,再加0.5mL水后混匀取出0.5mL溶液，以此类推，稀释到最后一个浓度0.06mg/L。配制酶抑制剂化合物和单药1:2的复方制剂，即酶抑制剂化合物Ia-Ii及它们分别与三种单药初始浓度比分别为64:128mg/L，先将单药按照以上方法配制，再将酶抑制剂化合物取0.256mL配制成1mL溶液，取0.5mL加到第一块培养基中，即初始浓度为64mg/L，按照单药方法倍比稀释。混匀冷却后备用。

2)细菌的接种、孵育

单克隆菌落制备0.5麦氏浓度的菌悬液，再进行1∶10稀释，加到96孔板中，用多点接种仪接种于琼脂平板表面。接种好后置35℃孵育16-20h，观察结果。

3)观察结果

以在琼脂平板上细菌开始不生长的平板药物浓度作为最低抑菌浓度即MIC。

表-2：被测化合物与头孢他啶(caz)联合抑菌测试结果

实验证明，实施例1-7脯氨酸衍生物的医学上容许的盐具有β-内酰胺酶抑制作用。

实施例1-7脯氨酸衍生物的溶剂化物具有β-内酰胺酶抑制作用。

实施例1-7脯氨酸衍生物与医学上容许的载体组成的组合物具有β-内酰胺酶抑制作用。

经活性测试证明，本发明的各实施例的脯氨酸衍生物对β-内酰胺酶，特别是对NDM-1具有较好的抑制作用。本发明L-脯氨酸衍生物可以通过抑制对β-内酰胺酶，特别是NDM-1活性,减少甚至消除NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解,缓解NDM-1引起的耐药性,恢复抗生素对细菌的疗效,从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染,具有良好的药物应用前景。

Claims

1.脯氨酸衍生物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途，其特征是所述脯氨酸衍生物用式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征是用式(I)结构为：

3.权利要求1或2的脯氨酸衍生物的医学上容许的盐在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

4.权利要求1或2的脯氨酸衍生物与医学上容许的载体组成的组合物在制备β-内酰胺酶抑制剂中的用途。