CN106381316A - 一种α‑酮戊二酸钠的制备方法及提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种α‑酮戊二酸钠的制备方法及提纯方法，所述制备方法包括将2~4 U/mL LOGX、100~120 g/L L‑谷氨酸钠、350~370 U/mL H2O2酶、2~4 mmol/L MnCl2于pH 6~7、温度30℃~40℃下转化8~12 h，得到含所述α‑酮戊二酸钠的转化液。本发明的制备方法利用L‑谷氨酸氧化酶转化L‑谷氨酸钠来制备α‑酮戊二酸钠，100~120 g/L L‑谷氨酸钠可获得100 g/L~110g/L α‑酮戊二酸钠，转化率可高达88%以上。本发明的α‑酮戊二酸钠的提纯方法，具有回收率高、提取简单、环境友好等优点，α‑酮戊二酸钠的回收率达81%以上，纯度99%以上。

Description

一种α-酮戊二酸钠的制备方法及提纯方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种α-酮戊二酸钠的制备方法及提纯方法，具体涉及一种利用谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸钠的方法及α-酮戊二酸钠的提纯方法。
背景技术
α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循环和氨基酸代谢中重要的二元酸，能为人体和动物提供营养，在医药、食品、精细化工等领域广泛应用。α-KG主要生产方法有三种：化学、微生物发酵法、酶法。化学法存在使用有风险的化学品如氰化物、产生有毒废物、由不同副产物如甘氨酸和其他有机酸引起的低产品分离度和处理难度的提高等问题，制约着α-KG的可持续发展。通过菌株筛选、过程优化和代谢工程改造，发酵法生产α-KG已经有了很大进展。微生物发酵法生产a-KG的菌种包括：荧光假单胞菌（Pesudomonas fluorescens）、沙雷氏菌（Serratia marcescens）、石蜡节杆菌（Arthrobacter paraffineus）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等细菌；以及光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）、解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica）等真菌。光滑球拟酵母以葡萄糖为碳源，发酵64 h后α-KG积累达到43.7 g/L；以廉价甘油为碳源Y. lipolytica发酵117 h产生186 g/L α-KG然而，由于存在发酵周期长、杂酸副产物过多、下游产品分离纯化困难等诸多制约产业化的瓶颈问题，导致目前还未见发酵法工业化生产α-KG。
L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase, LOGX）能够专一性地氧化谷氨酸钠生成α-KG钠。这一催化反应具有：反应条件温和、底物特异性高、催化效率高等优点，目前已经在工业化生产，但是有关α-KG钠的提取鲜有文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种α-酮戊二酸钠的制备方法。
本发明还提供一种转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种α-酮戊二酸钠的制备方法，所述制备方法包括将2~4 U/mL LOGX、 100~120 g/LL-谷氨酸钠、350~370 U/mL H2O2酶、2~4 mmol/L MnCl2于pH 6~7、温度30℃~40℃下转化8~12 h，得到含所述α-酮戊二酸钠的转化液。
进一步地，1L转化体系添加3 U/mL LOGX、115 g/L L-谷氨酸钠、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/L MnCl2，控制pH 6.5，反应温度35℃，搅拌转速400 rpm，转化10h，得到含α-酮戊二酸钠的转化液。
进一步地，所述转化液中α-酮戊二酸钠的浓度为100 g/L ~110g/L。
本发明采取的另一种技术方法：一种转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，所述转化液为上述α-酮戊二酸钠的制备方法所得到的转化液，所述提纯方法包括将所述转化液依次通过脱色处理、离子交换处理、酸洗、碱中和、结晶的步骤。
进一步地，所述脱色处理使用的脱色物质为活性炭或122树脂。
更进一步地，所述脱色物质122树脂，所述脱色处理具体实施为：将122树脂置于层析柱中制成脱色柱，转化液以流量70~90mL/h经脱色柱脱色。
进一步地，所述离子交换处理使用的离子交换树脂为强碱凝胶型树脂或弱碱性吸附树脂。
更进一步地，所述强碱凝胶型树脂为201x7树脂，所述弱碱性吸附树脂为D302树脂。
进一步地，所述结晶采用的结晶溶剂为甲醇或无水乙醇。
更进一步地，所述提纯方法还包括结晶处理后的物料进行过滤、干燥，得到所述α-酮戊二酸钠纯品，其中，所述干燥采用50℃~70℃温度真空干燥。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的制备方法利用L-谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠来制备α-酮戊二酸钠，100~120 g/L L-谷氨酸钠可获得100 g/L ~110g/L α-酮戊二酸钠，转化率可高达88%以上。
本发明的α-酮戊二酸钠的提纯方法，具有回收率高、提取简单、环境友好等优点，α-酮戊二酸钠的回收率达81%以上，纯度99%以上。
附图说明
图1为实施例1的转化液中α-KG钠标准样品高效液相色谱检测图；
图2为实施例1的α-KG钠纯化样品高效液相色谱检测。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种利用谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸钠的方法，该制备方法为：1L转化体系添加3 U/mL LOGX、115 g/L L-谷氨酸钠、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/LMnCl2，控制pH 6.5，反应温度35℃，搅拌转速400 rpm，转化10 h停止转化放罐，制得含α-KG钠的转化液。使用高效液相色谱检测此时转化液中α-KG钠浓度为100 g/L ~110g/L，图谱如图1所示。
对上述转化液中的α-KG钠进行提纯处理，该提纯方法包括以下步骤：
（1）在流动情况下，将122树脂100mL装于D16 mm×600 mm 的层析柱中，制成脱色柱。取200 mL转化液过脱色柱，上柱体积流量为80 mL/h，进行动态洗脱，收集脱色液。
（2）将弱碱性吸附树脂D302 130 mL装于D16 mm×600 mm层析柱，将脱色后的转化液上柱交换，树脂饱和后用纯化水洗去柱中残留的转化液，再使用0.05 mol/L HCl 洗去柱子中吸附氨基酸、蛋白质、小肽等杂质，以0.3 mol/L盐酸洗脱目标产物α-KG钠，收集洗脱液。
（3）洗脱液预先用NaOH溶液调节pH至7.0左右，3倍体积无水乙醇缓慢加入，边添加边搅拌得到α-KG钠结晶液。真空抽滤使固液分离，湿晶体在60℃条件下真空干燥，既得到α-KG钠纯品。
高效液相色谱检测对纯化的样品进行检测，图谱如图2所示。
通过上述步骤，产品浓缩倍数和纯度高、能耗低、操作简便、产品质量高等优点，最终α-KG钠的回收率达到94.7%，样品纯度为99.2%。
实施例2
本实施例提供一种利用谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸钠的方法，该制备方法为：1L转化体系添加3 U/mL LOGX、115 g/L L-谷氨酸钠、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/LMnCl2，控制pH 6.5，反应温度35℃，搅拌转速400 rpm，转化10 h停止转化放罐，制得含α-KG钠的转化液。使用高效液相色谱检测此时转化液中α-KG钠浓度为100 g/L ~110g/L。
对上述转化液中的α-KG钠进行提纯处理，该提纯方法包括以下步骤：
（1）在流动情况下，将122树脂100 mL装于D16 mm×600 mm 的层析柱中，制成脱色柱。取200 mL转化液过脱色柱，上柱体积流量为80 mL/h，进行动态洗脱，收集脱色液。
（2）将强碱凝胶型树脂201x7 130 mL装于D16 mm×600 mm层析柱，将脱色后的转化液上柱交换，树脂饱和后用纯化水洗去柱中残留的转化液，再使用0.05 mol/L HCl 洗去柱子中吸附的氨基酸、蛋白质、小肽等杂质，以0.3 mol/L盐酸洗脱目标产物α-KG钠，收集洗脱液。
（3）洗脱液预先用NaOH溶液调节pH至7.0左右，缓慢加入4倍体积甲醇，边添加边搅拌得到α-KG钠结晶液。真空抽滤使固液分离，湿晶体在60℃条件下真空干燥，既得到α-KG钠纯品。
通过上述步骤，结晶样品成色好，最终α-KG钠的回收率达到81.2%，样品纯度为99.0%。
实施例3
本实施例提供一种利用谷氨酸氧化酶转化L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸钠的方法，该制备方法为：1L转化体系添加3 U/mL LOGX、115 g/L L-谷氨酸钠、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/LMnCl2，控制pH 6.5，反应温度35℃，搅拌转速400 rpm，转化10 h停止转化放罐，制得含α-KG钠的转化液。使用高效液相色谱检测此时转化液中α-KG钠浓度为100 g/L ~110g/L。
对上述转化液中的α-KG钠进行提纯处理，该提纯方法包括以下步骤：
（1）将1%的活性炭加入转化液中，搅拌均匀，30℃恒温脱色20min，脱色结束抽滤得滤液。
（2）将强碱凝胶型树脂201x7 130 mL装于D16 mm×600 mm层析柱，将脱色后的转化液上柱交换，树脂饱和后用纯化水洗去柱中残留的转化液，再使用0.05 mol/L HCl 洗去柱子中吸附氨基酸、蛋白质、小肽等杂质，以0.3 mol/L盐酸洗脱目标产物α-KG钠，收集洗脱液。
（3）洗脱液预先用NaOH溶液调节pH至7.0左右，缓慢加入3倍体积无水乙醇，边添加边搅拌得到α-KG钠结晶液。真空抽滤使固液分离，湿晶体在60℃条件下真空干燥，既得到α-KG钠纯品。
通过上述步骤，活性炭脱色效果好，最终α-KG钠的回收率达到81.7%，样品纯度为98.3%。
α-KG钠含量的测定方法
使用高效液相色谱检测转化液中α-KG钠。
色谱条件：
色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column；
流动相：5 mmol/L 硫酸溶液；
柱温：35℃；
检测波长：210 nm；
进样量：10 μL
流速：0.8ml/min。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种α-酮戊二酸钠的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将2~4 U/mL LOGX、100~120 g/L L-谷氨酸钠、350~370 U/mL H2O2酶、2~4 mmol/L MnCl2于pH 6~7、温度30℃~40℃下转化8~12 h，得到含所述α-酮戊二酸钠的转化液。
2.根据权利要求1所述的α-酮戊二酸钠的制备方法，其特征在于：1L转化体系添加3 U/mL LOGX、 115 g/L L-谷氨酸钠、360 U/mL H2O2酶、3 mmol/L MnCl2，控制pH 6.5，反应温度35℃，搅拌转速400 rpm，转化10h，得到含α-酮戊二酸钠的转化液。
3.根据权利要求1所述的α-酮戊二酸钠的制备方法，其特征在于：所述转化液中α-酮戊二酸钠的浓度为100 g/L ~110g/L。
4.一种转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，所述转化液为权利要求1~3中任一项权利要求所述α-酮戊二酸钠的制备方法所得到的转化液，其特征在于：所述提纯方法包括将所述转化液依次通过脱色处理、离子交换处理、酸洗、碱中和、结晶的步骤。
5.根据权利要求4所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述脱色处理使用的脱色物质为活性炭或122树脂。
6.根据权利要求5所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述脱色物质122树脂，所述脱色处理具体实施为：将122树脂置于层析柱中制成脱色柱，转化液以流量70~90mL/h经脱色柱脱色。
7.根据权利要求4所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述离子交换处理使用的离子交换树脂为强碱凝胶型树脂或弱碱性吸附树脂。
8.根据权利要求7所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述强碱凝胶型树脂为201x7树脂，所述弱碱性吸附树脂为D302树脂。
9.根据权利要求4所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述结晶采用的结晶溶剂为甲醇或无水乙醇。
10.根据权利要求4或9所述的转化液中α-酮戊二酸钠的提纯方法，其特征在于：所述提纯方法还包括结晶处理后的物料进行过滤、干燥，得到所述α-酮戊二酸钠纯品，其中，所述干燥采用50℃~70℃温度真空干燥。
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