CN104109698A - 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，包括步骤：在过氧化氢清除剂的存在下，用L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行催化氧化反应，从而生成α-酮戊二酸。该方法具有生产周期短、产品浓度和收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种酶法生产α-酮戊二酸的方法。
背景技术
α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid，α-KG)是一种重要的生物化合物。它是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，并且是三羧酸循环的中间产物，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸在食品、医药、精细化工以及饲料行业有着广泛的用途。特别地，摩尔比为1：1的L-精氨酸α-酮戊二酸盐和摩尔比为2：1的L-精氨酸α-酮戊二酸盐是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用作增强体格、促进肌肉的快速增长和恢复、促进肝细胞对营养和能量的吸收、维护肝功能正常等。
现有α-酮戊二酸的生产工艺基本是以化学合成法和生物发酵法为主。
化学合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。例如张国基(中国发明专利申请公开号CN102584568A)以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯为原料，在甲醇钠存在的条件下，合成中间体2,2-二氯戊二酸二甲酯，再与碱溶液反应得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸产品。
化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好。
相对于化学合成法，生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等特点。国内对此研究较多，并申请了一系列的专利。江南大学的陈坚等人(中国发明专利申请公开号CN101245323A)利用重组菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵时长48-72h，α-酮戊二酸产量达到18.6g/L；另一篇专利中(中国发明专利申请公开号CN101717735A)经过工艺和菌种的改进，α-酮戊二酸产量达到31.7g/L；在经过进一步的改进后(中国发明专利申请公开号CN102586128A)，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，发酵时长144h。天津科技大学的陈宁等人(中国发明专利申请公开号CN102391977A)利用谷氨酸棒杆菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L。
但是，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本还是偏高。而生物酶法能很好地弥补发酵法的缺陷，极大地提高产品浓度、简化提取工艺、降低成本。Long Liu等人(Long Liu,G S Hossain,et al.Journal of Biotechnology,2013,164:97-104)以L-谷氨酸为底物，利用L-氨基酸脱氨酶脱去氨基生成α-酮戊二酸，但其产量偏低，只有不到12.6g/L，而且反应存在产物抑制作用，目前还难以工业化。
综上所述，本领域迫切需要开发新的高效生产α-酮戊二酸的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法生产α-酮戊二酸的方法。该方法具有生产周期短、产品浓度和收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。
本发明第一方面提供一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，包括步骤：在过氧化氢清除剂的存在下，用L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行催化氧化反应，从而生成α-酮戊二酸。
在另一优选例中，按L-谷氨酸或其盐(原料)计，α-酮戊二酸的摩尔转化率≥60%,较佳地≥70%，更佳地≥80%(如80-95%)。
在另一优选例中，在未经浓缩的情况下，所述催化氧化反应所产生的反应产物中，α-酮戊二酸的浓度≥30g/L，较佳地≥100g/L。
在另一优选例中，在反应体系中，所述的催化氧化反应不受或基本上不受产物(α-酮戊二酸)的抑制。
在另一优选例中，反应体系中，L-谷氨酸或其盐(原料)的浓度(包括累积添加L-谷氨酸或其盐)为≥50g/L，较佳地100g/L-200g/L。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶来源于原核或真核生物。
在另一优选例中，所述的L-谷氨酸氧化酶来源于细菌、放线菌、或真菌。
在另一优选例中，所述的L-谷氨酸氧化酶来源于链霉菌和孢菌，较佳地来源于选自下组的菌株：链霉菌X-119-6、链霉菌Z-11-6、浅紫链霉菌、内涂链霉菌、普拉特链霉菌、生二素链霉菌、刚毛北里孢菌和吸水链霉菌。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶具有下组中的一个或多个特性：
(a)比酶活为5U/mg以上；
(b)最适pH为6.0-8.0；
(c)以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶是纯化形式的、未纯化形式的(如初步纯化的L-谷氨酸氧化酶、发酵液、裂解液)、固定化的或未固定化的L-谷氨酸氧化酶。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶以产生所述L-谷氨酸氧化酶活性的微生物形式加入，或者以产生所述L-谷氨酸氧化酶活性的微生物的处理物形式加入。
在另一优选例中，所述的L-谷氨酸氧化酶为固定化L-谷氨酸氧化酶。
在另一优选例中，所述固定化L-谷氨酸氧化酶包括载体以及固定于所述载体的L-谷氨酸氧化酶。
在另一优选例中，所述载体包括氨基类载体、环氧类载体。
在另一优选例中，所述处理物(或裂解物)包括对所述微生物进行机械破坏、超声波处理、冻结融解处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自身消化、表面活性剂处理或酶处理而得到的物质。
在另一优选例中，所述处理物为含L-谷氨酸氧化酶的细胞裂解液。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸盐包括L-谷氨酸碱金属盐、L-谷氨酸碱性氨基酸盐、L-谷氨酸铵盐、或其组合。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸碱金属盐包括L-谷氨酸钠、L-谷氨酸钾、或其组合。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸碱金属盐通过L-谷氨酸与碱金属氢氧化物反应生成。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸碱性氨基酸盐通过L-谷氨酸与碱性氨基酸(如精氨酸)反应生成。
在另一优选例中，所述过氧化氢清除剂包括过氧化氢酶、二氧化锰或其组合。
在另一优选例中，所述方法还包括向反应中通入氧气或空气的步骤。
在另一优选例中，所述催化氧化反应为液相反应，较佳地在水中进行。
在另一优选例中，所述反应在发酵罐进行。
在另一优选例中，所述氧气或空气的通入量为0.5-2vvm。
在另一优选例中，所述反应体系中的溶氧量为5%以上，按同样条件下去离子水溶氧饱和时校准为100%计，优选20%以上。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶的浓度为100U/L以上；和/或
所述过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)的浓度为1000U/L以上，按反应液中酶活单位U计算。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶的浓度为1000U/L以上，按反应液中酶活单位U计算。更佳地为1000U/L-10000U/L。
在另一优选例中，所述过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)的浓度为10000U/L-100000U/L，按反应液中酶活单位U计算。
在另一优选例中，所述反应体系的pH为5.5-9，较佳地为pH6-8。
在另一优选例中，所述步骤中，反应温度为20-50℃。优选为25-40℃
在另一优选例中，所述步骤中，反应时间为1-48h，优选为2-10h。
在另一优选例中，L-谷氨酸或其盐的投入量为50-200g/L。
在另一优选例中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)提供一混合溶液，所述混合溶液包括L-谷氨酸盐、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂；
(2)向所述混合溶液通入氧气或空气进行反应，得α-酮戊二酸。
在另一优选例中，所述产物以α-酮戊二酸或者以α-酮戊二酸的氨基酸盐形式存在，较佳地为L-精氨酸α-酮戊二酸盐。
在另一优选例中，所述α-酮戊二酸的氨基酸盐是如下制备的：
(1)提供一混合溶液，所述混合溶液包括L-谷氨酸盐、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂；
(2)向所述混合溶液通入氧气或空气进行反应；
(3)待反应结束后，向反应液中加入碱性氨基酸(较佳地为L-精氨酸)，得α-酮戊二酸的氨基酸盐。
在另一优选例中，所加入的碱性氨基酸(较佳地为L-精氨酸)与α-酮戊二酸的摩尔比为2:1。
在另一优选例中，所述混合溶液是如下制备的：
(1)向容器中依次加入L-谷氨酸或其盐溶液、L-谷氨酸氧化酶溶液和过氧化氢清除剂溶液，形成混合溶液；
(2)将混合溶液的pH调节在5.5-9之间。
本发明第二方面提供一种酶组合产品，包括以下组分：
(i)L-谷氨酸氧化酶；
(ii)过氧化氢清除剂。
在另一优选例中，所述的组分(i)和(ii)位于同一或不同的容器中。
在另一优选例中，所述的组分(i)和(ii)分别为固态或液体形式。
在另一优选例中，过氧化氢清除剂包括过氧化氢酶、二氧化锰或其组合。
在另一优选例中，所述的L-谷氨酸氧化酶是产生所述L-谷氨酸氧化酶活性的微生物的处理物形式，如发酵液、裂解液。
在另一优选例中，所述组分(i)L-谷氨酸氧化酶与(ii)过氧化氢清除剂之比为1:100-1:5000，按酶活单位U计。
在另一优选例中，所述的组合产品为液体组合物。
在另一优选例中，所述L-谷氨酸氧化酶的浓度为1000U/L-10000U/L，过氧化氢清除剂的浓度为10000U/L-100000U/L，按每升液体中酶活单位U计算。
本发明第三方面提供一种本发明第二方面所述酶组合物的用途，所述酶组合物用于制备α-酮戊二酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为pET28b-Lgox的质粒图谱
图2为pET28b-5008Lgox的质粒图谱
图3为pET28b-KSE-Lgox的质粒图谱
图4为pET28b-SA-Lgox的质粒图谱
图5为pET28b-SP-Lgox的质粒图谱
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次利用特定的酶并结合过氧化氢清除技术，极其高效地实现了α-酮戊二酸的一步化生产。不仅工艺流程极大简化，而且在未经浓缩的情况下，产物的浓度可达到或超过100g/L，并且α-酮戊二酸的摩尔转化率可达到80%以上。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，所述“终浓度”是指反应液配制完成，或者补料完成后，或者反应完成后，反应液中某种化合物的浓度。
L-谷氨酸氧化酶
本发明所述L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,LGOX)是纯化形式或未纯化形式的(如初步纯化的L-谷氨酸氧化酶、发酵液、裂解液)、固定化或未固定化的L-谷氨酸氧化酶。较佳地为纯化形式的L-谷氨酸氧化酶或固定化L-谷氨酸氧化酶。L-谷氨酸氧化酶可以以产生L-谷氨酸氧化酶活性的微生物形式加入，或者以产生L-谷氨酸氧化酶活性的微生物的处理物的形式加入。所述处理物包括所述微生物进行机械破坏、超声波处理、冻结融解处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自身消化、表面活性剂处理或酶处理而得到的物质。如L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液。
含有L-谷氨酸氧化酶活性的微生物一般包括：放线菌、或者是表达放线菌来源L-谷氨酸氧化酶的基因工程大肠杆菌，优选表达放线菌来源L-谷氨酸氧化酶的基因工程大肠杆菌。
固定化L-谷氨酸氧化酶包括载体以及固定于载体的L-谷氨酸氧化酶，其中载体包括氨基类载体(如三菱公司的SEPABEADS EC-HA,SEPABEADS EC-EA,西安蓝晓的Seplite LX-1000HA等)和环氧类载体(如三菱公司的SEPABEADS EC-EP,西安蓝晓的Seplite LX-1000EP等)。氨基类固定化L-谷氨酸氧化酶的制备通常包括：固定化载体的活化和固定化载体与L-谷氨酸氧化酶固定两个步骤。而环氧类固定化L-谷氨酸氧化酶的制备无需载体的活化，可直接进行L-谷氨酸氧化酶的固定。固定化L-谷氨酸氧化酶的制备可采用固定化载体公司提供的操作方法制备。
本发明的L-谷氨酸氧化酶来源于原核或真核生物，如细菌、放线菌(如链霉菌、孢菌)、或真菌，较佳地来源于选自下组的菌株：链霉菌X-119-6、链霉菌Z-11-6、浅紫链霉菌、内涂链霉菌、普拉特链霉菌、生二素链霉菌、刚毛北里孢菌和吸水链霉菌。
本发明的L-谷氨酸氧化酶具有下组中的一个或多个特性：
(a)比酶活为5U/mg以上；
(b)最适pH为6.0-8.0；
(c)以FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)为辅酶。
过氧化氢清除剂
本发明所述过氧化氢清除剂指是能清除过氧化氢的物质，主要包括酶、二氧化锰。如能催化过氧化氢分解成氧和水的过氧化氢酶(CAT)等。
生产α-酮戊二酸的方法
本发明的生产方法主要包括步骤：在过氧化氢清除剂的存在下，用L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行催化氧化反应，从而生成α-酮戊二酸。其中，L-谷氨酸盐包括L-谷氨酸碱金属盐(如L-谷氨酸钠等)、L-谷氨酸碱性氨基酸盐(如L-谷氨酸精氨酸盐)和L-谷氨酸铵盐。L-谷氨酸碱金属盐是通过L-谷氨酸与碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)反应生成。L-谷氨酸碱性氨基酸盐是通过L-谷氨酸与碱性氨基酸(如精氨酸)反应生成。
本发明的催化氧化反应可以在氧气的存在下进行。所述催化氧化反应还包括向反应体系中通入氧气或空气的步骤。空气的通入量通常为0.1-5vvm。较佳地为0.5-2vvm，反应优选在发酵罐或者其他供氧条件好的容器内进行。
在一类优选例中，本发明的方法具体包括以下步骤：
(1)提供一混合溶液，所述混合溶液包括L-谷氨酸或其盐、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂；
(2)向所述混合溶液通入氧气或空气进行反应，得α-酮戊二酸。
其中，混合溶液可通如下方法制备：
(1)向容器中依次加入L-谷氨酸或其盐的溶液(较佳的浓度为终浓度20-200g/L)、L-谷氨酸氧化酶溶液(较佳的浓度为500U/L-10000U/L，按反应液中酶活单位U计算。)和过氧化氢清除剂溶液(较佳的浓度为10000U/L-100000U/L,按反应液中酶活单位U计算)，形成混合溶液；
(2)将混合溶液的pH调节在5.5-9之间(较佳地在7-8之间)。
应理解，在本发明方法中，L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂(如过氧化氢酶)的比例没有特别限制，只要两种酶的各自浓度满足L-谷氨酸氧化酶浓度≥100U/L而过氧化氢酶浓度≥1000U/L即可。当然，两种的优选比例为1:100-1:5000，按酶活单位U计。
在本发明中，产物α-酮戊二酸也可以以α-酮戊二酸的氨基酸盐形式存在，较佳地为L-精氨酸α-酮戊二酸盐。
优选地，α-酮戊二酸的氨基酸盐是如下制备的：
(1)提供一混合溶液，所述混合溶液包括L-谷氨酸盐、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢清除剂；
(2)向所述混合溶液通入氧气或空气进行反应；
(3)待反应结束后，向反应液中加入碱性氨基酸(较佳地为L-精氨酸)，得α-酮戊二酸的氨基酸盐。
在另一优选例中，所加入的碱性氨基酸(较佳地为L-精氨酸)与α-酮戊二酸的摩尔比为2:1。
本发明的催化氧化反应为液相反应，较佳地在水中进行。催化氧化反应在常压、减压或加压条件都可进行，只要对催化氧化反应的酶没有明显的不利影响即可。为了提高α-酮戊二酸的转化率，本发明的反应优选在搅拌条件下进行，并且通过调节搅拌速度、反应压强和气体通入量将溶氧量控制在5%以上(较佳地在20%以上)，反应压强较佳地为0.01mpa以上。本发明的催化氧化反应温度为20-50℃。优选为25-40℃，反应时间为1-48h，优选为2-10h。
本发明的还可以在反应液中溶氧量的上升时结束反应，也可以在溶氧量上升时，通过补加一定量L-谷氨酸或其盐(通常为终浓度20g/L-100g/L)，使溶氧量下降，继续反应直至溶氧量再次上升时可再次补加一定量L-谷氨酸或其盐，或者结束反应。
在本发明的反应体系中，催化氧化反应不受或基本上不受产物(α-酮戊二酸)的抑制。因此反应液在未经浓缩的情况下，产物α-酮戊二酸的浓度可≥30g/L，较佳地≥100g/L。而高浓度的转化可以获得高收率，本发明的所制备的α-酮戊二酸的摩尔转化率≥60%,较佳地≥70%，更佳地≥80%(如80-95%)，按L-谷氨酸或其盐(原料)计。
为了便于理解，申请人提供机理方面的解释。然而，应理解，本发明的保护范围并不受所述反应机理的限制。本发明的一种可能的反应机理如下所示：
在另一优选例中，本发明的α-酮戊二酸的生产方法，步骤具体如下：
用发酵罐或者其他供氧条件好的容器进行反应，反应体系含50-200g/L谷氨酸钠，按照终浓度2000U/L以上加入L-谷氨酸氧化酶(纯化的酶或者含有L-谷氨酸氧化酶活性的微生物或其处理物)，按照终浓度500000U/L以上加入过氧化氢酶，采用5M的氢氧化钠或者盐酸将反应液pH控制在7.0-8.0之间，温度20-45℃，通气量0.5-2vvm，罐压0.01-0.1mpa，通过搅拌速度、罐压和通气量的调节将溶氧量控制在20%以上。转化至溶氧量上升时结束反应，或者是补加20-100g/L的L-谷氨酸钠，使溶氧下降，继续反应直至溶氧量再次上升时再结束反应。
酶组合物
本发明的酶组合物包括L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢清除剂(较佳地为过氧化氢酶)，其中，L-谷氨酸氧化酶可以以本发明第一方面中所提到的任一形式存在。较佳地，所述酶组合物为液体组合物，L-谷氨酸氧化酶与过氧化氢清除剂的浓度比为1:100-1:5000。其中L-谷氨酸氧化酶的浓度为1000U/L-10000U/L，过氧化氢清除剂的浓度为10000U/L-100000U/L，按每升液体中酶活计算。所述酶组合物可用于制备α-酮戊二酸。
本发明的主要优点包括：
(1)原料易得且成本低廉：谷氨酸或谷氨酸的钠盐(即味精)可以从味精工业大量获取，且价格低廉。
(2)工艺简单：所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备α-酮戊二酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，且设备利用率高。
(3)本发明所提供的α-酮戊二酸的合成方法，在未经浓缩的情况下，产品浓度可以达到或超过100g/L，这是生物发酵法无法企及的。
(4)本发明的催化氧化反应不受或基本上不受产物α-酮戊二酸的抑制，因此高浓度的转化可以获得高收率(≥80%)，简化了提取工艺，有利于大规模工业化生产。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
通用方法
全基因合成：
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的全基因两端分别带有NdeI和HindIII酶切位点。
本发明实施例中的L-谷氨酸氧化酶的来源菌株的详细信息如表1所示。
表1
实施例1、高表达L-谷氨酸氧化酶的构建，Streptomyces sp X-119-6来源L-谷氨酸氧化酶的克隆表达
全基因合成Streptomyces sp X-119-6来源L-谷氨酸氧化酶基因LGOX(NCBI登录号：AB085623；SEQ ID NO.:1)，获得质粒pUC57-Lgox。
将pUC57-Lgox用NdeI和HindIII在37℃双酶切3-6小时，酶切体系为：pUC57-Logx 43μL，Buffer R 5μL，NdeI 1μL，HindIII 1μL，核酸电泳并用胶回收试剂盒回收2.1kb Lgox片段。
回收获得的L-gox片段与同样酶切处理的表达载体pET28b用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含Kan的LB平板，37℃培养过夜。挑单克隆接种于LB试管培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用NdeI和HindIII于37℃双酶切验证，若能切出2.1kb片段则为正确，得到pET28b-Lgox(质粒图谱如图1所示)，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞进行表达。
L-谷氨酸氧化酶表达菌种的摇瓶发酵：配制液体培养基TB(pH7.0-7.5)，含有12g/L蛋白胨、24g/L进口酵母抽提物、5g/L甘油、2.13g/L KH2PO4、16.43g/L K2HPO4·3H2O。培养基TB分装于500mL三角摇瓶，装液量100mL，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌20min。L-谷氨酸氧化酶表达菌种的平板上用接种环挑数环菌体接种于TB摇瓶中，接种前在TB培养基中加入100μg/mL卡那霉素，于37℃、220rpm摇床培养至OD600=5-6，加入0.2mMIPTG于28℃诱导24h左右。离心后收集菌体备用。
实施例2、酶的纯化
发酵后用8000rpm离心，得到湿菌体，发酵得到的湿菌体的酶活为610 U/g，L-谷氨酸氧化酶酶活测定和纯化按照文献Recombinant expression,biochemical characterization and stabilization through proteolysis ofan L-glutamate oxidase from Streptomyces sp. X-119-6.Arima, J.;Tamura,T.;Kusakabe,H.;Ashiuchi,M.;Yagi,T.;Tanaka,H.;Inagaki,K.;J.Biochem.134,805-812(2003)进行，纯化后得到的酶，酶的比活为52U/mg。
实施例3、用含LGOX的细胞裂解液转化制备α-酮戊二酸
用发酵罐或者其他供氧条件好的容器进行反应，反应体系含100g/L谷氨酸钠，按照终浓度4000U/L加入含L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液，按照终浓度1500000U/L加入过氧化氢酶(诺维信Terminox Ultra 2000L)，采用5M的氢氧化钠或者盐酸pH控制在7.0-8.0之间，温度35℃，通气量1vvm，罐压0.01 mpa，通过搅拌速度、罐压和通气量的调节将溶氧控制在25%，转化至溶氧上升时，补加50g/L的谷氨酸钠，溶氧下降，继续转化至溶氧上升转化结束。HPLC测定α-酮戊二酸含量为111.8g/L，根据体积变化折算摩尔转化率达到89.0%。
实施例4、用含LGOX的细胞裂解液转化制备α-酮戊二酸
用发酵罐或者其他供氧条件好的容器进行反应，反应体系含200g/L谷氨酸钠，按照终浓度6000U/L加入含L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液，按照终浓度2000000U/L加入过氧化氢酶(邢台市太和生物化学技术有限公司)，采用5M的氢氧化钠或者盐酸pH控制在7.0-8.0之间，温度35℃，通气量1vvm，罐压0.01mpa，通过搅拌速度、罐压和通气量的调节将溶氧控制在25%，转化17h,溶氧上升，转化结束。HPLC测定α-酮戊二酸含量138.5g/L，根据体积变化折算摩尔转化率达到83.1%。
实施例5、用纯化的LGOX转化制备α-酮戊二酸
加入的L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液替换为纯化的L-谷氨酸氧化酶，其他同实施例3，摩尔转化率达到87.4%。
实施例6、固定化酶LGOX的制备
氨基类固定化载体(如三菱公司的SEPABEADS EC-HA,SEPABEADS EC-EA,西安蓝晓的Seplite LX-1000HA等)活化方法为：将10g载体浸没于40ml0.1M磷酸钾缓冲液(pH4.2-4.5)150rpm，20-25℃条件下振摇15min；弃上清，用0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)清洗2遍；静置，除去上清；将载体重新浸没于40ml0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)，150rpm，20-25℃下振摇5min；除去上清，用40ml含2%戊二醛的0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)浸没载体，150rpm，20-25℃下振摇60min；静置，除去上清；用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)清洗载体两次抽干即可。
氨基类固定化载体与LGOX的固定，以EC-HA-LGOX为例，固定化酶的制备方法如下：将10g湿载体与40ml酶液(约含0.6g蛋白)在20-25℃条件下，150rpm振摇。1min后停止振摇，检查并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h，测定上清酶活以及蛋白浓度；除去上清，用40ml0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在25℃条件下振摇1-2min；除去上清，以0.02M含0.5MNaCl的磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)20-25℃，150rpm振摇45min；除去上清，再次用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，测定固定化酶酶活，固定化EC-HA-LGOX的酶活达到257U/g。其他氨基类固定化载体与LGOX的固定同EC-HA-LGOX的制备。
环氧类固定化载体(如三菱公司的SEPABEADS EC-EP,西安蓝晓的SepliteLX-1000EP等)无需活化，可直接用于酶的固定。该类载体与LGOX的固定，以EC-EP为例，固定化酶的制备方法如下：将10g湿载体与40ml酶液(约含0.6g蛋白)，置于1.25M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)，在20-25℃条件下，150rpm振摇；1min后停止振摇，检查并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h；停止振摇，在相同温度下静置20-24h；测定上清酶活以及蛋白浓度；除去上清，用40ml0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在20-25℃条件下振摇1-2min；除去上清，再次以相同缓冲液振摇洗涤45min；除去上清，再次用40ml0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，测定固定化酶酶活，固定化EC-EP-LGOX的酶活达到189U/g。其他环氧类固定化载体与LGOX的固定同EC-EP-LGOX的制备。
实施例7、固定化LGOX转化制备α-酮戊二酸
加入的L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液替换为固定化的L-谷氨酸氧化酶，其他同实施例3，转化后α-酮戊二酸含量为109.8g/L，根据体积变化折算摩尔转化率达到90.7%。
实施例8、Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis 5008，Kitasatospora setae KM-6054，Streptomyces ambofaciens ATCC 23877和Streptomyces platensis来源L-谷氨酸氧化酶表达菌种的构建
全基因合成Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis 5008来源L-谷氨酸氧化酶基因5008Lgox(NCBI登录号：NC_017765)，克隆到pET28b上转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，构建方法同实施例1(质粒图谱如图2所示)。
全基因合成Kitasatospora setae KM-6054来源L-谷氨酸氧化酶基因KSE-Lgox(NCBI登录号：NC_016109)，克隆到pET28b上转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，构建方法同实施例1(质粒图谱如图3所示)。
全基因合成Streptomyces ambofaciens ATCC 23877来源L-谷氨酸氧化酶基因SA-Lgox(NCBI登录号：AM238664)，克隆到pET28b上转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，构建方法同实施例1(质粒图谱如图4所示)。
全基因合成Streptomyces platensis来源L-谷氨酸氧化酶基因SP-Lgox(NCBI登录号：AF239797)，克隆到pET28b上转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，构建方法同实施例1(质粒图谱如图5所示)。
实施例9、不同来源LGOX转化制备α-酮戊二酸
加入的L-谷氨酸氧化酶细胞裂解液替换为5008Lgox，KSE-Lgox，SA-Lgox和SP-Lgox的细胞裂解液，转化初始体积为1L，酶的加入量和转化等其他都同实施例3，摩尔转化率达到分别达到了87.1%，90.1%。86.7%和84.1%。具体参数如表2所示。
表2
实施例10、制备L-精氨酸α-酮戊二酸(2:1)
用发酵罐或者其他供氧条件好的容器进行反应，反应体系加入100g/L谷氨酸，然后加入同摩尔的L-精氨酸118.4g/L调pH7.0左右，按照终浓度4000U/L加入含L-谷氨酸氧化酶细胞破碎液，按照终浓度1500000U/L加入过氧化氢酶(诺维信Terminox Ultra 2000L)，初始体积1L，采用5M的氢氧化钠或者盐酸pH控制在7.0-8.0之间，温度35℃，通气量1vvm，罐压0.01 mpa，通过搅拌速度、罐压和通气量的调节将溶氧控制在25%，转化6.5h溶氧上升转化结束。HPLC测定α-酮戊二酸含量为95.2g/L，体积为925ml，根据体积变化折算摩尔转化率达到88.1%。然后补加精氨酸90.1g,从而得到L-精氨酸α-酮戊二酸(2:1)的溶液。该溶液高温变性，加入0.5%活性碳，过滤，滤液浓缩至400-500g/L，然后滴加3倍体积的丙酮，冷却至5℃进行结晶5h，然后抽滤得到的固体再用少量的丙酮淋洗后烘干，得到L-精氨酸α-酮戊二酸(2:1)211.5g。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，包括步骤：在过氧化氢清除剂的存在下，用L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行催化氧化反应，从而生成α-酮戊二酸。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶来源于原核或真核生物。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶是纯化形式的、未纯化形式的、固定化的或未固定化的L-谷氨酸氧化酶。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶以产生所述L-谷氨酸氧化酶活性的微生物形式加入，或者以产生所述L-谷氨酸氧化酶活性的微生物的处理物形式加入。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述L-谷氨酸盐包括L-谷氨酸碱金属盐、L-谷氨酸碱性氨基酸盐、L-谷氨酸铵盐、或其组合。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述过氧化氢清除剂包括过氧化氢酶、二氧化锰或其组合。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的浓度为100U/L以上；和/或
所述过氧化氢清除剂为过氧化氢酶且其浓度为1000U/L以上，按反应液中酶活单位U计算。
8.一种酶组合产品，其特征在于，包括以下组分：
(i)L-谷氨酸氧化酶；
(ii)过氧化氢清除剂。
9.如权利要求8所述的酶组合产品，其特征在于，所述组分(i)L-谷氨酸氧化酶与(ii)过氧化氢清除剂之比为1:100-1:5000，按酶活单位U计。
10.一种如权利要求8所述酶组合物的用途，其特征在于，用于制备α-酮戊二酸。
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