CN107746834A - 用于制备普瑞巴林的方法和中间体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了式(IA)的化合物的制备方法。本发明还提供了用于将式(IA)的化合物转化为普瑞巴林的改进的方法。

Description

用于制备普瑞巴林的方法和中间体
本申请是中国专利申请号201480018083.5(PCT/IB2014/060140)，申请日2014年03月25日，发明名称为“用于制备普瑞巴林的方法和中间体”的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于制备(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(普瑞巴林)的5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮及其衍生物的制备。本发明还涉及用于将5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮转化为普瑞巴林的改进方法。普瑞巴林是表现出与人α2δ钙通道亚基的结合亲和力的γ-氨基酸。
发明背景
普瑞巴林，或(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基-己酸((S)-II)，
是中的活性主体，其被批准用于癫痫、神经性疼痛、纤维肌痛和广泛性焦虑障碍的治疗。它表现出抗发作活性(如在美国专利US5,563,175中所讨论的)和抗感受伤害活性(如在美国专利US 6,001,876中所讨论的)。据假设，普瑞巴林(II)的药理活性由结合到钙通道的α-2-δ(α2δ)亚基引起的。普瑞巴林(II)还被描述为在其它条件下，例如在与精神运动兴奋剂、炎症、胃肠道损伤、酒精中毒、失眠以及各种精神障碍包括焦虑、抑郁、躁狂症和双相型障碍相关的生理条件下具有效用。
已公开了许多用于制备普瑞巴林的方法。5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)已被鉴定为是一种有用的前体。
将理解，化合物(IA)，与本文所讨论的许多其它化合物一样，可被认为是4-氧代丁酸衍生物的环化异构体。4-氧代丁酸的衍生物可以以开链形式或环状形式存在。
“开链”异构体“环状”异构体
这两种异构形式可共存于平衡状态，并且这两种形式的相对贡献将取决于种类的确切化学性质。
国际专利申请PCT/US2008/004699(公开为WO2008/127646A2)提出使用化学或酶介导的还原性胺化将5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)或开环异构形式的酯(XIII，其中RA为烷基)转化为(II)。提示转氨酶的使用将选择性提供优选的((S)-II)对映体。
酯(XIII)是从4-甲基戊醛(III)通过用适当的卤代乙酸酯在二异丁胺存在下烷化来制备的。前体(IA)通过酯(XIII)的酯水解或通过4-甲基戊醛(Ⅲ)与乙醛酸(IV)的缩合和随后双键的还原来制成。酶介导的还原的使用也被提示为引入所需的立体化学的一种方式。
国际专利申请PCT/IN2010/000140(公开为WO2011/086565)公开了相关的方法。4-甲基戊醛(Ⅲ)和乙醛酸(IV)的缩合产物与手性胺例如α-甲基苄胺反应以产生吡咯酮(V)。氢化作用产生一定程度的立体选择性，并且脱保护产生手性形式的普瑞巴林(II)。
仍然在寻找普瑞巴林(II)的进一步改进的合成法。特别期望的是提供成本有效且安全的方法。具体地，重要的是提供这样的普瑞巴林(II)合成：其可以在商业规模上进行，其使用容易得到的、便宜并且安全的起始材料和试剂，并且其避免需要困难的分离。
发明概述
本发明提供了用于制备5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)的改进方法，和可用于这些改进方法的中间体。
在第一方面A1，本发明提供了根据式(VI)的化合物
在第一实施方式A1E1中，本发明提供了根据式(VI)的化合物，其中R选自：
氢，
(C1-C6)烷基，
(C1-C6)卤代烷基，
(C1-C3)烷氧基(C2-C6)烷基，
(C2-C6)烯基，
(C3-C10)环烷基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
(C3-C10)环烷基(C1-C6)烷基，其中环烷基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
芳基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
芳基(C1-C6)烷基，其中芳基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
R1-C(O)-，和
R2-SO2-；
R1选自：
氢，
(C1-C6)烷基，
(C1-C6)卤代烷基，
(C1-C3)烷氧基(C2-C6)烷基，
(C2-C6)烯基，
(C3-C10)环烷基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
(C3-C10)环烷基(C1-C6)烷基，其中所述环烷基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
芳基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，和
芳基(C1-C6)烷基，其中芳基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
并且R2选自：
(C1-C6)烷基，
(C1-C6)卤代烷基，
(C1-C3)烷氧基(C2-C6)烷基，
(C2-C6)烯基，
(C3-C10)环烷基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
(C3-C10)环烷基(C1-C6)烷基，其中所述环烷基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，
芳基，其可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代，和
芳基(C1-C6)烷基，其中芳基可任选被独立地选自卤素、(C1-C3)烷基和(C1-C3)烷氧基的1、2或3个基团取代。
在其它的实施方式A1E2中，本发明提供了根据实施方式A1E1的化合物，其中R为氢，使得式(VI)的化合物为根据式(VIA)的5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮。
在其它的实施方式A1E3中，本发明提供了式(VIB)的根据实施方式A1E1的化合物
其中R*是手性(C5-C15)烃基。
在其它的实施方式A1E4中，本发明提供了根据实施方式A1E3的化合物，其中R*选自(R)-或(S)-α-甲基苄基、(R)-或(S)-1-(1-萘基)乙基、(R)-或(S)-1-(2-萘基)乙基、薄荷基和冰片基，使得式(VI)的化合物是式(VIC)-(VIK)的化合物。
在其它的实施方式A1E5中，本发明提供了根据实施方式A1E1的化合物，其中R为R1-C(O)-或R2-SO2-并且R1和R2是手性(C5-C15)烃基。
在另一个方面A2中，本发明提供了式(IX)的化合物
式(IX)的化合物可以以(E)-或(Z)-几何异构体或以两种几何异构体的混合物存在。
在第一实施方式A2E1中，本发明提供了式(IX)的化合物，其中：
n是1且M+选自Li+、Na+、K+、Rb+、NH4 +、((C1-C3)烷基)NH3 +、((C1-C3)烷基)2NH2 +、((C1-C3)烷基)3NH+和((C1-C3)烷基)4N+；或者
n是2且M2+选自Mg2+、Ca2+和Zn2+。
在其它的实施方式A2E2中，本发明提供了根据实施方式A2E1的化合物，其中n是1且M+选自NH4 +和((C1-C3)烷基)NH3 +。
在其它的实施方式A2E3中，本发明提供了根据实施方式A2E1的化合物，其中n是1且M+选自Li+、Na+和K+。
在另一个方面A3中，本发明提供了式(VII)的化合物。
在第一实施方式A3E1中，本发明提供了式(VII)的化合物，其中-X-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
在其它的实施方式A3E2中，本发明提供了根据实施方式A3E1的化合物，其选自：
4-(2-甲基丙烯基)-5-吡咯烷-1-基-5H-呋喃-2-酮；
4-(2-甲基丙烯基)-5-哌啶-1-基-5H-呋喃-2-酮；
4-(2-甲基丙烯基)-5-吗啉-4-基-5H-呋喃-2-酮；和
1,4-双-(4-(2-甲基丙烯基)-5H-呋喃-2-酮-5-基)哌嗪。
在另一个方面A4中，本发明提供了式(VIII)的化合物。
在第一实施方式A4E1中，本发明提供了式(VIII)的化合物，其中-Y-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
在其它的实施方式A4E2中，本发明提供了根据实施方式A4E1的化合物，其选自：
4-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)吗啉；
1-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)-哌嗪，
1-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)-4-甲基哌嗪，
4-乙基-1-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)-哌嗪，
4-苄基-1-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)-哌嗪，和
1,4-双-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)哌嗪。
在另一个方面A5中，本发明提供了式(VIA)的化合物的制备方法，其包括在酸催化剂的存在下用水处理式(VII)的化合物的步骤。
在第一实施方式A5E1中，本发明提供了式(VIA)的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
(a)制备式(VII)的化合物
其中-X-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
和
(b)在酸催化剂的存在下用水处理式(VII)的化合物。
在其它的实施方式A5E2中，本发明提供了根据实施方式A5E1的方法，其中在水解步骤(b)之前分离来自步骤(a)的式(VII)的化合物。
在其它的实施方式A5E3中，本发明提供了根据实施方式A5E1的方法，其中水解步骤(b)在步骤(a)之后直接进行，以使得在水解步骤(b)之前不分离式(VII)或(VIIB)的化合物。
在其它的实施方式A5E4中，本发明提供了根据实施方式A5E1、A5E2或A5E3的方法，其中式(VII)的化合物通过用乙醛酸或其水合物处理式(VIII)的化合物来制备
其中-Y-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
在另一个方面A6中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R不是氢、R1-C(O)-和R2-SO2-，所述方法包括在酸催化剂的存在下用醇R-OH处理式(VIA)的化合物的步骤。
在实施方式中A6E1中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R不是氢、R1-C(O)-和R2-SO2-，所述方法包括以下步骤：
(a)使用根据如上定义的实施方式A5E1、A5E2、A5E3和A5E4之任一的方法制备式(VIA)的化合物；和
(b)在酸催化剂的存在下用醇R-OH处理式(VIA)的化合物。
在另一个方面A7中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R不是氢、R1-C(O)-和R2-SO2-，所述方法包括在化学计量酸的存在下用醇R-OH处理式(VII)的化合物的步骤。
在实施方式中A7E1中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R不是氢、R1-C(O)-和R2-SO2-，所述方法包括以下步骤：
(a)制备式(VII)的化合物；和
(b)在化学计量酸的存在下用醇R-OH处理式(VII)的化合物。
在另一个方面A8中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R是R1-C(O)-，所述方法包括用酰基氯R1-C(O)-Cl或酸酐(R1-C(O))2O处理式(VIA)的化合物的步骤。
在实施方式中A8E1中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R是R1-C(O)-，所述方法包括以下步骤：
(a)使用根据如上定义的实施方式A5E1、A5E2、A5E3和A5E4之任一的方法制备式(VIA)的化合物；和
(b)用酰基氯R1-C(O)-Cl或酸酐(R1-C(O))2O处理式(VIA)的化合物。
在另一个方面A9中，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R是R2-SO2-，所述方法包括用磺酰氯R2-SO2-Cl处理式(VIA)的化合物的步骤。
在实施方式中A9E1，本发明提供了式(VI)的化合物的制备方法，其中R是R2-SO2-，所述方法包括以下步骤：
(a)使用根据如上定义的实施方式A5E1、A5E2、A5E3和A5E4之任一的方法制备式(VIA)的化合物；和
(b)用磺酰氯R2-SO2-Cl处理式(VIA)的化合物。
在另一个方面A10中，本发明提供了4-甲基-2-戊烯醛的烯胺衍生物的制备方法。
在第一实施方式A10E1中，本发明提供了4-甲基-2-戊烯醛的烯胺衍生物的制备方法，其包括在合适的胺存在下使乙醛与异丁醛反应。
在其它的实施方式A10E2中，本发明提供了根据实施方式A10E1的方法，其中适宜的胺是仲胺。
在其它的实施方式A10E3中，本发明提供了根据实施方式A10E2的方法，其中所述仲胺选自：((C1-C4)烷基)2NH，吡咯烷，哌啶，吗啉，哌嗪，N-甲基哌嗪，N-乙基哌嗪和N-苄基哌嗪。
在其它的实施方式A10E4中，本发明提供了根据实施方式A10E3的方法，其中所述仲胺选自吡咯烷、哌啶、吗啉和哌嗪。
在其它的实施方式A10E5中，本发明提供了根据实施方式A10E1、A10E2、A10E3和A10E4之任一的方法，其中所述反应在酸催化剂的存在下进行。
在其它的实施方式A10E6中，本发明提供了根据实施方式A10E1、A10E2、A10E3、A10E4和A10E5之任一的方法，其中在加入乙醛前将异丁醛与适当的胺组合。
在其它的实施方式A10E6中，本发明提供了根据实施方式A10E1、A10E2、A10E3、A10E4和A10E5之任一的方法，其中将异丁醛和乙醛同时加入到反应容器中。
在另一个方面A11中，本发明提供了3-氨甲基-5-甲基己酸(II)的制备方法。
在第一实施方式A11E1中，本发明提供了3-氨甲基-5-甲基己酸(II)或其药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)制备5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)
(b)将所述5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)转化为5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)
和
(c)将所述5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)转化为3-氨甲基-5-甲基己酸(II)。
在其它的实施方式A11E2中，本发明提供了根据实施方式A11E1的方法，其中所述3-氨甲基-5-甲基己酸(II)是(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸((S)-II)
其中所述(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸具有至少80％的对映体过量。
在其它的实施方式A11E3中，本发明提供了根据实施方式A11E1或A11E2的方法，其中步骤(a)包括根据如上所述的实施方式A5E1、A5E2、A5E3或A5E4的方法。
在其它的实施方式A11E4中，本发明提供了根据实施方式A11E1、A11E2或A11E3的方法，其中步骤(b)包括以下步骤：
(b1)用金属氧化物、氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、氨、单-、二-或三-(C1-C3)烷基胺、或四-(C1-C3)烷基铵氢氧化物处理5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)，以形成式(IX)的盐
其中：
n是1且M+选自Li+、Na+、K+、Rb+、NH4 +、((C1-C3)烷基)NH3 +、((C1-C3)烷基)2NH2 +、((C1-C3)烷基)3NH+和((C1-C3)烷基)4N+；或者
n是2且M2+选自Mg2+、Ca2+和Zn2+；
(b2)氢化式(IX)的盐，以获得式(X)的盐
和
(b3)用酸处理式(X)的盐。
在其它的实施方式A11E5中，本发明提供了根据实施方式A11E1、A11E2或A11E3的方法，其中步骤(b)包括以下步骤：
(b1)将5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)转化为如在实施方式A1E3中定义的式(VI)的化合物，其中R是手性(C5-C15)烃基；
(b2)氢化式(VI)的化合物，以获得式(XI)的化合物
其中R*是手性(C5-C15)烃基；和
(b3)用酸处理式(XI)的化合物，以产生((S)-IA)。
在另一个方面A12中，本发明提供了3-氨甲基-5-甲基己酸(II)的其它制备方法。
在第一实施方式A12E1中，本发明提供了3-氨甲基-5-甲基己酸(II)或其药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)制备5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)
(b)用氨或单-(C1-C3)烷基胺处理5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)，以形成式(IXA)的盐
其中n为1且M+选自NH4 +和((C1-C3)烷基)NH3 +
(c)氢化式(IXA)的盐，以获得式(XA)的盐
和
(d)用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理式(XA)的盐，以提供3-氨甲基-5-甲基己酸(II)。
在其它的实施方式A12E2中，本发明提供了根据实施方式A12E1的方法，其中3-氨甲基-5-甲基己酸(II)是(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸((S)-II)
其中所述(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸具有至少80％的对映体过量。
在其它的实施方式A12E3中，本发明提供了根据实施方式A12E1或A12E2的方法，其中步骤(a)包括根据如上所述的实施方式A5E1、A5E2、A5E3或A5E4的方法。
在另一个方面A13中，本发明提供了5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)的其它制备方法。
在第一实施方式A13E1中，本发明提供了5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)的其它制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得3-亚异丁基-2-氧代戊二酸(XIIA)或其环化的异构体(XIIB)
和
(b)相继或同时地还原碳-碳双键和使α-酮酸官能团脱羧基。
在其它的实施方式A13E2中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中在α-酮酸官能团的脱羧基之前还原碳-碳双键以提供3-亚异丁基-2-氧代戊二酸(XV)或其环化的异构体(XVA)
在其它的实施方式A13E3中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中在碳-碳双键的还原之前使α-酮酸官能团脱羧基以提供3-甲酰基-5-甲基-3-戊烯酸(XVI)或其环化的异构体(XVIA)
在其它的实施方式A13E4中，本发明提供了根据实施方式A13E1的方法，其中同时地使α-酮酸官能团脱羧基和还原碳-碳双键。
在其它的实施方式A13E5中，本发明提供了根据实施方式A13E1、A13E2、A13E3或A13E4的方法，其中脱羧反应在脱羧酶的存在下进行。
在其它的实施方式A13E6中，本发明提供了根据实施方式A13E1、A13E2、A13E3、A13E4或A13E5的方法，其中碳-碳双键的还原在烯酮还原酶(enoate reductase)的存在下进行。
在另一个方面A14中，本发明提供了选自以下的化合物：
3-亚异丁基-2-氧代戊二酸；
3-异丁基-2-氧代戊二酸；和
3-甲酰基-5-甲基-3-戊烯酸，
或其盐、(C1-C6)烷基酯或环化异构体。
在另一个方面A15中，本发明提供了(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸((S)-II)或其药学上可接受的盐的制备方法
，所述方法包括以下步骤：
(a)使用根据如上定义的实施方式A13E1、A13E2、A13E3、A13E4、A13E5或A13E6之任一的方法制备5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)，和
(b)将所述5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮转化为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸。
在另一个方面A16中，本发明提供了将(R)-3-氨甲基-5-甲基己酸转化为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸的方法，其包括用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理(R)-3-氨甲基-5-甲基己酸。
在另一个方面A17中，本发明提供了用于增加(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸在(R)-和(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸的混合物中的比例的方法，包括用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理所述混合物。
在另一个方面A18中，本发明提供了可用于将5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3，4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)转化为普瑞巴林的转氨酶。
在第一实施方式A18E1中，本发明提供了具有与下列氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列的转氨酶
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHX27RGTVVVTHGEGPYX41VDVX45GRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRX147NAYHGVTAVSASMTGX163PX165NSVFGLPLPGFVHLX180CPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELX304KRLETAIEAIEEFPHGFTAX324GHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSX401RIANTCX408DLGLICX415X416X417GQSVILX424PPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ ID NO.1)
其中
X27选自谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)；
X41选自异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)；
X45选自天冬酰胺(N)和组氨酸(H)；
X147选自天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
X163选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；
X165选自酪氨酸(Y)和组氨酸(H)；
X180选自苏氨酸(T)；甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；
X304选自丙氨酸(A)和丝氨酸(S)；
X324选自甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；
X401选自赖氨酸(K)和谷氨酸(E)；
X408选自苏氨酸(T)和谷氨酰胺(Q)；
X415选自丝氨酸(S)和丙氨酸(A)；
X416选自脯氨酸(P)和丙氨酸(A)；
X417选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；和
X424选自半胱氨酸(C)和丝氨酸(S)。
在其它的实施方式A18E2中，本发明提供了根据实施方式A18E1的具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列的转氨酶。
在其它的实施方式A18E3中，本发明提供了根据实施方式A18E1或A18E2的转氨酶，其中：
X27是谷氨酸(E)；
X147是谷氨酰胺(Q)；
X165是组氨酸(H)；
X304是丝氨酸(S)；
X324是甘氨酸(G)；
X401是赖氨酸(K)；
X408是谷氨酰胺(Q)；
X416是丙氨酸(A)；
X417是甲硫氨酸(M)；和
X424是丝氨酸(S)。
在其它的实施方式A18E4中，本发明提供了根据实施方式A18E2的具有选自下列的氨基酸序列的转氨酶：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHQRGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELAKRLETAIEAIEEFPHGFTASGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSERIANTCTDLGLICSPMGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.2)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.3)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.4)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGMPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPALSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.5)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLGCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICAAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.6)；和
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVHGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLSCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.7)。
在另一个方面A19中，本发明提供了(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸((S)-II)或其药学上可接受的盐的制备方法
，所述方法包括用根据实施方式A18E1、A18E2、A18E3和A18E4之任一的转氨酶处理5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)和胺的步骤。
优选实施方式的详细描述
术语“烷基”是指含有指定数目的碳原子的直链或支链饱和脂肪烃基(radical)。烷基的例子包括甲基，乙基，n-丙基，异丙基，n-丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，新戊基和n-己基。
术语“烷氧基”是指由连接至氧原子的如上定义的烷基构成的基团。烷氧基的离子包括甲氧基，乙氧基和异丙氧基。
术语“烷氧基-烷基”“是指其中烷氧基取代了烷基氢原子的直链或支链饱和脂肪烃基。烷氧基-烷基的例子是2-甲氧基乙基。
术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被氟、氯、溴或碘替换的如上定义的烷基。当多于一个氢原子被替换时，替换的卤素原子可以是相同的或不同的。卤代烷基的例子包括氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，氯二氟甲基，2,2,2-三氟乙基和3-溴丙基。
术语“芳基”是指苯基或萘基。
术语“芳基-烷基”是指其中芳基取代了烷基氢原子的直链或支链饱和脂肪烃基。芳基-烷基的例子是苄基。
术语“环烷基”是指含有指定数目的碳原子的饱和单环或多环碳环。单环环烷基的例子包括环丙基，环丁基，环戊基和环己基。多环环烷基的例子包括二环[2,2,1]庚基和二环[3,2,1]辛基。
关于烷基或芳基的术语“任选取代”是指烷基或芳基的氢原子可以被列出的基团之一替换。取代可以在烷基或芳基中的任何位置发生。当任选取代是使用“一个或多个基团”时，则烷基或芳基的任何数目的氢原子，多至等于存在于烷基或芳基中的氢的数目的最大数目，可被替换，并且各替换是相互独立的。
术语“对映体过量”，有时缩写为“e.e.”，是对于给定的样品，一种对映体超过其对映异构体的过量的测量并表达为百分比。对映体过量定义为：
100x(er-1)/(er+1)
其中“er”是量较多的对映体对量较少的对映体的比率。
5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)是3-氨甲基-5-甲基己酸(II)的制备中的适宜的中间体。在化学还原剂的存在下用氨对外消旋(IA)的处理提供了外消旋的3-氨甲基-5-甲基己酸((R/S)-II)(见WO2008/127646A2)。推测该反应牵涉开环的异构体(IB)。
在转氨酶的存在下使用胺供体的还原性胺化可提供对映体富集的3-氨甲基-5-甲基己酸。合适的胺供体是伯胺例如单-烷基胺，特别是异丙胺，和α-氨基酸。
(IA)与适合的胺脱氢酶/亚胺还原酶在氨的存在下的反应也可以是对普瑞巴林的合适途径。可能需要化学计算量的辅助因子例如NADH或NADPH，或可包括第二氧化还原酶例如甲酸脱氢酶以再循环辅助因子。
其中二氢呋喃酮(IA)在C-4位置上具有确定的立体化学，此立体化学可在还原性胺化反应过程中被保留。由于普瑞巴林具有(S)-立体化学，可优选具有已经存在于二氢呋喃酮中的此立体化学。
可选择地，二氢呋喃酮(IA)可以以外消旋形式使用。随后可以通过在允许单一对映体的立体选择性形成的条件下进行还原性胺化反应，例如通过在转氨酶的存在下进行转化，或通过使产物经历单独拆分步骤，例如通过与手性酸或碱结晶，来获得产物的所需的立体异构体。
可通过使用下文示出的方法以外消旋或对映体富集形式方便地制备二氢呋喃酮(IA)。
在第一方法中，二氢呋喃酮(IA)通过还原5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-5H-2-呋喃酮(VIA)制备。
该还原可通过在合适的催化剂的存在下进行氢化来方便地完成。合适的催化剂包括均相和多相催化剂。催化剂一般包括过渡金属例如钯、铂、铑、钌或镍，或其盐或氧化物。多相催化剂包括细碎的金属和衬底支持的金属和金属氧化物，其中衬底可以是碳、二氧化硅，氧化铝或任何其它合适的惰性材料。均相催化剂包括过渡金属的膦配位体络合物。当膦配体为手性时，则催化剂是手性的。当使用非手性催化剂时，则产物是外消旋二氢呋喃酮(IA)。手性催化剂的使用可以以对映选择性方式提供二氢呋喃酮(IA)。
当反应在碱性介质中进行时可改善氢化反应的选择性和总产率。不受理论束缚，据信在碱的存在下呋喃酮主要以开环的盐(IX)存在。
可以使用任何合适的碱，只要它不干扰氢化过程，例如通过使催化剂中毒。合适的碱的例子包括碱(例如Li，Na，K和Rb)和碱土金属(例如Ca和Mg)氧化物、氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。还可使用其它金属盐，例如锌盐。由于其良好的溶解性和/或低毒性，碱金属盐可以是优选的。胺碱例如氨以及伯、仲和叔胺可用于制备铵盐。还可使用四烷基氢氧化铵，导致四烷基铵盐的形成。
式(IX)的盐的氢化提供了式(X)的盐。
在氢化反应之后，通过用合适的酸处理该盐来回收二氢呋喃酮(IA)。可选择地，可通过用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶处理来将该盐直接转化为3-氨甲基-5-甲基己酸(II)。在这种情况下，可优选使用铵盐(M+＝NH4 +)或烷基伯铵盐(M+＝烷基-NH3 +)，因为铵或烷基铵离子提供了酶的辅底物。异丙基铵盐与转氨酶的组合使用是优选的例子。
其中R不是氢的式(VI)的呋喃酮还可通过氢化还原。当R是烷基、卤代烷基、烷氧基烷基烯基、环烷基、环烷基-烷基、芳基或芳基-烷基时，这些呋喃酮可以从式(VIA)的化合物通过与醇R-OH在酸催化剂的存在下反应来制备。当R是R1-C(O)-时，呋喃酮可以从式(VIA)的化合物通过与酸酐(R1-C(O))2O或酰基氯R1-C(O)-Cl任选在碱例如叔胺的存在下反应来制备。当R是R2-SO2-时，呋喃酮可以从式(VIA)的化合物通过与磺酰氯R2-SO2-Cl任选地在碱例如叔胺的存在下反应来制备。
在氢化步骤后，式(IA)的二氢呋喃酮可以从还原产物通过用酸(当R是烷基、卤代烷基、烷氧基烷基烯基、环烷基、环烷基-烷基、芳基或芳基-烷基时)或碱(当R是R1-C(O)-或R2-SO2-时)处理来产生。
手性R基团的使用可提供手性氢化产物而无需手性催化剂。
例如，呋喃酮(VIA)与手性醇R*-OH反应以提供手性醚衍生物(VIB)。
合适的手性醇可包括α-芳基醇例如1-苯基乙醇和1-萘基乙醇，以及萜烯醇例如薄荷醇和冰片。衍生物(VIB)的氢化可以以对映选择性方式进行，随后用合适的酸处理所得到的产物并在水的存在下提供手性形式的二氢呋喃酮(IA)。
呋喃酮(VIA)可从式(VII)的化合物通过在酸催化剂的存在下用水处理式(VII)的化合物来制备
其中-X-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
。合适的酸包括无机酸例如硫酸。可选择地，式(VII)的化合物可以用醇R-OH处理以直接提供式(VI)的化合物，其中R是烷基、卤代烷基、烷氧基烷基烯基、环烷基、环烷基-烷基、芳基或芳基-烷基。
式的化合物(VII)可以通过式(VIII)的二烯胺与乙醛酸或其水合物的反应来制备。
其中-Y-表示单键、-CH2-、-O-、-NH-、-N((C1-C3)烷基)-、-N(苄基)-、或
应理解，式(VII)中的-X-相应于式(VIII)的起始材料中的-Y-，除了当-Y-是
时，则-X-是
其中-Y-表示单键或-CH2-的式(VIII)的化合物已通过4-甲基-2-戊烯醛与吡咯烷或哌啶的反应来制备(Kienzle,F.等人,Helv.Chim.Acta1985,68(5),1133-39)。可以类似地制备式(VIII)的其它化合物。
可选择地，异丁醛和乙醛在合适的胺例如吡咯烷、哌啶或吗啉的存在下与溶剂例如乙腈中的催化酸的缩合提供二烯胺衍生物(VIII)。
Y＝单键、CH2、O、N(烷基)、N(苄基)
如果哌嗪用作胺，则获得双-二烯胺。
其中Y是NH的式(VIII)的化合物可以通过使用单保护哌嗪作为胺接着进行脱保护步骤来获得。
还可使用无环仲胺例如二乙胺和二异丙胺，但环状仲胺是优选的。
异丁醛和乙醛的这种反应模式不同于直接的碱催化反应(例如使用碳酸钾作为碱：英国专利GB834100)，其仅产生其中异丁醛用作亲核体的加合物2,2-二甲基-3-羟基丁醛。
不希望受任何具体理论的束缚，假设乙醛和异丁醛两者最初被转化为它们的烯胺衍生物。在酸催化剂的存在下，更加碱性的异丁烯胺被转化成其亚胺离子。该亲电子物质优先与较少空间位阻的亲核体(其为乙醛烯胺)反应-这确保反应围绕期望的方式进行。
本发明的方法比实现正常乙醛反应性的这种“极反转”的文献方法更经济并且更适合于按比例放大，在文献方法中乙醛被转化为O-甲烷硅基化烯醇衍生物并与异丁醛在Mukiyama羟醛条件下偶联。在本发明中，两种偶联配偶体被同时活化-电子和空间效应，指导所观察到的反应性模式。另一优点是，产物二烯胺是4-甲基-2-戊烯醛用于与乙醛酸反应以形成所需的5-氨基呋喃酮(VII)的期望的“活化”形式。
这些式(VIII)的二烯胺衍生物可被分离和纯化，或可选择地它们可以直接用乙醛酸(或其水合物)处理，这直接提供呋喃酮衍生物(VII)。
呋喃酮衍生物(VII)可被分离和纯化。随后使用酸水溶液的处理提供呋喃酮(VIA)。
总体而言，上文示出的转化提供了用于使用廉价且安全的起始材料制备普瑞巴林的短路径。
在可选择的实施方式中，二氢呋喃酮(I)从3-亚异丁基-2-氧代戊二酸(XII)制备，所述(XII)由异丁醛与2-氧代戊二酸(α-酮戊二酸)(XIV)的缩合容易地获得。
二酸(XII)至二氢呋喃酮(I)的转化需要脱羧步骤和还原步骤。这两个处理步骤可以分开进行，在这种情况下脱羧步骤或还原步骤可以是第一步骤，或者这两个过程可同时进行。当还原步骤首先进行时，将产生中间体(XV)。当脱羧步骤首先进行时，将产生中间体(ⅩⅥ)。
还原步骤可化学地进行，例如通过氢化，但优选使用酶介导的还原例如通过用烯酮还原酶处理来实现。脱羧步骤优选通过用脱羧酶处理化合物来进行。
当实施酶介导的转化时，所述酶可以是分离的酶，包括固定在载体上的酶，其可以是部分分离的酶制剂例如细胞匀浆，或者其可以是非分离的酶，在该情况下使用全细胞制备物。细胞可包括天然表达所需的酶的细胞和已被操纵以便表达所需的酶的细胞。
式(IA)的化合物的酶介导的还原性胺化是可逆的，因此用转氨酶或胺氧化酶/亚胺还原酶对3-氨甲基-5-甲基己酸(II)的处理可导致形成二氢呋喃酮(IA)。该化合物的开环异构体是化合物(IB)，其是可差向异构化的。鉴于此，可能的是使用这样的酶将((R)-II)转化为((S)-II)或者增加((R)-II)和((S)-II)的混合物的光学纯度。
实施例
本发明通过其中使用下列缩写和定义的下列非限制性实施例举例说明：
bp 沸点
CPME 环戊基甲醚
d 双峰
DIW 去离子水
dd 双二重峰
eq or eq. 当量
e.e.or ee 对映体过量
ES+ 正模式电喷雾电离
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
GC 气相色谱
GC/MS 气相色谱/质谱
HOAc 乙酸
HPLC 高效液相色谱法
Hr或h 小时
1H NMR 质子核磁共振波谱
L 升
LCMS 液相色谱/质谱
M 多重峰
mbar 毫巴
MeOH 甲醇
min 分钟
mL 毫升
mmol 毫摩尔
mol 摩尔
Mp 熔点
MTBE 甲基叔丁基醚
NAD+ 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化的)
NADP+ 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化的)
NADH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原的)
NADPH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原的)
PLP 磷酸吡哆醛
ppm 百万分率
pTsOH 对甲苯磺酸
q 四重峰
qNMR 定量核磁共振波谱
Rf 滞留因子
RT 室温
s 单峰
t 三重峰
ThDP 二磷酸硫胺
TLC 薄层色谱
TsOH 甲苯磺酸(＝pTsOH)
UPLC 超高效液相色谱
XRD X射线衍射结晶学
δ 化学位移
原样使用商业化学品，除非另有说明。薄层色谱在预涂覆塑料板(Merck硅石60F254)上进行，并使用UV光和KMnO4浸渍显影。质子(1H)和碳(13C)NMR光谱在Varian INOVA300MHz光谱仪上记录。化学位移相对于四甲基硅烷引述并视情况而定参照残留溶剂峰。除非另外指出，否则使用Agilent 1200HPLC系统进行手性HPLC分析，并使用Chemstation软件处理数据，或用Varian半制备/分析性HPLC使用Galaxie软件进行。
实施例1
从4-甲基-2-戊烯醛制备4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-5H-2-呋喃酮
将乙醛酸(29.6g，0.2mol)在水中的50％溶液加入到已被预冷却至0-10℃的吗啉(17.8g，0.2mol)和庚烷(75mL)的二相搅拌混合物中。保持温度低于10℃。将混合物升温至20℃并加入4-甲基-2-戊烯醛(19.6g，0.2mol)。将混合物在45℃搅拌20h。形成了大量固体。在环境温度下加入水(100mL)，并将混合物搅拌2h。用环戊基甲醚(100ml)萃取混合物，用水(100mL)洗涤有机溶液两次，并浓缩以留下30.4g的粗产物。将该固体通过从甲醇(100mL)重结晶来纯化以提供17.7g(40％)纯的4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-5H-2-呋喃酮。
GC/MS:m/z＝223
1H NMR:δ6.0(s,1H)；5.9(s,1H)；5.5(s,1H),3.7(d,4H),2.7(d,4H),2.00(s,3H),1.95(s,3H)。
实施例2
4-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)吗啉的制备
将异丁醛(46.90g，0.65mol，1.43eq.)在乙腈(300mL)中搅拌。将吗啉(56.63g，0.65mol，1.43eq.)随后pTsOH(8.63g，0.1当量)在室温下缓慢加入至异丁醛溶液。将乙腈(100mL)中乙醛(20g，0.454mol)的溶液于1h内在监控在50℃的内部温度下逐滴加入。完成添加后，将混合物在50℃搅拌30min，然后冷却至室温，随后在真空中蒸发溶剂以产生橙色油状物(123.3g)。通过定量NMR使用苯甲酸苄酯作为内标对粗产物的含量测定为40％，这给出了所需二烯胺的65％的产率。
GC/MS:m/z＝167
1H NMR:δ6.01(d,1H)；5.69(d,1H)；5.31(dd,1H),3.70(m,4H),2.89(m,4H),1.71(s,3H),1.63(s,3H)。
实施例3
从粗4-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)吗啉制备4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代- 5H-2-呋喃酮
将实施例2的粗4-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)吗啉二烯胺(123.3g，40％含量测定)在室温下溶解在甲醇(300ml)中。完全溶解后，加入乙醛酸(50wt％，60g，1.1eq)，并在50℃下将所得的二相混合物搅拌18h。将反应混合物冷却到室温，并通过旋转蒸发除去溶剂。将残留物分隔在乙酸乙酯(200mL)和饱和碳酸钠溶液(200mL)之间。将水相用乙酸乙酯(100ml)萃取并用盐水洗涤合并的有机物并蒸发至稠油状物，将其静置固化(89.0g，由qNMR含量测定67％，60％产率)。
GC/MS：m/z＝223
NMR：如实施例1。
实施例4
从异丁醛和乙醛在一锅中制备4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-5H-2-呋喃酮。
将异丁醛(102.90g，1.43mol)在乙腈(600mL)中搅拌。将吗啉(124.3g，1.43mol)随后pTsOH(19.0g，0.1当量)在室温下缓慢加入至异丁醛溶液。将在乙腈(150mL)中乙醛(44.05g，1.0mol)的溶液于1hr内在监控在50℃的内部温度下逐滴加入。完成添加后，将混合物在50℃搅拌30min，然后冷却至<10℃。加入乙醛酸(50wt％，211.3g，1.43mol)，并在50℃下将所得的二相混合物搅拌18h。将反应混合物冷却到室温，并通过旋转蒸发除去溶剂。将残留物分隔在乙酸乙酯(1L)和饱和碳酸钠溶液(1L)之间。将水相用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤合并的有机物并蒸发至稠油状物，将其静置固化(166g)。在室温下用MTBE研磨粗产物。将产物通过过滤收集并用MTBE洗涤以产生与实施例1中制备的材料相同的纯的4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-5H-2-呋喃酮(84g，37％产率)。粗固体(166g)的分析表明约50％产率。
实施例5
1,4-双-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)哌嗪的制备
制备哌嗪(43.0g，0.5mol)和4-甲苯磺酸一水合物(4.4g，0.023mol)在乙腈(600mL)中的溶液。将该溶液加热至50℃并在10min内加入异丁醛(100mL，1.10mol)。该溶液在颜色上变为橙红色并且出现瞬态白色沉淀。随后通过注射泵在3h内于50℃下加入乙醛(30.8g，0.70mol)在乙腈(30mL)中的溶液。将形成的悬浮液在50℃下搅拌0.5h。除去溶剂，并将残余的固体在-5℃下从甲醇(500ml)分离出。将其过滤并用冷甲醇洗涤并干燥以提供52.9g(60％)的1,4-二-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)哌嗪。
GC/MS:m/z＝246.
1H NMR:δ6.00(d,2H)；5.70(d,2H)；5.28(dd,2H)；2.92(s,8H)；1.73(s,6H)；1.68(s,6H).13C NMR(CDCl3):140.6(C),126.3(CH),123.4(CH),100.2(CH),48.2(CH2),25.8(CH3),18.1(CH3)。
实施例6
从1,4-双-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)哌嗪制备5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)。
将1,4-双-(4-甲基-1,3-戊二烯-1-基)哌嗪(37.3g，0.151mol；参见实施例5)加入到甲醇(300ml)中。将温度调节至34℃，并迅速(在5min内)加入乙醛酸(44.9g，0.302mol)在水中的50％溶液。将所得悬浮液在45℃下搅拌15h；冷却至0-10℃进行2h，并过滤。该固体用甲醇(100mL)洗涤并干燥以提供纯的5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)(32.3g，60％)。可以从母液通过浓缩获得额外的5％。
1H NMR:δ5.96(d,2H),5.87(d,2H),5.56(m,2H),2.71(s,8H),2.07-1.90(m,12H).13C NMR(CDCl3):172.3(C),159.2(C),150.9(C),116.6(CH),115.4(CH),99.2(CH),46.7(CH2),28.2(CH3),21.4(CH3)。
此反应还可在异丙醇、乙腈-水、甲苯-水或在庚烷水中以类似的产量进行。
实施例7
从异丁醛和乙醛在一锅中制备5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1- 基)呋喃-2(5H)-酮)。
将对甲苯磺酸(6.5g，0.03mol)加入到哌嗪(59g，0.69mol)在乙腈(240mL)中的溶液中。将反应加热至50℃并搅拌直至观察到固体溶解，随后加入异丁醛(138mL，1.51mol)。在将乙醛(60mL，1.07mol)在乙腈(30mL)中的溶液通过注射泵在3h内加入到容器之前，将反应物保持在50℃。完成添加后，将反应搅拌另外30分钟随后将乙醛酸(148g，1.0mol)在水中的50％w/w溶液在5min内添加到反应混合物中，接着加入水(50ml)。然后将反应加热至70℃进行2h，然后至50℃过夜。然后将反应冷却至5℃，并保持30分钟。沉淀5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)并通过过滤分离，并用乙腈(2×100mL)洗涤以产生所需产物(126g，93.5％含量测定，从乙醛66％的产率)。
实施例8
5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)的无溶剂制 备
将异丁醛(79g，100mL，1.1mol)加入到3颈圆底烧瓶中，将氩气通过该系统进行冲洗。将哌嗪(43g，0.5mol)和TsOH-H2O(4.4g；0.023mol)分成含有哌嗪(10.75g)和TsOH-H2O(1.1g)的4等份。第一部分哌嗪(10.75g)的加入导致从24℃至35℃的放热。随后加入第一部分TsOH(1.1g)。将反应物搅拌，直至所有哌嗪溶解(t＝35℃)，在此之后加入第二部分哌嗪(10.75g)，随后加入TsOH(1.1g)(t＝41℃)。继续搅拌，直到所有哌嗪溶解(t＝41℃)，接着加入第三部分哌嗪(10.75g)，随后加入TsOH(1.1g)。在第3次加入后产生澄清的溶液，随后加入第四部分哌嗪(10.75g)和TsOH-H2O，然后加入TsOH(1.1g)(t＝52℃)。完成添加后将反应物在50℃下搅拌30min。
另一烧瓶(50mL)中，加入乙醛(30.8g，39mL，0.7mol)，并置于冰水浴(0-2℃)中。将乙醛烧瓶经由隔片通过套管连接至3颈烧瓶。随后使氩气流以确保乙醛的加入在3h内完成的速率通过乙醛烧瓶。在加入所有的乙醛后，将反应物在50℃下搅拌30min，然后冷却至40℃并以保持温度低于50℃的速度在45min内滴加50％乙醛酸(104g，78mL)。然后加入水(100mL)，并将反应物加热在70℃进行5h。将反应物在冰-水浴中冷却至4℃。将沉淀的产物过滤并用冷水(100mL)洗涤滤饼。在50℃下在真空中干燥后获得88.9g(71％)的所需产物。沉淀物含有78.5％的标题化合物(HPLC测定)。
实施例9
5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)通过同时加 入两种醛的替代制备
将哌嗪(236.6g)加入到装有温度计、加料漏斗(100mL)和回流冷凝器的干净3L干容器中。将pTsOH(25.3g)加入到容器中，接着加入乙腈(550mL)。开启搅拌器和将该容器用氮气惰性化。将异丁醛(150mL，总装料的27％)加入到搅拌的哌嗪/pTsOH浆液并观察到温度上升至约43℃。然后将白色悬浮液加热至50℃(+/-5℃)。将异丁醛(400mL，总装料的73％)和冰冷乙醛(260mL)的预混合冰冷溶液加入干净的干燥1L容器中，使该混合物保持在冰浴中。将异丁醛/乙醛混合物以100mL等分试样在50℃下于5-6h内加入到3L容器的内容物中。在加入乙醛期间反应烧瓶的内容物从白色悬浮液改变为酒红色溶液，最后为橙色悬浮液。完成添加后，将悬浮液在50℃下搅拌，进行约0.5至1.0h。
将乙醛酸(50％wt/wt)水溶液在10-15min内加入到该悬浮液中，温度上升至约75℃。观察到5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)从溶液结晶。在70℃(+/5℃)下搅拌悬浮液6h，然后在搅拌下冷却至环境温度。然后将该批料冷却至-5至0℃下进行并保持3-4h，随后将悬浮液过滤，用冷甲醇洗涤(1×500mL)滤饼，然后用2×500mL的甲醇在环境温度下洗涤。洗涤后的产物在真空干燥箱中在40-50℃下干燥至恒重，得到474g的98％纯的5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)(70％)。
实施例10
从4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-2(5H)呋喃酮或5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4- (2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)制备5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2 (5H)-酮。
将10％w/w硫酸水溶液(110g)加入到4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-2-(5H)-呋喃酮(20.0g，0.896mol)，并以回流搅拌该混合物4h或直到TLC(100:3CPME：HOAc)表明反应完成。混合物在任何时候维持悬浮。然后将其冷却到5℃，保持2h，并过滤。用水洗涤白色固体，并干燥以提供5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮(12.9g，93％)。
可选择地，将硫酸(412g)的10％w/w水溶液加入到含有5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)(60g，0.167mol)的容器中。将内容物搅拌，然后加热以回流。将反应保持在回流下直到起始物质被耗尽，这由溶解测定。在反应完成后，将该批料冷却到35℃，此时靶化合物开始结晶。该浆液进一步被冷却至0-5℃，然后转移至过滤器。将产物过滤，用水(2×100mL)洗涤，随后在<50℃下真空干燥，得到5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮(42.0g，81％)。
GC/MS:m/z＝154
1H NMR(CDCl3):δ6.10(s,1H)；5.92(s,1H)；5.88(s,1H)；5.35(bs,1H,O-H)；1.98(s,3H)；1.93(s,3H).13C NMR(CDCl3):172.8(C),161.4(C),152.3(C),115.3(CH),114.9(CH),99.5(CH),28.2(CH3),21.4(CH3)。
实施例11
从异丁醛和乙醛以一锅制备5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮。
将哌嗪(43.0g，0.5mol)和异丁醛(200mL)的混合物在Dean-Stark下回流直至收集理论量的水(18ml)。将过量的异丁醛溜出以留下1,4-双(2-甲基丙烯-1-基)哌嗪的结晶块。将其溶解于乙腈(1.2L)并加入额外的异丁醛(100mL，1.0mol)。加入额外的哌嗪(4.4g)，接着加入p-甲苯磺酸(4.4g，23.2mmol)。将温度调节到40℃并在4h内加入乙醛(44g，1.0mol)在乙腈(40ml)中的溶液。将反应混合物在40℃下1h和在环境温度下搅拌4h。将乙腈溜出，并将残余物悬浮于甲苯(400mL)。在0.5h内加入50％乙醛酸(148g)和水(150ml)的混合物。然后将混合物在45℃下搅拌15h。产生了固体沉淀。加入稀硫酸(10％，1L)，并使混合物回流3h。产生二相混合物。分离甲苯相。其含有通过分析约50％产率(基于乙醛)的5-羟基-4-(2-甲基丙烯-1-基)-2-呋喃酮。
实施例12
5-甲氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮的制备
将4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-2-(5H)-呋喃酮(7.70g，34.5mmol)用H2SO4(4mL，2.2eq.)在MeOH(50mL)中以回流搅拌3h直至起始材料消失(通过GC)。将反应混合物冷却到室温。然后将溶剂真空蒸发并将残余物用EtOAc(50mL)稀释。用H2O(3×50mL)洗涤有机相。然后真空蒸发溶剂，得到为橙色油状物(5.50g，95％)的5-甲氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮，其可无需纯化地使用。
可选择地，将5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)(130g，363mmol)和MeOH(690mL)在机械搅拌下加入2L圆底烧瓶以形成悬浮液。于20-25℃在搅拌下滴加浓H2SO4(43mL，762mmol)，观察到轻微放热，存在的固体的性质从分散和容易混合改变成较稠的浆体。使反应混合物回流5h。在0.5h后观察到完全溶解(橙色液体)。5h后LCMS显示～99％的所需产物。将混合物冷却至室温，静置用于哌嗪硫酸盐的结晶。过滤沉积物，用冰冷的MeOH(400mL)洗涤滤饼。将滤液真空浓缩(40℃浴温)，将残余物分隔在水(50mL)和MTBE(300mL)之间。分离水层并另外萃取(2x300mL的MTBE)。合并的有机萃取物用饱和的aq.NaHCO3(200mL)洗涤。MTBE层在搅拌下于Na2SO4上干燥1.5h，过滤并蒸发，得到为橙色油状物(120g，98％)的5-甲氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮。
在0.2-0.3mbar真空下以bp 100-105℃蒸馏。GC/MS:m/z＝168；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.59(1H,s)5.88-5.86(1H,m)5.75(1H,d,J＝0.6)3.53(3H,s)2.01-2.00(3H,m)1.97-1.96(3H,m).13C NMR(CDCl3):171.4(C),159.2(C),151.9(C),115.8(CH),115.2(CH),104.4(CH),56.1(CH3),28.2(CH3),21.4(CH3)。
下列化合物由4-(2-甲基-1-丙烯基)-5-吗啉代-2(5H)-呋喃酮根据上述方法的第一种通过用3-甲基丁醇(异戊醇)、n-戊醇(戊基醇)或n-丁醇替换甲醇来制备：
实施例12A
5-(3-甲基丁氧基)-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮
在0.4mbar真空下以bp 139-140℃蒸馏；GC/MS:m/z＝224；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.94(1H,s)5.87-5.84(1H,m)5.80(1H,s)3.86-3.80(1H,m)3.70-3.64(1H,m)2.00(3H,s)1.96(3H,s)1.77-1.66(1H,m)1.57-1.50(2H,m)0.93-0.91(3H,m)0.91-0.89(3H,m)
实施例12B
4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)-5-戊氧基呋喃-2(5H)-酮
在0.08mbar真空下以bp 123-134℃蒸馏；GC/MS:m/z＝224；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.94(s,1H)；5.86(s,1H)；5.80(s,1H)；3.84-3.75(m,1H)；3.68-3.59(m,1H)；2.01(s,3H)；1.95(s,3H)；1.69-1.59(m,2H)；1.38-1.29(m,4H)；0.95-0.85(m,3H)
实施例12C
5-丁氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮
在0.05mbar真空下以bp 136-146℃蒸馏；GC/MS:m/z＝210；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.94(s,1H)；5.86(s,1H)；5.80(s,1H)；3.85-3.76(m,1H)；3.69-3.60(m,1H)；2.00(s,3H)；1.95(s,3H)；1.68-1.58(m,2H)；1.45-1.32(m,2H)；0.93(t,3H,J＝7.4Hz)
实施例13
5-甲氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮的制备
将5-甲氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮(100g，参见实施例12)在MTBE(700mL)中的溶液、5g(5wt％)的10％Pd/C加入到氢化容器中。导入1atm的氢气并在反应过程中保持压力恒定。在20℃下7h后，将反应物通过硅藻土垫(H＝30mm)过滤并用MTBE(3×50mL)冲洗。将滤液用1M NaHCO3溶液(200mL)、水、盐水洗涤，并在Na2SO4上干燥。除去溶剂后，获得5-甲氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮为无色液体(98g，96％)。
GC/MS:m/z＝172
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.25(d,J＝5.0Hz,0.53H,主要异构体),5.04(d,J＝2.4Hz,0.26H,次要异构体),3.48(s,0.92H,次要异构体),3.46(s,1.66H,主要异构体),2.78(dd,J＝17.7,8.6Hz,0.33H),2.59–2.42(m,1.27H,主要异构体),2.42-2.34(m,0.33H,次要异构体),2.29(dd,J＝16.7,11.8Hz,0.63H,主要异构体),2.15(dd,J＝17.7,4.6Hz,0.33H,次要异构体),1.67–1.31(m,2.63H两种异构体),1.28–1.19(m,0.33H,次要异构体),0.95–0.86(m,6H两种异构体).13C NMR(CDCl3):177.7(C,主要异构体),176.04(C,次要异构体),110.1(CH,次要异构体),106.1(CH,主要异构体),57.0(CH3,次要异构体),56.6(CH3,主要异构体),41.2(CH2,次要异构体),39.1(CH2,次要异构体),38.3(CH2,主要异构体),37.1(CH2,主要异构体),33.9(CH,次要异构体),32.8(CH,主要异构体),26.0(CH,主要异构体),25.8(CH,次要异构体),23.0(CH3,主要异构体),22.9(次要异构体),22.7(主要异构体),22.6(次要异构体)。
通过使用相同的一般性方法和分别从实施例12A、12B和12C的化合物起始，还获得了下列化合物：
实施例13A
5-(3-甲基丁氧基)-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮
GC/MS:m/z＝228；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(0.86H,d,J＝5.0Hz)5.13(0.14H,d,J＝2.7Hz)3.87-3.79(m,1H)3.57-3.45(m,1H)2.58-2.37(2H,m)2.35-2.27(0.79H,m)2.20-2.11(0.21H,m)1.74-1.62(1H,m)1.61-1.44(4H,m)1.42-1.31(1H,m)0.95-0.86(12H,m)
实施例13B
4-(2-甲基丙基)-5-戊氧基二氢呋喃-2(3H)-酮
GC/MS:m/z＝228；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(0.77H,d,J＝5.0Hz)5.13(0.23H,d,J＝2.6Hz,)3.83-3.75(1H,m)3.55-3.40(1H,m)2.59-2.37(2H,m)2.32(0.73H,dd,J＝16.6,11.8Hz)2.15(0.27H,dd,J＝17.7,5.0Hz)1.67-1.45(4H,m)1.41-1.25(5H,m)0.96-0.86(9H,m)
实施例13C
5-丁氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮
GC/MS:m/z＝214；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(0.8H,d,J＝5.0Hz)5.13(0.2H,d,J＝2.6Hz,)3.85-3.75(1H,m)3.56-3.41(1H,m)2.59-2.38(2H,m)2.31(0.76H,dd,J＝16.5,11.7Hz)2.15(0.24H,dd,J＝17.6,5.0Hz)1.66-1.45(4H,m)1.43-1.30(3H,m)0.95-0.87(9H,m)
实施例14
5-(L-孟氧基)-4-(2-甲基-1-丙烯基)-2(5H)-呋喃酮的制备和氢化
将5-羟基-4-(2-甲基-1-丙烯基)-2-呋喃酮(59.5g，0.386mol)、L-薄荷醇(89.5g，1.5当量)和甲磺酸(1.5g)的混合物在70-80℃于真空下(以除去水)搅拌100h。液体物料倾倒(热)于乙腈(450mL)中，并通过冷却、过滤和洗涤分离标题化合物。产率为76.2g(67％)。对于XRD合适的结晶通过丙酮溶液的缓慢蒸发生长。在缩醛碳上的构型为(R)。
5-(L-孟氧基)-4-(2-甲基-1-丙烯基)-2-呋喃酮在乙酸乙酯中使用实施例13的条件的氢化产生定量产率的饱和衍生物。通过1H NMR，该化合物是非对映体的1:1混合物。
实施例15
5-乙酰氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮的制备
将5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮(19g，0.123mol)在乙酸乙酯(100mL)中的悬浮液用固体碳酸钠(13.1g，0.123mol)和四丁基硫酸氢铵(0.5g)处理。一次性加入乙酸酐(18.8g，1.5eq.)。接着发生了温和的放热反应。将混合物搅拌过夜，加入水(100mL)，并将有机相分离(水相的pH为6.0)。将乙酸乙酯相用水洗涤并浓缩以留下固体(24.6g，100％)。这通过TLC(100:3CPME：乙酸)纯化。如果该反应在乙酸异丙酯中进行，纯化合物可通过在水洗涤后冷却乙酸异丙酯溶液中以约70％的产率进行分离。
m/z：196
实施例16
5-乙酰氧基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮的氢化
实施例34的材料在与实施例13中所概述的相同的条件下氢化以产生>90％产率的5-乙酰氧基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-2(5H)-呋喃酮作为非对映体的1：1混合物。该产物伴随有约5％的4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮。该产物可按实施例30进行水解以产生5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮/3-甲酰基-5-甲基己酸。
实施例17
通过5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮在碱性溶液中的氢化制备 5-羟基-4-(2-甲基丙基)二氢呋喃-2(3H)-酮(IA)
将5-羟基-4-(2-甲基丙烯-1-基)-2-呋喃酮(3.35g，21.7mmol)和水(20mL)加入到氢化器中。随后将氢氧化钾(1.21g，1eq)加入到容器中，将内容物加热至40℃直到发生溶解。将10％Pd/碳催化剂(0.67g)加入到容器中，随后将反应器内容物在40℃和5barg氢压下氢化。反应完成后，将反应物冷却，并通过过滤除去催化剂。将pH通过加入36％盐酸调节至pH 2并用甲苯洗涤水层以萃取所需的产物。将合并的甲苯萃取物浓缩，得到标题化合物(3.17g，92％)。
实施例18
5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮在中性溶液中的氢化
将5-羟基-4-(2-甲基丙烯-1-基)-2-呋喃酮用10％w/w的Pd/C催化剂以每克起始材料6mL水进行氢化。(22h，40℃，10bar)。在过滤后，油相从水分离。这是5-羟基-4-(2-甲基丙基)二氢呋喃-2(3H)-酮(IA)和4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2-酮的1:1混合物。化合物(IA)可以容易地通过酸碱萃取来分离纯化。用2-丙醇在有机溶剂中重复此反应从而产生相对纯的(IA)。
实施例19
从5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)以一锅制 备5-羟基-4-(2-甲基丙基)二氢呋喃-2(3H)-酮(IA)
将5,5'-(哌嗪-1,4-二基)双(4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮)(50.0g，0.14mol)加入到含有硫酸(16.0g，0.163mol)的水(300mL)中。加入乙酸异丙酯(200mL)。加入50％水湿润的5％钯碳(3.0g)，并将该混合物在环境温度下氢化(5bar氢)15h。将反应混合物从催化剂过滤，用乙酸异丙酯(300mL)洗涤-这也被用来洗净容器。将有机相分离，用水(100mL)洗涤并在旋转蒸发器上浓缩以提供38.8g的澄清油状物。这是所需的化合物(IA)和过度还原内酯(4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2-酮)的混合物。其通过用碳酸钾水溶液萃取并用甲苯洗涤来容易地纯化。碳酸钾萃取物用甲酸酸化，得到所需产物(IA)(25.6g，58％)。
1H NMR(添加了K2CO3的D2O):δ9.5(1H),2.8(m,2H),2.40(m,2H),1.55(m,2H),1.30(m,2H),0.95(m,6H)。
实施例20
3-亚异丁基-2-氧代戊二酸单钾盐的制备。
向2L圆底瓶加入300gα-酮戊二酸和450mL冰水。在搅拌和冷却下将450mL水中的314g氢氧化钾加入，保持瓶温低于25℃。将反应器置于氮气下并在50hrs内0.2mL/min加入异丁醛。将所得的两相黄色溶液分离，并用100mL MTBE洗涤。将下层水相pH调节至3.2-3.4，并在真空65℃下浓缩至1/3体积。在冷却至<5℃后，收集所得的固体，并用若干小体积的水洗涤，干燥后得到230g含有60％的3-亚异丁基-2-氧代戊二酸单钾盐和剩余物KCl的白色固体。
1H NMR(于pH 8-10,400MHz下的D2O)δ6.4(d,1H),3.3(s,2H),2.7(m,1H),0.96(d,6H)。13C NMR(于pH 8-10,400MHz下的D2O)δ23(2CH3),31(CH),35(CH2),133(C),164(CH),170(C),176(C),182(C)。
实施例21
3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸单钾盐的制备
将如实施例20中产生的3-亚异丁基-2-氧代戊二酸单钾盐的水溶液调节到pH 6-8，加入5％Pd/C，并将该溶液在10bar H2 25℃下氢化10小时。催化剂通过过滤除去，将溶液的pH调节至pH 3.8。将混合物冷却至<5℃，过滤并用少量的冷水洗涤。所得白色结晶在40℃进行真空干燥，得到标题化合物，286g，经2个步骤58％的产率。
1H NMR(于pH 8-10,400MHz下的D2O)δ3.5(m,1H),2.5(dd,1H),2.3(dd,1H),1.6-1.5(m,2H)1.3-1.2(m,1H)0.9(d,6H)。13C NMR(于pH 8-10,400MHz下的D2O)δ21.7(CH3),22.2(CH3),25.5(CH),38.4(CH2),39.3(CH2),43.4(CH),167.8(C),170.6(C),180.7(C)。
实施例22
脱羧酶在大肠杆菌(E.coli)中的表达
使用PubMed来搜索关于具有广谱活性的脱羧酶的文献。使用KEGG(京都基因和基因组百科全书)程序来搜索具有对在结构上与3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸或3-亚异丁基-2-氧代戊二酸有几分相似性的化合物的活性的微生物脱羧酶。根据对具有一些结构相似性的化合物的活性的报道，选择七类脱羧酶进行研究。所述脱羧酶类是谷氨酸脱羧酶、二氨基庚酸脱羧酶、吲哚丙酮酸脱羧酶、支链α-酮酸脱羧酶、芳香族-L-氨基酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和苯甲酰甲酸脱羧酶。选择了经证实的或推定的脱羧酶的基因的41种序列。所述基因经密码子优化用于在大肠杆菌中表达，通过GeneArt(Germany)、DNA2.0(Menlo Park,CAUSA)或Blue Heron Biotechnology(Bothell,WA USA)合成，克隆到表达载体pSTRC52(Pfizer Inc.,USA)中，并放入表达株E.coli BDG62(Pfizer Inc.,USA)中(下表1)。从来自适当生物体的基因组DNA通过PCR扩增两种基因并克隆到同一表达载体和大肠杆菌菌株中。四种脱羧酶购自Sigma并在3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸上测试活性。
含有克隆的脱羧酶基因的各大肠杆菌菌株在具有适当抗生素的LB肉汤中过夜生长。将少量(50μL-100μL)过夜种子培养物用于接种20mm直径培养管中具有适当抗生素的4.0mL Terrific Broth培养基。将培养物在32℃和300rpm下生长在振荡培养箱中。生长5h后加入IPTG至0.4mM的最终浓度以诱导酶的表达。将培养物放回培养箱和并生长另外19h。
实施例23
用脱羧酶脱羧3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸钾盐和3-亚异丁基-2-氧代戊二酸 钾盐
使用如实施例22中制备的大肠杆菌细胞对重组脱羧酶测试3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸(XV)和3-亚异丁基-2-氧代戊二酸(XII)的脱羧。反应(1mL)在37℃下使用脱羧酶(60mg湿细胞)、50mM 3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸或3-亚异丁基-2-氧代戊二酸、ThDP(0.1mM)和MgSO4(2.5mM)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH值6.4)中进行。3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸和3-亚异丁基-2-氧代戊二酸的脱羧由UPLC测定法来测定。将反应物的等分试样(0.1mL)用0.5mL磷酸钾缓冲液(100mM，用磷酸调节至pH 2.2)和0.3mL的2,4-二硝基苯肼溶液(1M HCl:乙腈,3:1,v/v中，20mM)在50℃下处理30min。将衍生化的样品用0.5mL乙腈稀释，过滤并通过在Agilent Eclipse Plus C18(100mm x 3.0mm，1.8μm)柱上的UPLC分析，用水:乙腈(55:45,v/v)中0.1％的三氟乙酸以1.1mL/min洗脱。将该柱保持在40℃和将流出液在360nm和ES+质谱上监测。阳性结果由来自3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸的3-甲酰基-5-甲基己酸或来自3-亚异丁基-2-氧代戊二酸的3-甲酰基-5-甲基己(methylhex)-3-烯酸的峰的存在指示。分析的结果示于表1中。
表1
a–：未检测到适当的产物
b NT：未测试
c+：检测到相应的产物
实施例24
3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸的制备
在250mL圆底烧瓶中加入80g的包含表达恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)苯甲酰甲酸脱羧酶(见例23)的大肠杆菌的细胞浓缩物。向该溶液中加入3-亚异丁基-2-氧代戊二酸单钾盐(10g，参见实施例20)在50mL水中的pH 6.2调节的溶液以及0.5g硫酸镁和0.5g焦磷酸硫胺素。将所得的pH 6.2浆液加热至50℃并搅拌145hrs，用浓HCl保持pH调节在6.2和7.2之间。将反应混合物冷却至室温并离心。将倒出水溶液用50mL MTBE在最小的搅动下洗涤。将水相的pH调节到4，并通过硅藻土过滤。滤液在最小的搅拌下用50mL MTBE萃取三次。将MTBE在无水硫酸钠上干燥并浓缩成粘稠的红色油状物。此油状物用几份热己烷萃取；将合并的己烷冷却至<0°，将所得的晶体进行分离，并在空气中干燥，得到3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸为白色固体(0.6g)。
1H NMR(于pH 8-10,400MHz下的D2O)δ9.2(s,1H),6.6(d,1H),3.1(s,2H),2.7(m,1H),1(d,6H)
实施例25
烯酮还原酶同源物在大肠杆菌中的表达
番茄(Lycopersicon esculentum)(西红柿)12-氧代植二烯酸还原酶1(12-氧代植二烯酸reductase 1)(OPR1)的基因所对应的DNA序列检索自Genbank数据库(登录号ACQ9XG54)并通过GeneArt(Germany)合成。将序列进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并亚克隆到大肠杆菌表达质粒pSTRC18(Pfizer Inc.,USA)中。蛋白质序列示于下文。如所指导的将OPR1表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)并将过夜培养物在LB+链霉素培养基中温育。LB培养物用于接种表达培养物(LB，M9Y或TB)，其在37℃(210rpm)下温育。在培养物达到合适的生物量浓度(在A600下OD 1)后，加入IPTG(1mM)并将培养物再温育20h(30℃，210rpm)。细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
BLASTP程序被用于在NCBI非冗余蛋白质序列数据库中搜索与来自番茄的12-氧代植二烯酸还原酶1(OPR1)相关的基因序列。选择了相关基因的三十八种序列，进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并亚克隆到pET28b(+)大肠杆菌表达质粒(Novagen,EMDChemicals,Gibbstown,NJ,USA)中。如所指导的将OPR1相关的表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物在LB+卡那霉素培养基中生长。LB培养物用于接种生长在在过夜表达即时TB培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h。细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
番茄(西红柿)12-氧代植二烯酸还原酶1蛋白质序列：
番茄(西红柿)12-氧代植二烯酸还原酶1密码子优化序列：
ATGGAAAACAAAGTTGTGGAAGAAAAACAGGTTGATAAAATCCCGCTGATGAGCGCGTGTAAAATGGGTAAATTCGAGCTGTGTCATCGCGTTGTACTGGCACCGCTGACTCGTCAGCGTTCTTATGGTTACATTCCGCAGCCGCACGCAATCCTGCATTACTCTCAGCGCAGCACCAACGGTGGCCTGCTGATCGGTGAAGCAACCGTGATCAGCGAAACTGGCATCGGTTACAAAGATGTGCCGGGTATCTGGACGAAAGAGCAGGTTGAGGCCTGGAAACCGATCGTCGACGCGGTGCATGCCAAAGGTGGTATTTTCTTTTGTCAGATCTGGCACGTTGGTCGTGTATCCAACAAAGATTTTCAGCCGAACGGCGAAGATCCGATTTCCTGTACTGACCGCGGCCTGACCCCGCAGATCCGTTCCAACGGCATTGACATTGCCCACTTCACCCGTCCACGTCGCCTGACTACTGACGAGATTCCGCAGATCGTGAACGAGTTCCGCGTTGCAGCGCGTAATGCTATTGAAGCGGGTTTCGATGGCGTCGAGATTCATGGTGCCCACGGTTACCTGATCGACCAATTCATGAAAGACCAAGTTAACGACCGCAGCGATAAGTATGGCGGTTCTCTGGAGAACCGTTGTCGCTTCGCGCTGGAAATCGTTGAAGCAGTAGCCAACGAGATTGGCTCCGACCGTGTTGGTATCCGTATCTCTCCATTCGCACACTACAACGAAGCGGGCGACACTAACCCGACCGCACTGGGCCTGTATATGGTGGAGAGCCTGAATAAATACGACCTGGCGTATTGTCACGTGGTCGAGCCGCGCATGAAAACCGCCTGGGAAAAGATTGAGTGCACCGAAAGCCTGGTGCCGATGCGTAAAGCCTACAAAGGCACCTTCATCGTAGCTGGTGGCTACGACCGTGAAGACGGTAACCGCGCTCTGATCGAAGACCGTGCCGACCTGGTTGCGTACGGTCGTCTGTTCATCAGCAACCCAGACCTGCCGAAGCGTTTTGAACTGAACGCTCCGCTGAACAAATACAACCGTGACACTTTCTACACTTCCGACCCGATCGTTGGTTACACCGATTACCCGTTTCTGGAAACTATGACTTAATAA(SEQ ID NO.9)
实施例26
用重组还原酶还原(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸
使用如实施例25中制备的大肠杆菌细胞对重组烯酮还原酶测试(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸的还原。反应(0.5mL)在30℃下使用大肠杆菌细胞(100mg湿细胞/mL)、NADPH(10mM)、NADH(10mM)和(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸(10mM)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH值7.0)中进行。16h后，将乙腈(0.5ml)加入各反应，将所得的混合物离心(2000rpm x5min)。将所得的上清液的等分试样(0.1mL)用0.1mL磷酸钾缓冲液(100mM，用磷酸调节至pH2.2)和0.225mL的2,4-二硝基苯肼溶液(1M HCl:乙腈,3:1,v/v中，20mM)在50℃下处理30min。将衍生化的样品用0.225mL乙腈稀释，并通过在Phenomenex Lux 5μ直链淀粉-2柱(250mm x 4.6mm id)上的HPLC分析，用水:乙腈(65:35,v/v)中0.1％的三氟乙酸以2mL/min洗脱。将该柱保持在50℃并将流出液在360nm上监测。HPLC分析的结果示于表2中。
表2
实施例27
用重组还原酶和甲酸脱氢酶还原(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸
用NAD+和甲酸脱氢酶对重组烯酮还原酶评价(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸的还原。烯酮还原酶表达在如实施例25中描述的大肠杆菌细胞中。甲酸脱氢酶如下在大肠杆菌细胞中表达：按所指导的将pET26b甲酸脱氢酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB培养基+卡那霉素(Novagen,EMDChemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。氧代植二烯酸还原酶3(登录号Q9FEW9)的变体(D74M)如下在大肠杆菌细胞中表达：如所指导的使用来自Stratagene(La Jolla,CA,USA)的QuikChange定点突变试剂盒来产生氧代植二烯酸还原酶3变体D74M。引物从Integrated DNA Technologies(Coralville,IA,USA)订购。如所指导的将pSTRC18氧代植二烯酸还原酶3(OPR3)表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在扩增肉汤+链霉素(ZymoResearch,Irvine,CA,USA)中。LB培养物用于接种在过表达肉汤+链霉素(Zymo Research,Irvine,CA,USA)中生长的表达培养物。将培养物在23℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃
反应(0.5mL)在30℃下使用烯酮还原酶(40mg湿细胞/mL)、甲酸脱氢酶(80mg湿细胞/mL)、NAD+(0.02mM)、甲酸铵(30mM)和(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸(20mM)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中进行。24h后，用0.025mL的4N盐酸酸化反应混合物并用1mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取液(0.5mL)的等分试样(0.5mL)在无水硫酸钠上干燥并用甲醇(0.02mL)和(三甲基硅烷基)重氮甲烷(0.01mL的在乙醚中的2M溶液)处理以将羧酸部分衍生化至其相应的甲基酯。将衍生化的样品通过在ChiraldexTM G-TA柱(30M x 0.25mm柱，柱温度：135℃等温，注射器温度：200℃，载气：氦，流速大约1mL/min)上的GC分析，得到表3所示的结果。
表3
实施例28
用重组还原酶还原(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸
NADP+和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)醇脱氢酶(X-zyme)对重组烯酮还原酶评价(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸的还原。烯酮还原酶表达在如实施例25中描述的大肠杆菌细胞中。如实施例27中所描述的制备氧代植二烯酸还原酶3(OPR3)的变体(D74M)。反应(0.5mL)在30℃下使用烯酮还原酶(40mg湿细胞/mL)、短乳杆菌醇脱氢酶(32U/mL)NADP+(0.02mM)、2-丙醇(3vol％)和(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸(20mM)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中进行。24h后，用0.025mL的4N HCl酸化反应混合物并用1mL乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取液(0.5mL)的等分试样(0.5mL)在无水硫酸钠上干燥并用甲醇(0.02mL)和(三甲基硅烷基)重氮甲烷(0.01mL的在乙醚中的2M溶液)处理以将羧酸部分衍生化至其相应的甲基酯。将衍生化的样品通过在ChiraldexTM G-TA柱(30M x 0.25mm柱，柱温度：135℃等温，注射器温度：200℃，载气：氦，流速大约1mL/min)上的GC分析，得到表4所示的结果。
表4
实施例29
3-甲酰基-5-甲基己酸的制备
在反应容器中加入7.5mL的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)、8.4mg NADP+、0.2mL短乳杆菌醇脱氢酶(32U/mL，X-zyme)、0.3mL 2-丙醇、季戊四醇四硝酸酯还原酶(大肠杆菌细胞在磷酸钾缓冲液中的2mL的200mg/mL悬浮液)和156mg(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸，并在40℃下搅拌。6.75h后，将反应混合物离心并将上清液用4N HCl调节至pH 2，并用乙酸乙酯(2×10mL)萃取。将乙酸乙酯萃取液在无水硫酸镁上干燥，过滤并减压浓缩，得到141mg的无色油状物(89％产率)。
1H NMR(于pH 8-10下的D2O)δ2.53–2.43(m,2H),2.34–2.28(m,1H),1.53–1.42(m,1H),1.41–1.34(m,1H),1.20–1.12(m,1H),0.76(d,3H),0.74(d,3H)。
实施例30
用重组ω-转氨酶将3-甲酰基-5-甲基己酸生物转化至普瑞巴林。
用各种重组转氨酶评价3-甲酰基-5-甲基己酸用以形成普瑞巴林的氨基转移。来自河流弧菌(Vibrio fluvialis)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的重组ω-转氨酶如下表达在大肠杆菌中：按所指导的将pET28bω-转氨酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB+卡那霉素培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
反应(0.5mL)在30℃下在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)、磷酸吡哆醛(2mM)、异丙胺(150mM)、3-甲酰基-5-甲基己酸(50mM)和来自河流弧菌(Vibrio fluvialis)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)或脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的ω-转氨酶(40mg湿细胞/mL)中进行。24h后，用0.4mL乙腈：水(1：1，v/v)稀释反应样品(0.1mL)。将稀释的反应样品的等分试样(0.05mL)用饱和碳酸氢钠水溶液(0.01mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.2mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.01mL的1N盐酸水溶液终止，用0.23mL的乙腈稀释。衍生的反应样品通过UPLC(柱：BEHC18，50mm x 2.1mm id，梯度洗脱：在5min内70％A:30％B至55％A:45％B(A＝1％三乙胺(使用磷酸的pH3)；B＝乙腈)，流速：0.8mL/min，柱温度：30℃，检测：210-400nm)分析，得到表5所示的结果。
表5
实施例31
用重组ω-转氨酶将3-甲酰基-5-甲基己酸生物转化至普瑞巴林。
对河流弧菌的重组变体测试3-甲酰基-5-甲基己酸用以形成普瑞巴林的还原性胺化。河流弧菌ω-转氨酶(登录号AEA39183)的变体如下表达在大肠杆菌中：按所指导的使用来自Stratagene(La Jolla,CA,USA)的QuikChange定点突变试剂盒来产生河流弧菌ω-转氨酶变体。引物从Integrated DNA Technologies(Coralville,IA,USA)订购。按所指导的将pET28bω-转氨酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB+卡那霉素培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
反应(0.5mL)在30℃下使用磷酸吡哆醛(2mM)、异丙胺(300mM)、3-甲酰基-5-甲基己酸(100mM)和河流弧菌ω-转氨酶野生型或变体(40mg湿细胞/mL)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中进行。28h后，用0.4mL乙腈：水(1：1，v/v)稀释反应样品(0.1mL)。将稀释的反应样品的等分试样(0.05mL)用饱和碳酸氢钠水溶液(0.01mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.2mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.01mL的1N盐酸水溶液终止，用0.23mL的乙腈稀释。衍生的反应样品通过UPLC(柱：BEHC18，50mm x 2.1mm id，梯度洗脱：在5min内70％A:30％B至55％A:45％B(A＝1％三乙胺(使用磷酸的pH3)；B＝乙腈)，流速：0.8mL/min，柱温度：30℃，检测：210-400nm)分析，得到表6所示的结果。
表6
注-1：条目25至33-反应使用400mM的3-甲酰基-5-甲基己酸、3mM PLP、800mM IPM在45℃下进行。
2：Vfat 888：
DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACCAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTAACAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGTACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGGCGAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCAGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCGAGCGTATCGCTAACACCTGTACCGACCTGGGCCTGATCTGTAGCCCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGTGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.10)
氨基酸序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHQRGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELAKRLETAIEAIEEFPHGFTASGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSERIANTCTDLGLICSPMGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.2)
实施例32
(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸的酶促还原至3-甲酰基-5-甲基己酸和用ω-转 氨酶原位转化为普瑞巴林
(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸至3-甲酰基-5-甲基己酸的使用季戊四醇四硝酸酯还原酶的还原和至普瑞巴林的原位转化用各种ω-转氨酶进行评价。来自河流弧菌、球形红细菌和脱氮副球菌的重组ω-转氨酶如下表达在大肠杆菌中：按所指导的将pET28bω-转氨酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB+卡那霉素培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
反应(0.5mL)在30℃下使用季戊四醇四硝酸酯还原酶(40mg湿细胞/mL)、短乳杆菌醇脱氢酶(32U/mL)、NADP+(0.02mM)、2-丙醇(3vol％)、磷酸吡哆醛(2mM)、异丙胺(100mM)、(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸(20mM)和来自河流弧菌、红假单胞菌或脱氮副球菌的ω-转氨酶(40mg湿细胞/mL)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中进行。43h后，用0.1mL乙腈：水(1：1，v/v)稀释反应样品(0.1mL)。将稀释的反应样品的等分试样(0.1mL)用饱和碳酸氢钠水溶液(0.01mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.4mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.1mL的1N盐酸水溶液终止。衍生的反应样品通过UPLC(柱：BEH C18，50mm x2.1mm id，梯度洗脱：在5min内70％A:30％B至55％A:45％B(A＝1％三乙胺(使用磷酸的pH3)；B＝乙腈)，流速：0.8mL/min，柱温度：30℃，检测：210-400nm)分析，得到表7所示的结果。
表7
实施例33
(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸的酶促还原至3-甲酰基-5-甲基己酸和用河流弧 菌ω-转氨酶原位转化为普瑞巴林
(E)-3-甲酰基-5-甲基己-3-烯酸至3-甲酰基-5-甲基己酸的使用季戊四醇四硝酸酯还原酶的还原和至普瑞巴林的原位转化用河流弧菌转氨酶的变体进行评价。河流弧菌ω-转氨酶(登录号AEA39183)的变体如下表达在大肠杆菌中：按所指导的使用来自Stratagene(La Jolla,CA,USA)的QuikChange定点突变试剂盒来产生河流弧菌ω-转氨酶变体。引物从Integrated DNA Technologies(Coralville,IA,USA)订购。按所指导的将pET28bω-转氨酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB+卡那霉素培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
反应(0.5mL)在30℃下使用季戊四醇四硝酸酯还原酶(40mg湿细胞/mL)、短乳杆菌醇脱氢酶(32U/mL)、NADP+(0.1mM)、2-丙醇(3vol％)、磷酸吡哆醛(2mM)、异丙胺(300mM)、(E)-3-甲酰基-5-甲基己-2-烯酸(100mM)和河流弧菌ω-转氨酶野生型或变体(40mg湿细胞/mL)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)中进行。48h后，用0.18mL乙腈：水(1：1，v/v)稀释反应样品(0.02mL)。将稀释的反应样品的等分试样(0.1mL)用饱和碳酸氢钠水溶液(0.01mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.4mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.1mL的1N盐酸水溶液终止。衍生的反应样品通过UPLC(柱：BEHC18，50mm x 2.1mm id，梯度洗脱：在5min内70％A:30％B至55％A:45％B(A＝1％三乙胺(使用磷酸的pH3)；B＝乙腈)，流速：0.8mL/min，柱温度：30℃，检测：210-400nm)分析，得到表8所示的结果。
表8
实施例34
河流弧菌ω-转氨酶的替代变体
河流弧菌ω-转氨酶的下列其它重组变体如下表达在大肠杆菌中：按所指导的将pET28bω-转氨酶表达构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌(Stratagene,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)中并将过夜培养物生长在LB+卡那霉素培养基中。LB培养物用于接种在过夜表达即时TB+卡那霉素培养基(Novagen,EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA)中生长的表达培养物。将培养物在30℃下温育20h，细胞通过离心(4000×g，30min，4℃)收获并储存在-20℃。
实施例34a：Vfat906
DNA序列：
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACgAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTaacAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGTACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCggcGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCaaaCGTATCGCTAACACCTGTcagGACCTGGGCCTGATCTGTAGCgCGCTGGGTCAGTCCGTTATCCTGTGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.11)
氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.3)
实施例34b：Vfat999
DNA序列：
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACGTGGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGCTGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.12)
氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.4)
实施例34c：Vfat1010
DNA序列：
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTATGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGCACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.13)
氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGMPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPALSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.5)
实施例34d：Vfat1020
DNA序列：
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACGTGGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGGGTTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.14)
氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLGCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICAAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.6)
实施例34e：Vfat1030
DNA序列：
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCCACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGAGCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA(SEQ ID NO.15)
氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVHGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLSCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ IDNO.7)
实施例35
3-亚异丁基-2-氧代戊二酸至普瑞巴林的生物转化
将恶臭假单胞菌苯甲酰脱羧酶、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)季戊四醇四硝酸酯还原酶、短乳杆菌醇脱氢酶和河流弧菌ω-转氨酶克隆到表达载体pDSTRC52(PfizerInc.,USA)中，并放入表达株大肠杆菌BDG62(Pfizer Inc.,USA)中。生长培养物并如实施例22中所描述的诱导酶产生。酶表达由聚丙烯酰胺凝胶电泳使用Novex凝胶和染色剂(Invitrogen Corporation Carlsbad,California)测定。
反应(1.0mL)在40℃下使用恶臭假单胞菌脱羧酶、河流弧菌转氨酶、短乳杆菌醇脱氢酶、阴沟肠杆菌季戊四醇四硝酸酯还原酶和NADP(0.1mM)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.4)中于一室中进行。200μL 1M 3-亚异丁基-2-氧代戊二酸，100μL 1mM ThDp+25mMMgSO4，40μL 50mM的PLP，30μL异丙醇，250μL 2M异丙胺。调节pH至6.4进行24h，然后将pH调整至6.8进行另外的24h。将反应物的等分试样(0.5ml)用1M碳酸氢钠水溶液(0.05mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.5mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.05mL的1N盐酸水溶液终止。衍生的反应样品通过UPLC(柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100mm x3.0mm,1.8μm)过滤和分析，用水：乙腈(60:40，v/v)中的0.1％三氟乙酸在1.3mL/min下洗脱。将柱保持在30℃和并将流出液在340nm和ES+质谱上监测。该反应产生了少量的普瑞巴林，其中82％为所需的S-异构体。
实施例36
3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸至普瑞巴林的生物转化
将恶臭假单胞菌苯甲酰脱羧酶和河流弧菌ω-转氨酶克隆到表达载体pDSTRC52(Pfizer Inc.,USA)中，并放入表达株大肠杆菌BDG62(Pfizer Inc.,USA)中。生长培养物并如实施例22中所描述的诱导酶产生。酶表达由聚丙烯酰胺凝胶电泳使用Novex凝胶和染色剂(Invitrogen Corporation Carlsbad,California)测定。
反应(2.0mL)在40℃下使用来自24小时发酵罐的500μL培养物(42.5mg干细胞重)(恶臭假单胞菌脱羧酶和河流弧菌ω-转氨酶克隆到一个质粒中)、400μL 0.5M 3-(2-甲基丙基)-2-氧代戊二酸、200uL10×ThDP(最终为0.1mM)和MgSO4(最终为2.5mM)、80μL 50mMPLP(最终为2mM)、300μL 2M异丙胺(最终为0.3M)在磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.4)中进行。调节pH至6.4，并在45℃下温育24小时，然后将pH调整至6.8进行另外的24h。将反应物的等分试样(0.5ml)用1M碳酸氢钠水溶液(0.05mL)和Marfey试剂(N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)丙氨酰胺，乙腈中0.5mL的5g/L溶液)在40℃下处理。1h后，将衍生化反应用0.05mL的1N盐酸水溶液终止。衍生的反应样品通过UPLC(柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100mm x3.0mm,1.8μm)过滤和分析，用水：乙腈(60:40，v/v)中的0.1％三氟乙酸在1.3mL/min下洗脱。将柱保持在30℃和并将流出液在340nm和ES+质谱上监测。该反应产生了100μg/mL的普瑞巴林，其中65％为所需的S-异构体。
实施例37
经由5-甲氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮的水解和酶促氨基转移制备 (S)-普瑞巴林
将5-甲氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮(2.58g，15mmol，见实施例13)悬浮于DIW(5.2g)中并在冰/水浴中冷却。通过注射器在5min内滴加aq KOH(50％w/w，1.77g，1.05eq)。将反应物从冰/水浴移出，并在室温下搅拌90min。使用甲酸将pH调节至7.0。然后将反应混合物用作在随后转氨酶反应中的原料。
将转氨酶溶液(12.5g)、PLP(35mg)、DIW(15mL)和4.0M异丙胺.HCl aq soln(7.5mL，30mmol)加入到100ml烧瓶中并加热到45℃。一次性加入水解反应物接着加入DIW(6mL，用作容器冲洗)。将反应物的pH用纯异丙胺调节至7.25，并将反应物在45℃下搅拌直至反应完全。随后将反应混合物加热到55℃的内部温度并将pH用95％的甲酸调节到4.0。加入Darco碳(125mg)，并将该混合物冷却到室温随后在冰/水上冷却20分钟。然后将混合物通过Whatman纸no.3过滤。将滤液浓缩至其重量的三分之一，然后加热至55℃。随后将溶液的pH用50％KOH调节至pH 7.5，之后将溶液冷却至室温然后在冰/水浴中冷却至0-5℃。在冷却中观察到产物的沉淀。将浆液过滤，用DIW/EtOH(10mL，1：1，0℃)洗涤。将白色沉淀物在真空烘箱(45℃)中干燥12h，得到(S)-普瑞巴林，61％产率，98.6％w/w纯度和99.8％ee(优选的S-异构体)。
实施例38
经由5-丁氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮的水解和酶促氨基转移制备 (S)-普瑞巴林。
将5-丁氧基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮(3.21g，15mmol，见实施例13C)悬浮于DIW(8.5g)中并在冰/水浴中冷却。通过注射器在5min内滴加aq KOH(50％w/w，2.02g,1.2eq)。将反应物从冰/水浴移出，并在室温下搅拌90min。随后使用甲酸将pH调节至7.0，然后将反应混合物用作在随后转氨酶反应中的原料。
将转氨酶溶液(12.5g)、PLP(35mg)、DIW(15mL)和4.0M异丙胺.HCl溶液(7.5mL，30mmol)加入到100ml烧瓶中并加热到45℃。一次性加入水解反应物(见上文)接着加入DIW(6mL，用作容器冲洗)。将反应物的pH用纯异丙胺调节至7.25，并将反应物在45℃下搅拌。
将反应混合物加热到55℃的内部温度并将pH用95％的甲酸调节到4.0。加入Darco碳(125mg)，并将该混合物冷却到室温随后在冰/水上冷却20分钟。然后将混合物通过Whatman纸no.3过滤。将滤液浓缩至其重量的三分之一，然后加热至55℃。随后将溶液的pH用50％KOH调节至pH 7.5，之后将溶液冷却至室温然后在冰/水浴中冷却至0-5℃。在冷却中观察到产物的沉淀。将浆液过滤，用DIW/EtOH(10mL，1：1，0℃)洗涤。将白色沉淀物在真空烘箱(45℃)中干燥12小时，得到(S)-普瑞巴林，51％产率，98.4％w/w纯度和99.9％ee优选的S-异构体。
实施例39
经由酶促氨基转移由5-羟基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮制备(S)-普瑞 巴林
将5-羟基-4-(2-甲基丙基)-二氢呋喃-2(3H)-酮(2.0g,12.5mmol)悬浮于DIW(8.5g)中并在冰/水浴中冷却。在5min的过程内分批加入(0.863g,6.3mmol)。将反应物从冰/水浴移出，并在室温下搅拌90min。使用甲酸将pH调节至7.0，然后将反应混合物用作在随后转氨酶反应中的原料。
将转氨酶溶液(10.4g)、PLP(30mg)、DIW(12.5mL)和aq 4.0M异丙胺.HCl aq soln(6.3mL，30mmol)加入到100ml烧瓶中并加热到45℃。一次性加入水解反应物接着加入DIW(5mL，用作容器冲洗)。将反应物的pH用纯异丙胺调节至7.25，并将反应物在45℃下搅拌。随后将反应混合物加热到55℃的内部温度并将pH用95％的甲酸调节到4.0。加入Darco碳(125mg)，并将该混合物冷却到室温随后在冰/水上冷却20分钟。然后将混合物通过Whatman纸no.3过滤。将滤液浓缩至其重量的三分之一，然后加热至55℃。随后将溶液的pH用50％KOH调节至pH 7.5，之后将溶液冷却至室温然后在冰/水浴中冷却至0-5℃。在冷却中观察到产物的沉淀。将浆液过滤，用DIW/EtOH(10mL，1：1，0℃)洗涤。将白色沉淀物在真空烘箱(45℃)中干燥12小时，得到(S)-普瑞巴林，61％产率，98.3％w/w纯度和99.9％ee的优选S-异构体。
实施例40
经由5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮的还原性胺化制备(R/S)- 3-氨甲基-5-甲基己酸
将30％氨水溶液中5-羟基-4-(2-甲基丙-1-烯-1-基)呋喃-2(5H)-酮的0.01M溶液在10mol％拉尼镍催化剂的存在下氢化(10bar，环境温度)48h。过滤催化剂，并浓缩溶液以留下固体。通过加入盐酸至甲醇悬浮液分离产物，发现为纯的3-氨甲基-5-甲基己酸氢氯化物。
使用钯作为催化剂产生3-氨甲基-5-甲基己酸和相应的仲胺3-[(2-羧甲基-4-甲基-戊基氨基)-甲基]-5-甲基-己酸的混合物。
实施例41
使用转氨酶将R-3-氨甲基-5-甲基己酸转化为5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二 氢-5H-2-呋喃酮
将pH7.5/45℃的R-3-氨甲基-5-甲基己酸在D.I.水中的溶液与含有磷酸吡哆醛(PLP)和丙酮的全细胞制备物或转氨酶裂解物一起搅拌。产生的异丙胺经由氮气吹扫除去。24h后溶液的分析显示具有较低e.e.的3-氨甲基-5-甲基-己酸和化合物5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮的存在。5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮的手性纯度的降低是由于(4S)-5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮至S-普瑞巴林的选择性转化。
实施例42
使用转氨酶去外消旋rac-普瑞巴林
将pH7.5的外消旋普瑞巴林在DIW中的溶液用适当的转氨酶裂解物处理。加入PLP，并将该反应在45℃、氮气吹扫下进行12h。然后，加入异丙胺，并将该反应继续进行另外的12h。按实施例38分离产物，得到对映体富集的普瑞巴林。
还可能的是使用合适的胺氧化酶/亚胺还原酶系统以辅助因子例如NADP来实现实施例41和42中示例的转化。
序列表
SEQ ID NO.1
一般性Vfat aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHX27RGTVVVTHGEGPYX41VDVX帖GRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRX147NAYHGVTAVSASMTGX163PX165NSVFGLPLPGFVHLX180CPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELX304KRLETAIEAIEEFPHGFTAX324GHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSX401RIANTCX408DLGLICX415X416X417GQSVILX424PPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
X27选自谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)；X41选自异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)；X45选自天冬酰胺(N)和组氨酸(H)；X147选自天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；X163选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；X165选自酪氨酸(Y)和组氨酸(H)；X180选自苏氨酸(T)；甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；X304选自丙氨酸(A)和丝氨酸(S)；X324选自甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；X401选自赖氨酸(K)和谷氨酸(E)；X408选自苏氨酸(T)和谷氨酰胺(Q)；X415选自丝氨酸(S)和丙氨酸(A)；X416选自脯氨酸(P)和丙氨酸(A)；X417选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；以及X424选自半胱氨酸(C)和丝氨酸(S)。
SEQ ID NO.2
Vfat888 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHQRGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELAKRLETAIEAIEEFPHGFTASGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSERIANTCTDLGLICSPMGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.3
Vfat906 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.4
Vfat999 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.5
Vfat1010 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGMPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPALSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.6
Vfat1020 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLGCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICAAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.7
Vfat1030 aa序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVHGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLSCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA
SEQ ID NO.8
番茄(西红柿)12-氧代植二烯酸还原酶1蛋白质序列:
MENKVVEEKQVDKIPLMSPCKMGKFELCHRVVLAPLTRQRSYGYIPQPHAILHYSQRSTNGGLLIGEATVISETGIGYKDVPGIWTKEQVEAWKPIVDAVHAKGGIFFCQIWHVGRVSNKDFQPNGEDPISCTDRGLTPQIRSNGIDIAHFTRPRRLTTDEIPQIVNEFRVAARNAIEAGFDGVEIHGAHGYLIDQFMKDQVNDRSDKYGGSLENRCRFALEIVEAVANEIGSDRVGIRISPFAHYNEAGDTNPTALGLYMVESLNKYDLAYCHVVEPRMKTAWEKIECTESLVPMRKAYKGTFIVAGGYDREDGNRALIEDRADLVAYGRLFISNPDLPKRFELNAPLNKYNRDTFYTSDPIVGYTDYPFLETMT
SEQ ID NO.9
番茄(西红柿)12-氧代植二烯酸还原酶1密码子优化序列:
ATGGAAAACAAAGTTGTGGAAGAAAAACAGGTTGATAAAATCCCGCTGATGAGCCCGTGTAAAATGGGTAAATTCGAGCTGTGTCATCGCGTTGTACTGGCACCGCTGACTCGTCAGCGTTCTTATGGTTACATTCCGCAGCCGCACGCAATCCTGCATTACTCTCAGCGCAGCACCAACGGTGGCCTGCTGATCGGTGAAGCAACCGTGATCAGCGAAACTGGCATCGGTTACAAAGATGTGCCGGGTATCTGGACGAAAGAGCAGGTTGAGGCCTGGAAACCGATCGTCGACGCGGTGCATGCCAAAGGTGGTATTTTCTTTTGTCAGATCTGGCACGTTGGTCGTGTATCCAACAAAGATTTTCAGCCGAACGGCGAAGATCCGATTTCCTGTACTGACCGCGGCCTGACCCCGCAGATCCGTTCCAACGGCATTGACATTGCCCACTTCACCCGTCCACGTCGCCTGACTACTGACGAGATTCCGCAGATCGTGAACGAGTTCCGCGTTGCAGCGCGTAATGCTATTGAAGCGGGTTTCGATGGCGTCGAGATTCATGGTGCCCACGGTTACCTGATCGACCAATTCATGAAAGACCAAGTTAACGACCGCAGCGATAAGTATGGCGGTTCTCTGGAGAACCGTTGTCGCTTCGCGCTGGAAATCGTTGAAGCAGTAGCCAACGAGATTGGCTCCGACCGTGTTGGTATCCGTATCTCTCCATTCGCACACTACAACGAAGCGGGCGACACTAACCCGACCGCACTGGGCCTGTATATGGTGGAGAGCCTGAATAAATACGACCTGGCGTATTGTCACGTGGTCGAGCCGCGCATGAAAACCGCCTGGGAAAAGATTGAGTGCACCGAAAGCCTGGTGCCGATGCGTAAAGCCTACAAAGGCACCTTCATCGTAGCTGGTGGCTACGACCGTGAAGACGGTAACCGCGCTCTGATCGAAGACCGTGCCGACCTGGTTGCGTACGGTCGTCTGTTCATCAGCAACCCAGACCTGCCGAAGCGTTTTGAACTGAACGCTCCGCTGAACAAATACAACCGTGACACTTTCTACACTTCCGACCCGATCGTTGGTTACACCGATTACCCGTTTCTGGAAACTATGACTTAATAA
SEQ ID NO.10
Vfat 888 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACCAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTAACAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGTACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGGCGAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCAGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCGAGCGTATCGCTAACACCTGTACCGACCTGGGCCTGATCTGTAGCCCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGTGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA
SEQ ID NO.11
Vfat 906 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACgAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTaacAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGTACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCggcGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCaaaCGTATCGCTAACACCTGTcagGACCTGGGCCTGATCTGTAGCgCGCTGGGTCAGTCCGTTATCCTGTGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA
SEQ ID NO.12
Vfat 999 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACGTGGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGCTGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA
SEQ ID NO.13
Vfat 1010 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTATGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGACCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGCACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA
SEQ ID NO.14
Vfat 1020 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACGTGGTGGACGTCAACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGGGTTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA
SEQ ID NO.15
Vfat 1030 DNA序列
ATGAATAAACCACAAAGCTGGGAAGCGCGTGCTGAAACTTACTCTCTGTACGGCTTCACTGATATGCCATCTCTGCACGAGCGTGGTACCGTGGTTGTCACCCACGGCGAGGGCCCATACATCGTGGACGTCCACGGTCGCCGTTACCTGGACGCAAACTCCGGCCTGTACAATATGGTTGCCGGCTTCGACCACAAGGGTCTGATCGACGCAGCAAAGGCCCAGTACGAACGCTTCCCGGGTTACCATAGCTTCTTCGGTCGTATGTCTGATCAAACTGTTATGCTGAGCGAGAAACTGGTAGAGGTGTCTCCATTCGACAGCGGTCGCGTGTTCTATACTAACTCCGGCTCCGAGGCTAACGATACTATGGTGAAAATGCTGTGGTTTCTGCACGCCGCAGAGGGCAAGCCGCAAAAACGCAAAATCCTGACTCGTCAAAACGCATACCACGGTGTAACTGCTGTTTCCGCTTCCATGACGGGTCTGCCGCACAACTCTGTATTCGGCCTGCCGCTGCCGGGTTTCGTTCACCTGAGCTGTCCGCACTATTGGCGTTACGGCGAAGAAGGTGAAACCGAAGAGCAGTTTGTTGCTCGTCTGGCCCGCGAGCTGGAGGAAACTATCCAACGTGAAGGCGCGGACACGATTGCGGGCTTCTTTGCTGAGCCGGTCATGGGCGCGGGCGGCGTAATCCCGCCGGCGAAAGGTTACTTCCAGGCGATCCTGCCGATTCTGCGTAAGTACGACATCCCGGTTATCTCTGATGAAGTTATCTGCGGCTTTGGTCGTACCGGTAATACTTGGGGTTGCGTTACCTATGACTTCACCCCGGATGCGATCATCTCCAGCAAAAATCTGACCGCCGGTTTCTTTCCGGTTGGTGCTGTGATTCTGGGTCCGGAACTGAGCAAACGCCTGGAAACGGCGATCGAAGCTATCGAAGAGTTCCCGCACGGCTTTACGGCCGGCGGTCACCCGGTGGGTTGCGCTATCGCTCTGAAAGCAATCGATGTTGTGATGAATGAGGGTCTGGCAGAGAACGTGCGCCGCCTGGCACCGCGTTTTGAGGAGCGTCTGAAACACATTGCCGAACGTCCGAACATCGGTGAATATCGTGGCATCGGTTTTATGTGGGCACTGGAGGCTGTGAAAGACAAAGCATCTAAAACCCCATTCGATGGTAATCTGTCTGTGAGCAAACGTATCGCTAACACCTGTCAGGACCTGGGCCTGATCTGTAGCGCGATGGGTCAGTCCGTTATCCTGAGCCCGCCGTTCATCCTGACCGAGGCGCAAATGGATGAGATGTTTGACAAACTGGAGAAGGCTCTGGACAAAGTCTTTGCGGAGGTGGCGTAA。
[0001] 序列表
[0002] <110>辉瑞爱尔兰制药公司
[0003] P·M·奥尼尔
[0004] S·德巴尔热
[0005] D·T·厄德曼
[0006] R·库玛
[0007] M·J·卡尔米洛维兹
[0008] <120>用于制备普瑞巴林的方法和中间体
[0009] <130>PC71999A
[0010] <150>US 61/805786
[0011] <151>2013-03-27
[0012] <160>15
[0013] <170>PatentIn version 3.5
[0014] <210>1
[0015] <211>453
[0016] <212>PRT
[0017] <213>人工序列
[0018] <220>
[0019] <223>河流弧菌酶的修饰
[0020] <220>
[0021] <221>杂项特征
[0022] <222>(27)..(27)
[0023] <223>Xaa(27)选自谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)
[0024] <220>
[0025] <221>杂项特征
[0026] <222>(41)..(41)
[0027] <223>Xaa(41)选自异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)
[0028] <220>
[0029] <221>杂项特征
[0030] <222>(45)..(45)
[0031] <223>Xaa(45)选自精氨酸(Asn)和组氨酸(His)
[0032] <220>
[0033] <221>杂项特征
[0034] <222>(147)..(147)
[0035] <223>Xaa(147)选自精氨酸(Asn)和谷氨酰胺(Gln)
[0036] <220>
[0037] <221>杂项特征
[0038] <222>(163)..(163)
[0039] <223>Xaa(163)选自亮氨酸(Leu)和甲硫氨酸(Met)
[0040] <220>
[0041] <221>杂项特征
[0042] <222>(165)..(165)
[0043] <223>Xaa(165)选自酪氨酸(Tyr)和组氨酸(His)
[0044] <220>
[0045] <221>杂项特征
[0046] <222>(180)..(180)
[0047] <223>Xaa(180)选自苏氨酸(Thr)；甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)
[0048] <220>
[0049] <221>杂项特征
[0050] <222>(304)..(304)
[0051] <223>Xaa(304)选自丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)
[0052] <220>
[0053] <221>杂项特征
[0054] <222>(324)..(324)
[0055] <223>Xaa(324)选自甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)
[0056] <220>
[0057] <221>杂项特征
[0058] <222>(401)..(401)
[0059] <223>Xaa(401)选自赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)
[0060] <220>
[0061] <221>杂项特征
[0062] <222>(408)..(408)
[0063] <223>Xaa(408)选自苏氨酸(Thr)和谷氨酰胺(Gln)
[0064] <220>
[0065] <221>杂项特征
[0066] <222>(415)..(415)
[0067] <223>Xaa(415)选自丝氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)
[0068] <220>
[0069] <221>杂项特征
[0070] <222>(416)..(416)
[0071] <223>Xaa(416)选自proline(Pro)和丙氨酸(Ala)
[0072] <220>
[0073] <221>杂项特征
[0074] <222>(417)..(417)
[0075] <223>Xaa(417)选自亮氨酸(Leu)和甲硫氨酸(Met)
[0076] <220>
[0077] <221>杂项特征
[0078] <222>(424)..(424)
[0079] <223>Xaa(424)选自半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)
[0080] <400>1
[0081] Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
[0082] 1 5 10 15
[0083] Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Xaa Arg Gly Thr Val Val
[0084] 20 25 30
[0085] Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Xaa Val Asp Val Xaa Gly Arg Arg
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[0087] Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Tyr Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
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[0091] Gly Tyr His Ser Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
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[0099] Thr Arg Xaa Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
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[0101] Thr Gly Xaa Pro Xaa Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
[0102] 165 170 175
[0103] Val His Leu Xaa Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu
[0104] 180 185 190
[0105] Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr
[0106] 195 200 205
[0107] Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro
[0108] 210 215 220
[0109] Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
[0110] 225 230 235 240
[0111] Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
[0112] 245 250 255
[0113] Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
[0114] 260 265 270
[0115] Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr
[0116] 275 280 285
[0117] Ala Gly Phe Phe Pro Val Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Xaa
[0118] 290 295 300
[0119] Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly
[0120] 305 310 315 320
[0121] Phe Thr Ala Xaa Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala
[0122] 325 330 335
[0123] Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
[0124] 340 345 350
[0125] Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
[0126] 355 360 365
[0127] Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
[0128] 370 375 380
[0129] Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
[0130] 385 390 395 400
[0131] Xaa Arg Ile Ala Asn Thr Cys Xaa Asp Leu Gly Leu Ile Cys Xaa Xaa
[0132] 405 410 415
[0133] Xaa Gly Gln Ser Val Ile Leu Xaa Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala
[0134] 420 425 430
[0135] Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
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[0137] Phe Ala Glu Val Ala
[0138] 450
[0139] <210>2
[0140] <211>453
[0141] <212>PRT
[0142] <213>人工序列
[0143] <220>
[0144] <223>河流弧菌酶的修饰
[0145] <400>2
[0146] Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
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[0148] Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val
[0149] 20 25 30
[0150] Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
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[0152] Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Tyr Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
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[0154] His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
[0155] 65 70 75 80
[0156] Gly Tyr His Ser Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
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[0166] Thr Gly Leu Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe
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[0174] Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln
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[0176] Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp
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[0178] Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val
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[0182] Ala Gly Phe Phe Pro Val Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ala
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[0188] Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu
[0189] 340 345 350
[0190] Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn
[0191] 355 360 365
[0192] Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val
[0193] 370 375 380
[0194] Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser
[0195] 385 390 395 400
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[0200] Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val
[0201] 435 440 445
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[0203] 450
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[0205] <211>453
[0206] <212>PRT
[0207] <213>人工序列
[0208] <220>
[0209] <223>河流弧菌酶的修饰
[0210] <400>3
[0211] Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu
[0212] 1 5 10 15
[0213] Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Glu Arg Gly Thr Val Val
[0214] 20 25 30
[0215] Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg
[0216] 35 40 45
[0217] Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Tyr Asn Met Val Ala Gly Phe Asp
[0218] 50 55 60
[0219] His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro
[0220] 65 70 75 80
[0221] Gly Tyr His Ser Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu
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[0223] Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe
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[0227] Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu
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[0229] Thr Arg Asn Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met
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[0615] atcgtggacg tcaacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0616] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0617] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0618] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0619] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0620] cgcaaaatcc tgactcgtaa caacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0621] acgggtctgc cgtacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgacc540
[0622] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0623] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0624] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0625] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0626] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0627] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0628] ccggaactgg cgaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0629] tttacggcca gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0630] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0631] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0632] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0633] gagcgtatcg ctaacacctg taccgacctg ggcctgatct gtagcccgat gggtcagtcc1260
[0634] gttatcctgt gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0635] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362
[0636] <210>11
[0637] <211>1362
[0638] <212>DNA
[0639] <213>人工序列
[0640] <220>
[0641] <223>河流弧菌酶的修饰
[0642] <400>11
[0643] atgaataaac cacaaagctg ggaagcgcgt gctgaaactt actctctgta cggcttcact60
[0644] gatatgccat ctctgcacga gcgtggtacc gtggttgtca cccacggcga gggcccatac120
[0645] atcgtggacg tcaacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0646] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0647] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0648] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0649] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0650] cgcaaaatcc tgactcgtaa caacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0651] acgggtctgc cgtacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgacc540
[0652] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0653] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0654] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0655] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0656] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0657] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0658] ccggaactga gcaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0659] tttacggccg gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0660] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0661] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0662] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0663] aaacgtatcg ctaacacctg tcaggacctg ggcctgatct gtagcgcgct gggtcagtcc1260
[0664] gttatcctgt gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0665] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362
[0666] <210>12
[0667] <211>1362
[0668] <212>DNA
[0669] <213>人工序列
[0670] <220>
[0671] <223>河流弧菌酶的修饰
[0672] <400>12
[0673] atgaataaac cacaaagctg ggaagcgcgt gctgaaactt actctctgta cggcttcact60
[0674] gatatgccat ctctgcacga gcgtggtacc gtggttgtca cccacggcga gggcccatac120
[0675] gtggtggacg tcaacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0676] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0677] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0678] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0679] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0680] cgcaaaatcc tgactcgtca aaacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0681] acgggtctgc cgcacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgacc540
[0682] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0683] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0684] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0685] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0686] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0687] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0688] ccggaactga gcaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0689] tttacggccg gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0690] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0691] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0692] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0693] aaacgtatcg ctaacacctg tcaggacctg ggcctgatct gtagcgcgct gggtcagtcc1260
[0694] gttatcctga gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0695] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362
[0696] <210>13
[0697] <211>1362
[0698] <212>DNA
[0699] <213>人工序列
[0700] <220>
[0701] <223>河流弧菌酶的修饰
[0702] <400>13
[0703] atgaataaac cacaaagctg ggaagcgcgt gctgaaactt actctctgta cggcttcact60
[0704] gatatgccat ctctgcacga gcgtggtacc gtggttgtca cccacggcga gggcccatac120
[0705] atcgtggacg tcaacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0706] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0707] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0708] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0709] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0710] cgcaaaatcc tgactcgtca aaacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0711] acgggtatgc cgcacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgacc540
[0712] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0713] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0714] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0715] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0716] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0717] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0718] ccggcactga gcaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0719] tttacggccg gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0720] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0721] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0722] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0723] aaacgtatcg ctaacacctg tcaggacctg ggcctgatct gtagcgcgat gggtcagtcc1260
[0724] gttatcctga gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0725] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362
[0726] <210>14
[0727] <211>1362
[0728] <212>DNA
[0729] <213>人工序列
[0730] <220>
[0731] <223>河流弧菌酶的修饰
[0732] <400>14
[0733] atgaataaac cacaaagctg ggaagcgcgt gctgaaactt actctctgta cggcttcact60
[0734] gatatgccat ctctgcacga gcgtggtacc gtggttgtca cccacggcga gggcccatac120
[0735] gtggtggacg tcaacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0736] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0737] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0738] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0739] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0740] cgcaaaatcc tgactcgtca aaacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0741] acgggtctgc cgcacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgggt540
[0742] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0743] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0744] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0745] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0746] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0747] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0748] ccggaactga gcaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0749] tttacggccg gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0750] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0751] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0752] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0753] aaacgtatcg ctaacacctg tcaggacctg ggcctgatct gtagcgcgat gggtcagtcc1260
[0754] gttatcctga gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0755] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362
[0756] <210>15
[0757] <211>1362
[0758] <212>DNA
[0759] <213>人工序列
[0760] <220>
[0761] <223>河流弧菌酶的修饰
[0762] <400>15
[0763] atgaataaac cacaaagctg ggaagcgcgt gctgaaactt actctctgta cggcttcact60
[0764] gatatgccat ctctgcacga gcgtggtacc gtggttgtca cccacggcga gggcccatac120
[0765] atcgtggacg tccacggtcg ccgttacctg gacgcaaact ccggcctgta caatatggtt180
[0766] gccggcttcg accacaaggg tctgatcgac gcagcaaagg cccagtacga acgcttcccg240
[0767] ggttaccata gcttcttcgg tcgtatgtct gatcaaactg ttatgctgag cgagaaactg300
[0768] gtagaggtgt ctccattcga cagcggtcgc gtgttctata ctaactccgg ctccgaggct360
[0769] aacgatacta tggtgaaaat gctgtggttt ctgcacgccg cagagggcaa gccgcaaaaa420
[0770] cgcaaaatcc tgactcgtca aaacgcatac cacggtgtaa ctgctgtttc cgcttccatg480
[0771] acgggtctgc cgcacaactc tgtattcggc ctgccgctgc cgggtttcgt tcacctgagc540
[0772] tgtccgcact attggcgtta cggcgaagaa ggtgaaaccg aagagcagtt tgttgctcgt600
[0773] ctggcccgcg agctggagga aactatccaa cgtgaaggcg cggacacgat tgcgggcttc660
[0774] tttgctgagc cggtcatggg cgcgggcggc gtaatcccgc cggcgaaagg ttacttccag720
[0775] gcgatcctgc cgattctgcg taagtacgac atcccggtta tctctgatga agttatctgc780
[0776] ggctttggtc gtaccggtaa tacttggggt tgcgttacct atgacttcac cccggatgcg840
[0777] atcatctcca gcaaaaatct gaccgccggt ttctttccgg ttggtgctgt gattctgggt900
[0778] ccggaactga gcaaacgcct ggaaacggcg atcgaagcta tcgaagagtt cccgcacggc960
[0779] tttacggccg gcggtcaccc ggtgggttgc gctatcgctc tgaaagcaat cgatgttgtg1020
[0780] atgaatgagg gtctggcaga gaacgtgcgc cgcctggcac cgcgttttga ggagcgtctg1080
[0781] aaacacattg ccgaacgtcc gaacatcggt gaatatcgtg gcatcggttt tatgtgggca1140
[0782] ctggaggctg tgaaagacaa agcatctaaa accccattcg atggtaatct gtctgtgagc1200
[0783] aaacgtatcg ctaacacctg tcaggacctg ggcctgatct gtagcgcgat gggtcagtcc1260
[0784] gttatcctga gcccgccgtt catcctgacc gaggcgcaaa tggatgagat gtttgacaaa1320
[0785] ctggagaagg ctctggacaa agtctttgcg gaggtggcgt aa 1362

Claims (4)

1.转氨酶，其具有选自下列的氨基酸序列
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHX27RGTVVVTHGEGPYX41VDVX45GRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRX147NAYHGVTAVSASMTGX163PX165NSVFGLPLPGFVHLX180CPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELX304KRLETAIEAIEEFPHGFTAX324GHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHlAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSX401RIANTCX408DLGLICX415X416X417GQSVILX424PPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQ ID NO.1)
其中
X27选自谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)；
X41选自异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)；
X45选自天冬酰胺(N)和组氨酸(H)；
X147选自天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
X163选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；
X165选自酪氨酸(Y)和组氨酸(H)；
X180选自苏氨酸(T)；甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；
X304选自丙氨酸(A)和丝氨酸(S)；
X324选自甘氨酸(G)和丝氨酸(S)；
X401选自赖氨酸(K)和谷氨酸(E)；
X408选自苏氨酸(T)和谷氨酰胺(Q)；
X415选自丝氨酸(S)和丙氨酸(A)；
X416选自脯氨酸(P)和丙氨酸(A)；
X417选自亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)；和
X424选自半胱氨酸(C)和丝氨酸(S)。
2.根据权利要求1的转氨酶，其中
X27是谷氨酸(E)；
X147是谷氨酰胺(Q)；
X165是组氨酸(H)；
X304是丝氨酸(S)；
X324是甘氨酸(G)；
X401是赖氨酸(K)；
X408是谷氨酰胺(Q)；
X416是丙氨酸(A)；
X417是甲硫氨酸(M)；和
X424是丝氨酸(S)。
3.根据权利要求1的转氨酶，其具有选自下列的氨基酸序列：
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHQRGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELAKRLETAIEAIEEFPHGFTASGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSERIANTCTDLGLICSPMGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.2)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRNNAYHGVTAVSASMTGLPYNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILCPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.3)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSALGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.4)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGMPHNSVFGLPLPGFVHLTCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPALSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.5)；
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYVVDVNGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLGCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICAAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.6)；和
MNKPQSWEARAETYSLYGFTDMPSLHERGTVVVTHGEGPYIVDVHGRRYLDANSGLYNMVAGFDHKGLIDAAKAQYERFPGYHSFFGRMSDQTVMLSEKLVEVSPFDSGRVFYTNSGSEANDTMVKMLWFLHAAEGKPQKRKILTRQNAYHGVTAVSASMTGLPHNSVFGLPLPGFVHLSCPHYWRYGEEGETEEQFVARLARELEETIQREGADTIAGFFAEPVMGAGGVIPPAKGYFQAILPILRKYDIPVISDEVICGFGRTGNTWGCVTYDFTPDAIISSKNLTAGFFPVGAVILGPELSKRLETAIEAIEEFPHGFTAGGHPVGCAIALKAIDVVMNEGLAENVRRLAPRFEERLKHIAERPNIGEYRGIGFMWALEAVKDKASKTPFDGNLSVSKRIANTCQDLGLICSAMGQSVILSPPFILTEAQMDEMFDKLEKALDKVFAEVA(SEQID NO.7)。
4.用于制备(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸((S)-II)
或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括用根据权利要求1至3中任一项的转氨酶处理5-羟基-4-(2-甲基丙基)-3,4-二氢-5H-2-呋喃酮(IA)和胺的步骤。
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