CN106119307B - 一种α-酮戊二酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑酮戊二酸的制备方法，它以L‑谷氨酸或其盐作为原料，通过L‑谷氨酸脱氨酶在pH＝8.0‑9.0、温度30‑50℃的条件下脱去L‑谷氨酸上的氨基，再经活性炭脱色、过滤、经阳离子交换树脂柱纯化、浓缩、结晶得到α‑酮戊二酸成品。本发明方法具有反应条件温和、生产周期短、产品浓度和收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。采用阳离子树脂分离未转化残留的L‑谷氨酸与α‑酮戊二酸产品，确保产品的收率，回收的L‑谷氨酸可以继续当作起始原料。

Description

一种α-酮戊二酸的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种α-酮戊二酸的制备方法。
背景技术
α-酮戊二酸(2-Ketoglutaric acid)，又称2-氧代戊二酸，是一种重要的生物分子，是三羧酸循环中重要的中间产物之一，是氮的输送体和分子氧化中的共生物质。在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基酸，蛋白质的重要前体物质。在可用于营养强化剂，作为运动营养饮料的成分，有机中间体，生化试剂和测肝功能的配套试剂，体格增强补剂等方面。此外，α-酮戊二酸可制备1：1和2：1的L-精氨酸α-酮戊二酸，用于运动营养剂。
现有α-酮戊二酸的生产工艺基本是以化学合成法和生物发酵法为主。
化学合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。例如张国基(中国发明专利申请公开号CN102584568A)以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯为原料，在甲醇钠存在的条件下，合成中间体2,2-二氯戊二酸二甲酯，再与碱溶液反应得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸产品。化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好，不适合于工业化生产，不能满足市场的需求。
相对于化学合成法，生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等特点。但是，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本还是偏高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种α-酮戊二酸的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种α-酮戊二酸的制备方法，它以L-谷氨酸或其盐作为原料，通过L-谷氨酸脱氨酶在pH＝8.0-9.0、温度30-50℃的条件下脱去L-谷氨酸上的氨基，再经活性炭脱色、过滤、经阳离子交换树脂柱纯化、浓缩、结晶得到α-酮戊二酸成品。
本发明所述的α-酮戊二酸的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤(1)、L-谷氨酸或其盐溶于pH＝8.0-9.0的碱性去离子水中得到料液；往料液中加入L-谷氨酸脱氨酶，在温度30～50℃下，L-谷氨酸或其盐脱去氨基，得到转化液；
步骤(2)、转化液加热至80～85℃，保温0.5～2小时使L-谷氨酸脱氨酶失活；再降温至60～70℃，用硫酸调节pH＝2.5～3.0，加入活性炭脱色，过滤得到滤液；
步骤(3)、滤液上732阳离子交换树脂柱进行分离纯化得纯化液；
步骤(4)、纯化液真空浓缩至析出结晶，浓缩液在温度3～4℃下结晶，抽滤、固体在温度60～65℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸产品。
步骤(1)中，采用NaOH水溶液调节去离子水的pH得到碱性去离子水。
优选的，所述的碱性去离子水的pH＝8.8。
所述的L-谷氨酸或其盐与去离子水的摩尔比为0.5～1：25～30，优选为0.8～1：26～28。
优选的，所述的温度为37～39℃。
所述的L-谷氨酸脱氨酶和去离子水的质量体积比(g：mL)为0.02～0.08：100，优选为0.02～0.03：100。L-谷氨酸或其盐在L-谷氨酸脱氨酶作用下转化直至L-谷氨酸的残留小于0.1％。
所述的L-谷氨酸脱氨酶的浓度不低于200U/g，优选为200U/g。L-谷氨酸脱氨酶可以是纯化形式的、未纯化形式的、固定化的或未固定化的L-谷氨酸脱氨酶。
本发明所述的L-谷氨酸脱氨酶可以通过以下方法制得：用灭菌接种环挑取一环大肠杆菌AS1.505，接种到250mL液体培养基中，在温度28～30℃、转速120转/分条件下振动培养，培养18个小时左右，3000转/分超速离心，沉淀物依次水洗、丙酮洗、乙醚洗，干燥获得L-谷氨酸脱氨酶。其中，液体培养基组分含量(g/mL)：L-谷氨酸：0.5％，玉米浆：0.4％，酵母浸膏：1％，硫酸镁：0.2％，磷酸二氢钾：0.1％，氨调节pH7.5～7.7。大肠杆菌AS1.505可以购买得到。
步骤(2)中，所述的活性炭加入质量为转化液体积的1％，即活性炭的质量与转化液的体积之比为1g：100mL。
步骤(3)中，滤液上732阳离子交换树脂柱进行分离纯化的具体方法：滤液上732阳离子交换树脂柱，收集柱下流出液，滤液上完后采用无离子水压柱，收集压柱液，柱下流出液和压柱液采用茚三酮检测，无氨基酸黄色反应，说明L-谷氨酸被阳树脂吸附，合并无氨基酸黄色反应的柱下流出液和压柱液，得纯化液。
本发明的有益效果：
本发明方法具有反应条件温和、生产周期短、产品浓度和收率高、环保压力小、适合大规模的工业化生产等优点。
本发明制备α-酮戊二酸的方法，相比于谷氨酸氧化酶具有不需要使用过氧化氢，反应条件更温和、更安全。采用阳离子树脂分离未转化残留的L-谷氨酸与α-酮戊二酸产品，确保产品的收率，回收的L-谷氨酸可以继续当作起始原料。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
一种α-酮戊二酸的制备方法，以L-谷氨酸为原料，具体包括以下步骤：
步骤(1)、称取L-谷氨酸120g，去离子水500mL，用浓度为32％的工业液碱(即NaOH)调节溶液体系的pH至8.8使L-谷氨酸完全溶解，加热至37～39℃；
称取L-谷氨酸脱氨酶15g(浓度200U/g，同下)，搅拌加入上述配料液中，采用热水浴控制反应温度在37～39℃，定时取样，采用华勃氏呼吸仪检测L-谷氨酸含量，约58～60小时，可测得L-谷氨酸的残留小于0.1％，得到转化液；
采样时间：前24小时每隔8小时取样检测L-谷氨酸残留含量，24小时后每4小时检测L-谷氨酸残留含量，48小时后每2小时取样检测L-谷氨酸残留含量；
步骤(2)、将转化液加热至83～85℃，维持该温度1小时使L-谷氨酸酶脱氨酶失活，再冷却至68℃，用98％硫酸调节pH＝2.5～3.0确保L-谷氨酸全部转为阳离子，加入1％活性炭，搅拌脱色2小时，过滤得滤液；
步骤(3)、滤液上732阳离子交换树脂柱，收集柱下流出液，滤液上完后采用无离子水压柱，收集压柱液，确保柱下流出液和压柱液茚三酮检测无氨基酸黄色反应，说明L-谷氨酸被阳树脂吸附，合并柱下流出液和压柱液，得纯化液；
步骤(4)、纯化液真空浓缩至析出结晶，搅拌、自然降温至室温后放入冰箱在3～4℃结晶，抽滤、固体在温度62℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸产品90g，收率：75％。
实施例2
一种α-酮戊二酸的制备方法，以L-谷氨酸钠一水物为原料，具体包括以下步骤：
步骤(1)、称取L-谷氨酸钠一水物152g，去离子水500mL，用浓度为30％的工业液碱调节料液pH至8.8，加热至37～39℃；
称取L-谷氨酸脱氨酶15g，搅拌加入上述配料液中，采用热水浴控制体系温度37-39℃，定时取样(同实施例1)，采用华勃氏呼吸仪检测L-谷氨酸含量，约58～60小时，可测得L-谷氨酸的残留小于0.1％，得到转化液；
步骤(2)、将转化液加热至83～85℃，维持1小时，冷却至70℃，用98％硫酸调节pH＝2.5～3.0，加入活性炭1％，搅拌脱色2小时，过滤得滤液；
步骤(3)、滤液上732阳离子交换树脂柱，收集柱下流出液，滤液上完后采用无离子水压柱，收集压柱液，确保柱下流出液和压柱液茚三酮检测无氨基酸黄色反应，合并柱下流出液和压柱液，得纯化液；
步骤(4)、纯化液真空浓缩至析出结晶，搅拌、自然降温至室温后放入冰箱在3～4℃结晶，抽滤、固体在温度60℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸产品116g，收率：76.3％。
实施例1和2制备得到的α-酮戊二酸产品的检测结果
Figure BDA0001040111090000041

Claims (3)

1.一种α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
步骤(1)、采用NaOH水溶液调节去离子水的pH =8.8得到碱性去离子水；L-谷氨酸或其盐溶于碱性去离子水中得到料液；往料液中加入L-谷氨酸脱氨酶，在温度37～39℃下，L-谷氨酸或其盐脱去氨基，L-谷氨酸或其盐在L-谷氨酸脱氨酶作用下转化直至L-谷氨酸的残留小于0.1%，得到转化液；其中，所述的L-谷氨酸或其盐与去离子水的摩尔比为0.5～1：25～30；所述的L-谷氨酸脱氨酶和去离子水的质量体积比为0.02～0.08：100 g/mL；所述的L-谷氨酸脱氨酶的浓度不低于200U/g；所述的L-谷氨酸脱氨酶通过以下方法制得：用灭菌接种环挑取一环大肠杆菌AS1.505，接种到250mL液体培养基中，在温度28～30℃、转速120转/分条件下振动培养，培养18个小时，3000转/分超速离心，沉淀物依次水洗、丙酮洗、乙醚洗，干燥获得L-谷氨酸脱氨酶；其中，液体培养基组分含量g/mL：L-谷氨酸：0.5%，玉米浆：0.4%，酵母浸膏：1%，硫酸镁：0.2%，磷酸二氢钾：0.1%，氨调节pH7.5～7.7；
步骤(2)、转化液加热至80～85℃，保温0.5～2小时使L-谷氨酸脱氨酶失活；再降温至60～70℃，用硫酸调节pH=2.5～3.0，加入活性炭脱色，过滤得到滤液；
步骤(3)、滤液上732阳离子交换树脂柱，收集柱下流出液，滤液上完后采用无离子水压柱，收集压柱液，柱下流出液和压柱液采用茚三酮检测，合并无氨基酸黄色反应的柱下流出液和压柱液，得纯化液；
步骤(4)、纯化液真空浓缩至析出结晶，浓缩液在温度3～4℃下结晶，抽滤、固体在温度60～65℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸产品。
2.根据权利要求1所述的α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述的L-谷氨酸或其盐与去离子水的摩尔比为0.8～1：26～28；所述的L-谷氨酸脱氨酶与去离子水的质量体积比为0.02～0.03：100 g/mL。
3.根据权利要求1所述的α-酮戊二酸的制备方法，其特征在于步骤(1)中，L-谷氨酸脱氨酶是纯化形式的、未纯化形式的、固定化的或未固定化的L-谷氨酸脱氨酶。
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