CN108315365B - 阿托伐他汀中间体的生物合成方法 - Google Patents

阿托伐他汀中间体的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿托伐他汀中间体的生物合成方法，包括以下步骤：化合物(4R,6R)‑6‑(1‑氨基‑1‑羧基乙基)‑2,2‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑4‑乙酸叔丁酯在氨基酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成化合物(4R,6R)‑6‑(氨乙基)‑2,2‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑4‑乙酸叔丁酯，即为阿托伐他汀中间体。本发明反应条件温和，对设备无特殊要求，化学合成法和酶法结合，对环境无污染，反应条件易控制，操作简便，工艺流程简单。

Description

阿托伐他汀中间体的生物合成方法
技术领域
本发明涉及原料药及药物中间体的制备方法，具体地指一种阿托伐他汀中间体的生物合成方法。
背景技术
阿托伐他汀是HMG-CoA还原酶的选择性、竞争性抑制剂，通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶和胆固醇的合成从而降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，并通过增加细胞表面的肝脏LDL受体以增强LDL的摄取和代谢。同时，阿托伐他汀还可以降低低密度脂蛋白和甘油三酯、升高高密度脂蛋白，从而对动脉粥样硬化和冠心病的防治有重要意义。虽然目前国内调血脂药市场仍以辛伐他汀为主，然而，阿托伐他汀因其适应症更广、耐受性和安全性更好已经引起国内各制药企业的广泛关注。因此，开展阿伐他汀及其中间体合成工艺的探索和改进具有重要意义。
阿伐他汀的重要中间体(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，化学结构为：
Figure BDA0001573693290000011
申请号为200910061164.4的中国发明专利报道了一种以环氧氯丙烷为原料，经过Salen催化剂手性拆分，开环、醇解酯化，再经过腈代得到(R)-(-)-4-腈基-3-羟基丁酸乙酯的工艺，合成路线如下：
Figure BDA0001573693290000021
申请号为20090216029A1的美国发明专利报道了以(R)-(-)-4-腈基-3-羟基丁酸乙酯为原料与醋酸叔丁酯缩合，用硼烷保持构型后用硼氢化钠还原，还原后的产物用丙酮将双羟基保护后再用雷尼镍还原即得到(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯。
Figure BDA0001573693290000022
按上述路线，以环氧氯丙烷为原料合成(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯需要8步，该工艺第(4)步合成收率较低，第(5)步需要用到贵金属锂化合物，第(6)步需要-80℃的低温，工艺流程长，反应的副产物多，因此整个合成路线的工业化成本偏高，安全方面也不易控制。
现有技术中，(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的合成很多需要用到中间体(R)-(-)-4-腈基-3-羟基丁酸乙酯，该化合物难以获得，且后续工艺用到贵金属锂，所以并不适合工业化。
综上所述，研发一种反应条件温和，成本低易于产业化的(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的合成工艺显得很有必要。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要提供一种阿托伐他汀中间体的生物合成方法，该方法反应条件温和，能简化现有的生产工艺。
为解决上述技术问题，本发明所提供的阿托伐他汀中间体的生物合成方法，包括以下步骤：式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯在氨基酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成式I化合物(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，即为阿托伐他汀中间体，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000031
优选地，氨基酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，氨基酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，酶催化反应在甲醇和缓冲溶液构成的混合溶液中进行，甲醇与混合溶液的体积比控制为10％-30％，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
进一步地，式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸在转氨酶的作用下进行酶催化反应生成式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸；反应式如下：
Figure BDA0001573693290000032
步骤2：式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸进行双羟基保护得到化合物II(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，采用的保护基为2,2-二甲基丙烷；
Figure BDA0001573693290000041
进一步地，步骤1中，转氨酶基因来源于Vibrio fluvialis，所述转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，酶催化反应体系中加入丙氨酸作为氨基供体，添加PLP作为辅酶。
进一步地，式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸由式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000042
进一步地，醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶氨基酸序列如SEQID NO：3所示。
更进一步地，式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸在酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000043
其中，酮酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，所述酮酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
更进一步地，式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸由式VII化合物3-羰基丙酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000051
其中，所述醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶氨基酸序列如SEQID NO：3所示。
再更进一步地，式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸和丙酮酸在醛缩酶和酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化一锅法反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000052
所述醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述酮酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，所述酮酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明提供了一种全新的阿托伐他汀中间体的生物合成方法，反应条件温和，对设备无特殊要求；
其二，本发明化学合成法和酶法结合，对环境无污染；
其三，本发明反应条件易控制，操作简便，工艺流程简单。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制，仅作举例而已。同时通过说明本发明的优点将变得更加清楚和容易理解。
实施例1
1、醛缩酶的制备
重组醛缩酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Escherichia coli的醛缩酶的氨基酸序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组醛缩酶的重组醛缩酶基因工程菌。
将重组醛缩酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Escherichia coli的醛缩酶基因工程菌全细胞。采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Escherichia coli的醛缩酶基因工程菌全细胞的破碎酶液，即为如下实施例2-7所用的醛缩酶，所述醛缩酶氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2、酮酸脱羧酶的制备
重组酮酸脱羧酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Saccharomycescerevisiae的酮酸脱羧酶的氨基酸序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组酮酸脱羧酶的重组酮酸脱羧酶基因工程菌。
将重组酮酸脱羧酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomycescerevisiae的酮酸脱羧酶基因工程菌全细胞。采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Saccharomyces cerevisiae的酮酸脱羧酶基因工程菌全细胞的破碎酶液，即为如下实施例2-7所用的酮酸脱羧酶，所述酮酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。
3、氨基酸脱羧酶的制备
重组氨基酸脱羧酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Saccharomycescerevisiae的氨基酸脱羧酶的氨基酸序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组氨基酸脱羧酶的重组氨基酸脱羧酶基因工程菌。
将重组氨基酸脱羧酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomycescerevisiae的氨基酸脱羧酶基因工程菌全细胞。采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Saccharomyces cerevisiae的氨基酸脱羧酶基因工程菌全细胞的破碎酶液，即为如下实施例2-7所用的氨基酸脱羧酶，所述氨基酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4、转氨酶的制备
重组转氨酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Vibrio fluvialis的转氨酶的氨基酸序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组转氨酶的重组转氨酶基因工程菌。
将重组转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Vibrio fluvialis的转氨酶基因工程菌全细胞。采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Vibrio fluvialis的转氨酶基因工程菌全细胞的破碎酶液，即为如下实施例2-7所用的转氨酶，所述转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2
式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸由式VII化合物3-羰基丙酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000081
具体反应过程如下：在500mL摇瓶中，将式VII化合物3-羰基丙酸叔丁酯(10g，69.44mmol)溶于40mL甲醇，再向摇瓶中加入丙酮酸(17.6g，0.200mol)，再加入160mL磷酸盐缓冲溶液、40g的醛缩酶，醛缩酶的制备如实施例1，再加入1mM的PLP，20mM的MgCl2，控制反应体系中pH值为7.5，在摇床中反应14h，后用乙酸乙酯萃取有机相，旋蒸，得到油状液体，气质联用检测产物，产物式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸的浓度(峰面积占比)为16.79％，ee值为76.43％。
实施例3
式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸在酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000091
具体反应过程如下：在500mL摇瓶中，将式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸(20g，86.21mmol)溶于20mL的DMSO中，再向摇瓶中加入180mL磷酸盐缓冲溶液，再向摇瓶中加入30g的酮酸脱羧酶，酮酸脱羧酶的制备如实施例1，再加入1mM的TPP、20mM的MgCl2，控制反应体系中pH值为8，控制反应体系中温度为6℃，在摇床中反应22h，纯化，经1H-NMR和13C-NMR和MS确认得到产物V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯，收率为62.19％。
实施例4
式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸和丙酮酸在醛缩酶和酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化一锅法反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000092
具体反应过程如下：
在500mL摇瓶中，将式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸(10g，69.44mol)溶于25mL的DMSO中，再向摇瓶中加入丙酮酸(26.4g，0.300mol)，加入175mL磷酸盐缓冲溶液，再向反应体系中加入40g的酮酸脱羧酶，1mM的TPP，40g的醛缩酶，1mM的PLP，20mM的MgCl2，醛缩酶和酮酸脱羧酶的制备如实施例1，控制反应体系中pH值为7.5，在摇床中反应14h，用乙酸丁酯萃取有机相，旋蒸，得到油状液体，结构经1H-NMR和13C-NMR和MS确认为式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯，收率为42.19％，产物式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯ee值为85.3％。
实施例5
式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸由式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000101
具体反应过程如下：在500mL摇瓶中，将式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯(9g，47.87mmol)溶于20mL的DMSO中，再向摇瓶中加入丙酮酸(17.6g，0.200mol)，加入磷酸盐缓冲溶液180mL，再向反应体系中加入40g的醛缩酶，1mM的PLP，20mM的MgCl2，醛缩酶的制备如实施例1，控制反应体系中pH值为8，在摇床中反应14h，萃取有机相，旋蒸，得到油状液体，结构经确认为式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸，转化率为76.79％。
实施例6
所述式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸在转氨酶的作用下进行酶催化反应生成式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸；反应式如下：
Figure BDA0001573693290000111
具体反应过程如下：在500mL摇瓶中，将式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸(16g，57.97mmol)加入195mL的MOPS缓冲溶液中，再向反应体系中加入丙胺酸(17.8g，0.2mol)和5mL乙醇，加入转氨酶和磷酸吡哆醛，转氨酶的投入浓度为25g/L，磷酸吡哆醛的投入浓度为15mM，进行转化反应，控制转化体系的pH值为7.5，控制转化体系的温度为25℃，转化18h，得到转化液，纯化，得到油状液体，产物结构经结果鉴定确认为式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸，转化率为89.68％。
步骤2：式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸进行双羟基保护得到式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，采用的保护基为2,2-二甲基丙烷；
Figure BDA0001573693290000112
具体反应过程如下：向200mL的圆底烧瓶中计入干燥的甲醇80mL，将体系于-75℃下加入2,2-二甲基丙烷(14.4g，0.2mol)，式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸(22.16g，0.08mol)，搅拌过夜，旋蒸去除溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，过滤，滤液减压浓缩经硅胶柱层析分离得到油状液体，结构经鉴定为式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯。收率为73.31％。
实施例7
式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯在氨基酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成式I化合物(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，即为阿托伐他汀中间体，反应式如下：
Figure BDA0001573693290000121
具体反应过程如下：
在烧杯中将式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯(20g，0.063mol)溶于20mL的DMSO中，用磷酸盐缓冲溶液将反应体系定容至200mL，反应体系转入500mL摇瓶中，再向摇瓶中加入20mM的MgCl2，46g的氨基酸脱羧酶，1mM的TPP，氨基酸脱羧酶的制备如实施例1，控制反应体系中pH值为7.5，在摇床中反应14h，萃取有机相，旋蒸，得到油状液体，产物结构经1H-NMR和13C-NMR和MS确认为式I化合物(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，即阿托伐他汀中间体，数据如下：[α]D 14＝+16.8(C 0.34，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.24～4.27(m，1H)，3.95～4.02(m，1H)，3.26(m，2H)，2.89(m，2H)，2.42(dd，1H)，2.29(dd，1H)，1.62～1.74(m，2H)，1.51～1.58(m，1H)，1.45(s，3H)，1.44(s，9H)，1.36(s，3H)，1.21～1.29(m，1H)。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝170.1，98.8，80.4，67.3，66.1，42.5，39.1，38.1，36.4，29.9，28.1，19.7。MS(ESI)：m/z 274[M+H]+。收率为56.79％。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
Figure RE-IDA0001588344190000011
Figure RE-IDA0001588344190000021
Figure RE-IDA0001588344190000031
Figure RE-IDA0001588344190000041
Figure RE-IDA0001588344190000051
Figure RE-IDA0001588344190000061
Figure RE-IDA0001588344190000071

Claims (4)

1.一种阿托伐他汀中间体侧链化合物 I 的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯在氨基酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成式I化合物(4R,6R)-6-(氨乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，即为阿托伐他汀中间体侧链化合物 I ，反应式如下：
Figure FDA0002537604340000011
所述氨基酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，氨基酸脱羧酶基因序列如SEQ ID NO：1所示；
所述式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯的制备方法包括以下步骤：
步骤1：式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸在转氨酶的作用下进行酶催化反应生成式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸；反应式如下：
Figure FDA0002537604340000012
步骤2：式III化合物(2R,4S,6S)-2-氨基-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-8-羰基辛酸进行双羟基保护得到化合物II(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，采用的保护基为2,2-二甲基丙烷；
Figure FDA0002537604340000021
所述步骤1中，转氨酶基因来源于Vibrio fluvialis，所述转氨酶基因序列如SEQ IDNO：2所示，酶催化反应体系中加入丙氨酸作为氨基供体，添加PLP作为辅酶；
所述式IV化合物(4R,6S)-8-叔丁氧基-4,6-二羟基-2,8-二羰基辛酸由式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure FDA0002537604340000022
所述醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶基因序列如SEQ ID NO：3所示；
所述式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸在酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure FDA0002537604340000023
所述酮酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，所述酮酸脱羧酶基因序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的阿托伐他汀中间体侧链化合物 I 的生物合成方法，其特征在于，所述式II化合物(4R,6R)-6-(1-氨基-1-羧基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯在氨基酸脱羧酶的作用下进行酶催化反应在甲醇和缓冲溶液构成的混合溶液中进行，甲醇与混合溶液的体积比控制为10％-30％，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的阿托伐他汀中间体侧链化合物 I 的生物合成方法，其特征在于，式VI化合物(S)-6-叔丁氧基-4-羟基-2,6-二羰基己酸由式VII化合物3-羰基丙酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶的作用下进行酶催化反应生成，反应式如下：
Figure FDA0002537604340000031
其中，所述醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶基因序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的阿托伐他汀中间体侧链化合物 I 的生物合成方法，其特征在于，式V化合物(S)-3-羟基-1-羰基戊酸叔丁酯由式VII化合物3-羰基丙酸叔丁酯和丙酮酸在醛缩酶和酮酸脱羧酶的作用下进行酶催化一锅法反应生成，反应式如下：
Figure FDA0002537604340000032
所述醛缩酶基因来源于Escherichia coli，所述醛缩酶基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述酮酸脱羧酶基因来源于Saccharomyces cerevisiae，所述酮酸脱羧酶基因序列如SEQID NO：4所示。
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