CN108486173A - 一种α-酮戊二酸的制备方法 - Google Patents

一种α-酮戊二酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种α‑酮戊二酸的制备方法，属于生物工程技术领域，该方法包括发酵生产和提取，所述发酵生产是将大肠杆菌于发酵培养到OD660nm生长到10~20，向发酵培养基中添加乳糖继续诱导培养，离心收集湿菌体；以L‑谷氨酸或L‑谷氨酸盐、硫酸锰、过氧化氢酶和湿菌体组成转化体系，调整转化体系的pH值为4‑8，在温度为20~40℃、转速为100‑400rpm和风量为10~25L/min的条件下转化20‑30h，得转化液；所述提取是将转化液经过滤、纯化、脱色、浓缩和结晶得α‑酮戊二酸。本发明主要优化发酵和转化条件，缩短生产周期，提高α‑酮戊二酸的产量和收率，适合工业上的放大性生产。

Description

一种α-酮戊二酸的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种α-酮戊二酸的制备方法。
背景技术
α-酮戊二酸( 2-Ketoglutaric acid )，又称2-氧代戊二酸，是一种重要的生物分子，是三羧酸循环中重要的中间产物之一，是氮的输送体和分子氧化中的共生物质。在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基酸，蛋白质的重要前体物质。用于营养强化剂，作为运动营养饮料的成分，有机中间体，生化试剂和测肝功能的配套试剂，体格增强补剂等。此外，α-酮戊二酸和精氨酸可制备1:1和1:2的精酮合剂。
现有α-酮戊二酸的生产工艺基本是以化学合成法和生物发酵法为主。化学合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。例如张国基(中国发明专利申请公开号CN102584568A )以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯为原料，在甲醇钠存在的条件下，合成中间体2 ,2-二氯戊二酸二甲酯，再与碱溶液反应得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸产品。化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境污染严重，不适合于工业化生产，不能满足市场的需求。相对于化学合成法，生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境无污染等特点。但是，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本偏高。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种α-酮戊二酸的制备方法，该方法利用大肠杆菌发酵生产α-酮戊二酸，通过严格控制发酵和转化条件，缩短生产周期，提高α-酮戊二酸的产量，进一步通过优化提取方法提高α-酮戊二酸的收率，降低生产成本。
一种α-酮戊二酸的制备方法，包括发酵生产和提取，所述发酵生产是将大肠杆菌于发酵培养基中发酵培养到OD660nm生长到10~20，向发酵培养基中添加乳糖继续诱导培养5-15h，离心收集湿菌体；以50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量组成转化体系，调整转化体系的pH值为4-8，在温度为20~40℃、转速为100-400rpm和风量为10~25L/min的转化条件下转化20-30h，发酵生产α-酮戊二酸，得转化液；
所述提取是将转化液经过滤、纯化、脱色、浓缩和结晶得到α-酮戊二酸。
进一步的，所述大肠杆菌为E.coli BL21大肠杆菌。
进一步的，所述大肠杆菌的发酵培养是将种子液接种到发酵培养基中，接种量为发酵培养体积的5-15%；初始发酵温度30~38℃，罐压0.01-0.15Mpa，空气流量1-8L/min，搅拌速度200~800r/min，溶氧维持在10-30%。
更进一步的，所述发酵培养基中包括：20~30g/L葡萄糖、10~20g/L K2HPO4、MgSO4·7H2O、0.5~3.0g/L酵母粉和5~10.0g/L (NH4)2SO4。
进一步的，所述向发酵培养基中添加乳糖后发酵培养基中乳糖的浓度为5-10g/L。
进一步的，所述向发酵培养基中添加乳糖后发酵培养基中乳糖的浓度为0.1-3g/L。
进一步的，所述提取的具体步骤为：调节转化液的pH至2~5，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗，得上清液Ⅰ；取上清液Ⅰ过5000~10000分子量的中空纤维束膜，得上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ过强酸性阳离子交换树脂进行吸附纯化，收集得上清液Ⅲ；将上清液Ⅲ按其体积的0.5~1%加入活性炭，60℃条件下脱色0.5~2h，过滤除炭，收集过滤液；将过滤液进行真空浓缩，按照下列条件进行：真空度0.1Mpa、旋转速100-200rpm和温度50℃-80℃浓缩，得浓缩液；将浓缩液降温结晶，得α-酮戊二酸。
更进一步的，所述吸附纯化为静态吸附，即按照上清液Ⅱ体积的20%加入阳离子交换树脂，搅拌吸附1h。
更进一步的，所述吸附纯化为动态吸附，即按照上清液Ⅱ体积的15%装柱树脂，以2BV/h的流速进料，末期用0.5~1BV/h的水冲柱。
本发明的有益效果：
1、本发明利用大肠杆菌发酵生产α-酮戊二酸，大肠杆菌发酵为好氧发酵，菌体生长快，繁殖周期短；通过严谨的发酵、诱导和转化条件，促进谷氨酸或谷氨酸盐脱氨产生α-酮戊二酸，整个过程协同作用，密切配合，显著提高了α-酮戊二酸的产率；因为微生物发酵生产过程复杂多变，影响因素较多，任何微小的变化都可能产生截然不同的结果，而工业化大生产中，这种影响又被无规则放大，本发明同时对发酵及转化条件进行创造性优化，过程简单，易于控制，非常适合工业上的放大性生产。
2、本发明所述α-酮戊二酸的制备方法中，在大肠杆菌发酵生长至稳定期时，加入乳糖继续诱导，使菌体内积累较多的L-谷氨酸氧化酶，为下一步的转化做充足的准备条件，经转化后α-酮戊二酸的产量显著提高；进一步采用本发明所述的提取方法，提取收率为70.0~88.5%，较现有技术有明显提高。综合以上，本发明所述方法具有发酵和转化周期短、酮戊二酸的产量和得率高、单位菌体酮戊二酸催化水平高的优点。
具体实施方式
一种α-酮戊二酸的制备方法，具体步骤如下：
接种大肠杆菌菌株到种子培养基上，置于生化培养箱内37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单菌落分别接种到种子培养基上，生化培养箱30~36℃培养12h左右。接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~15h；当OD660nm值长到5.0~15.0时，形成种子液。将种子液接种到装有发酵培养基的500mL发酵瓶中，接种量：发酵瓶内发酵培养基体积的5-15%；培养条件： 温度30~38℃、摇床转速200-800rmp、罐压0.01-0.15Mpa、空气流量1-8L/min，溶氧维持在10-30%；待OD660nm长到10~20时，添加5~10g/L或0.1-3g/L的乳糖诱导5-15h。结束后分别收集湿菌体，冻融；按照转化体系进行转化20~30h，所述转化体系包括50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量，pH值为4-8；将上述得到的两种浓度乳糖诱导的湿菌体分别进行转化，转化条件为：温度20~40℃、转速100-400rpm和风量10~25L/min，使得L-谷氨酸或L-谷氨酸盐在湿菌体内的L-谷氨酸氧化酶的作用下脱去氨基，转化结束后得两种转化液。利用高效液相色谱检测转化液内α-酮戊二酸含量。
将所得到的转化液，用2mo1/L硫酸调节pH至2~5范围内，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2~3次，得到上清液,取上清液过5000~10000分子量的中空纤维束膜，此时酮戊二酸回收率为95.3~98.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为静态吸附：按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附：按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5~1BV水冲柱；收集上清液。将上清液按体积比0.5~1%加入活性炭60℃脱色0.5~2h，过滤除炭。收集得到酮戊二酸上清液进行真空浓缩，按照下列条件进行:真空度-0.1MPa，旋转速度100~200rpm，温度50℃~80℃浓缩。将酮戊二酸浓缩液进行降温结晶，得α-酮戊二酸。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
从新鲜斜面培养基上挑取大肠杆菌菌落接种到添加有带氨苄青霉素钠抗性种子培养基的500mL种子瓶中进行培养，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~8h；当OD660nm值长到5.0~15.0时，得种子液。将种子液分别以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中进行二级种子培养，培养条件为：温度30~36℃、罐压0.01~0.05Mpa、空气流量1~8L/min、搅拌速度200~800r/min，溶氧维持在10~30%，pH值控制在7.0~7.2之间，培养时间为5-8h，得二级种子液。将二级种子液以10%接种量接入装有18L发酵培养基的30L全自动发酵罐中进行产酸发酵。发酵条件：温度30~36℃、罐压0.01~0.15Mpa、空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min，溶氧维持在10~30%，发酵pH值控制在7.0~7.2之间，待OD660nm长到10~20时，添加5g/L的乳糖诱导，继续培养5-15h，收集湿菌体冻融，按照转化体系进行转化20~30h，所述转化体系包括50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量，pH值为4-8；转化条件为：温度20~40℃、转速100-400rpm和风量10~25L/min。使得L-谷氨酸或L-谷氨酸盐在湿菌体内的L-谷氨酸氧化酶的作用下脱去氨基，转化结束后得转化液。利用高效液相色谱检测转化液中酮戊二酸含量为110.23g/L。
其中，所述种子培养基中所含成分及对应浓度：葡萄糖20-30g/L、K2HPO4 10-20g/L、MgSO4·7H2O 0.5-3.0g/L、KH2PO4 10~20g/L、酵母粉0.5~5.0g/L和(NH4)2SO4 5~10.0g/L，pH 6.7左右；
所述发酵培养基中所含成分及对应浓度：葡萄糖20~30g/L、K2HPO4 10-20g/L、MgSO4·7H2O 0.5-3.0g/L、 酵母粉0.5-3.0g/L和(NH4)2SO4 5~10.0g/L，初始pH 7.0左右。
实施例2
种子液制备、发酵和转化步骤均与实施例2相同，不同在于种子瓶中添加的种子培养基中未添加氨苄青霉素钠抗性。利用高效液相色谱检测转化液中酮戊二酸含量为42.87g/L。
实施例3
接种大肠杆菌菌株到种子培养基上，置于生化培养箱内37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单菌落接种到种子培养基上，生化培养箱30~36℃培养12h左右。接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~15 h；当OD660nm值长到5.0~15.0时，形成种子液。将种子液接种到装有发酵培养基的500mL发酵瓶中，接种量：发酵瓶内发酵培养基体积的7%；培养条件： 温度30~36℃、摇床转速200rmp、罐压0.01-0.15Mpa、空气流量1-8L/min，溶氧维持在10-30%；待OD660nm长到10~20时，添加10g/L的乳糖诱导6-12h。结束后分别收集湿菌体，冻融；按照转化体系进行转化20~30h，所述转化体系包括50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量，pH值为4-8；将上述得到的两种浓度乳糖诱导的湿菌体分别进行转化，转化条件为：温度20~40℃、转速100-400rpm和风量10~25L/min，使得L-谷氨酸或L-谷氨酸盐在湿菌体内的L-谷氨酸氧化酶的作用下脱去氨基，转化结束后得转化液。利用高效液相色谱检测转化液内α-酮戊二酸含量为21.77g/L。
实施例4
接种大肠杆菌菌株到种子培养基上，置于生化培养箱内37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单菌落接种到种子培养基上，生化培养箱30~36℃培养12h左右。接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度30~36℃、摇床转速200rmp、培养时间6~15 h；当OD660nm值长到5.0~15.0时，形成种子液。将种子液接种到装有发酵培养基的500mL发酵瓶中，接种量：发酵瓶内发酵培养基体积的7%；培养条件： 温度30~36℃、摇床转速200rmp、罐压0.01-0.15Mpa、空气流量1-8L/min，溶氧维持在10-30%；待OD660nm长到10~20时，添加0.1g/L的乳糖诱导6-12h。结束后分别收集湿菌体，冻融；按照转化体系进行转化20~30h，所述转化体系包括50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量，pH值为4-8；将上述得到的经乳糖诱导的湿菌体分别进行转化，转化条件为：温度20~40℃、转速100-400rpm和风量10~25L/min，使得L-谷氨酸或L-谷氨酸盐在湿菌体内的L-谷氨酸氧化酶的作用下脱去氨基，转化结束后得转化液。利用高效液相色谱检测转化液内α-酮戊二酸含量为16.98g/L。
其中，所述种子培养基中所含成分及对应浓度：葡萄糖20-30g/L、K2HPO4 10-20g/L、MgSO4·7H2O 0.5-3.0g/L、KH2PO4 10~20g/L、酵母粉0.5~5.0g/L和(NH4)2SO4 5~10.0g/L，pH 6.7左右；
所述发酵培养基中所含成分及对应浓度：葡萄糖20~30g/L、K2HPO4 10-20g/L、MgSO4·7H2O 0.5-3.0g/L、 酵母粉0.5-3.0g/L和(NH4)2SO4 5~10.0g/L，初始pH 7.0左右。
实施例5
将实施例1-4所得到的转化液，用2mo1/L硫酸调节pH至2~5范围内，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2~3次，得到上清液,取上清液过5000~10000分子量的中空纤维束膜，此时酮戊二酸回收率为95.3~98.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为静态吸附：按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附：按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5~1BV水冲柱；收集上清液。将上清液按体积比0.5~1%加入活性炭60℃脱色0.5~2h，过滤除炭。收集得到酮戊二酸上清液进行真空浓缩，按照下列条件进行:真空度-0.1MPa，旋转速度100~200rpm，温度50℃~80℃浓缩。将酮戊二酸浓缩液进行降温结晶。所得α-酮戊二酸成品的提取收率为70.0~88.5%。
需要说明的是，上述实施例仅为说明性的，并不以此限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种α-酮戊二酸的制备方法，包括发酵生产和提取，其特征在于：所述发酵生产是将大肠杆菌于发酵培养基中发酵培养到OD660nm生长到10~20，向发酵培养基中添加乳糖继续诱导培养5-15h，离心收集湿菌体；以50~150g/L L-谷氨酸或L-谷氨酸盐、0.1~1.0g/L硫酸锰、5ml/L过氧化氢酶和20g/L湿菌体量组成转化体系，调整转化体系的pH值为4-8，在温度为20~40℃、转速为100-400rpm和风量为10~25L/min的转化条件下转化20-30h，发酵生产α-酮戊二酸，得转化液；
所述提取是将转化液经过滤、纯化、脱色、浓缩和结晶得到α-酮戊二酸。
2.如权利要求1所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌的发酵培养是将种子液接种到发酵培养基中，接种量为发酵培养体积的5-15%；初始发酵温度30~38℃，罐压0.01-0.15Mpa，空气流量1-8L/min，搅拌速度200~800r/min，溶氧维持在10-30%。
4.如权利要求3所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基中包括：20~30g/L葡萄糖、10~20g/L K2HPO4、MgSO4·7H2O、0.5~3.0g/L酵母粉和5~10.0g/L(NH4)2SO4。
5.如权利要求1所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述向发酵培养基中添加乳糖后发酵培养基中乳糖的浓度为5-10g/L。
6.如权利要求1所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述向发酵培养基中添加乳糖后发酵培养基中乳糖的浓度为0.1-3g/L。
7.如权利要求1所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述提取的具体步骤为：调节转化液的pH至2~5，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗，得上清液Ⅰ；取上清液Ⅰ过5000~10000分子量的中空纤维束膜，得上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ过强酸性阳离子交换树脂进行吸附纯化，收集得上清液Ⅲ；将上清液Ⅲ按其体积的0.5~1%加入活性炭，60℃条件下脱色0.5~2h，过滤除炭，收集过滤液；将过滤液进行真空浓缩，按照下列条件进行：真空度0.1Mpa、旋转速100-200rpm和温度50℃-80℃浓缩，得浓缩液；将浓缩液降温结晶，得α-酮戊二酸。
8.如权利要求7所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述吸附纯化为静态吸附，即按照上清液Ⅱ体积的20%加入阳离子交换树脂，搅拌吸附1h。
9.如权利要求7所述的一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于：所述吸附纯化为动态吸附，即按照上清液Ⅱ体积的15%装柱树脂，以2BV/h的流速进料，末期用0.5~1BV/h的水冲柱。
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