CN108715881B

CN108715881B - 一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法

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Publication number: CN108715881B
Application number: CN201810421118.XA
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 郑裕国; 张琴; 汤晓玲; 卢夏锋
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108715881A

Abstract

本发明公开了一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的制备方法，包括：外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸。该方法反应条件温和、操作简单、易行，区域和立体选择性好，由外消旋底物IBSN一锅法合成普瑞巴林关键手性中间体(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的转化率可达49.5％，e.e.为99.5％，接近理论转化率50％，同时光学纯度超过99％，对简化普瑞巴林的生产工艺步骤，降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。

Description

一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，具体地，本发明涉及一种腈水解酶、酰胺酶两步酶法区域、立体选择性生物催化外消旋3-氰基-5-甲基己腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。

背景技术

普瑞巴林(Pregabalin)，化学名(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(I)，是一种新型的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质释放，具有良好的抗焦虑和神经病理性疼痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47:3500-3504)。

与传统药物相比，普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、毒副作用小、持续时间长、耐受性强等优点，被认为是最有希望的抗癫痫治疗药物之一(Expert.Opin.Inv.Drug.,2003,12:663-672)。自上市以来，普瑞巴林的全球销售额快速增长，已跻身全球畅销处方药行列，市场前景十分广阔。

作为手性药物，普瑞巴林合成的关键是构建手性源。生物催化法具有反应条件温和、过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等优点成为最受瞩目的手性合成技术之一。其中，腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、原子经济性高等显著优势(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2006,41:75-80)。

然而，腈水解酶生物催化过程中一个挑战性的问题是副产物多，产物纯化过程繁琐，收率和光学纯度难以兼得，如专利CN1942587B利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶催化异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度分别对应为：产率34.2％、光学纯度96.3％e.e.；产率38.6％、光学纯度91.1％e.e.；产率35.5％、光学纯度95.5％e.e.和产率17.5％、光学纯度98.5％e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”)；为同时提高(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度，采用NIT-102C2在氮气氛下，50个间隙反应循环累积制备产物的产率最高才提至43.2％，光学纯度提至99.0％e.e.。

专利CN103114054B提供了一种利用节杆菌ZJB-09277立体选择性水解制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法：以外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物，以节杆菌ZJB-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂，于pH 6.5～8.0的缓冲液构成的转化反应体系中，25～50℃下反应得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸，产物的产率及光学纯度与底物酯的种类息息相关，当底物为3-氰基-5-甲基己酸丙酯时转化率高达49.9％，但光学纯度只有86.7％e.e.；当底物为3-氰基-5-甲基己酸乙酯时光学纯度达91.2％，但转化率只有31.8％。

因此，开发能够同步提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和纯度，易于工业化的工艺路线，成为降低普瑞巴林生产成本的关键，对抗癫痫治疗医学发展具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种区域、立体选择性生物催化外消旋异丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。该方法反应条件温和、操作简单、易行，区域和立体选择性高，合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率接近理论转化率，同时光学纯度超过99.0％，对合成高光学纯度普瑞巴林、降低普瑞巴林生产成本具有重要意义。

本发明发现某些特定腈水解酶的腈水解活性和腈水合活性与底物IBSN的β位强电负性氰基取代基具有协同作用，能够将IBSN转化成高光学纯度的(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(II)和(S)-3-氰基-5-甲基己酸(III)，催化过程具有高度的立体和区域选择性。

基于上述发现，本发明提供一种普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成新方法：将酰胺酶与腈水解酶进行耦联并严格调控其配比，同步消除化合物II的积累，实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，有效提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和光学纯度，同时还减少了后续产物的分离纯化步骤，极大的简化了普瑞巴林的生产工艺步骤，对降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。

一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：

外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

本发明所涉及腈水解酶的来源包括，但不限于十字花科植物芜菁(Brassicarapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999)，对所述腈水解酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。

实验结果显示：腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力：BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT；腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT；综合考量可知，AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此，腈水解酶优选为AaNIT。

本发明所涉及酰胺酶的来源包括，但不仅限于Pantoea sp.YR343、Comamonascomposti和Deftia tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494)，对所述酰胺酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。

实验结果显示：酰胺酶活力为Pa-Ami>Dt-Ami>Cc-Ami。

本发明涉及一种双酶体系催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，具体地，所述反应体系中的酶催化剂可为完整微生物细胞、微生物细胞破碎液、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂等形式。作为优选，所述催化体系中生物催化剂以完整微生物细胞的形式存在。

进一步优选，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供。

所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：

(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到腈水解酶基因工程菌；或，

设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列，克隆至空载体pET28b，构建表达载体，热击转化到大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到酰胺酶基因工程菌；

(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养6～8h后，得菌体种子液；

将上述菌体种子液以2％的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养至菌体OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～30℃、100～150rpm发酵10～12h，收集发酵液于0～5℃，6000～9000rpm的条件下离心10～15min，生理盐水洗涤菌体后，得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞；

所述卡那霉素的浓度为30～60mg/L；

所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mM。

本发明中酰胺酶的添加不仅可以消除(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累，减少后续的分离步骤，还可以提高产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率。在不积累(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的前提下，优化酰胺酶的添加量，可减少体系中菌体添加量，有利于降低工艺的生产成本；作为优选，所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。

所述转化体系中，底物IBSN初始浓度为10～150g/L。

所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。

作为优选，所述催化体系中的反应温度为30～40℃。

所述反应介质由纯水或缓冲体系组成；所述缓冲体系的pH范围约6.0-11.0，所述的缓冲体系由磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液及Gly-NaOH缓冲液组成，作为优选，所述催化体系中的反应介质为Tris-HCl缓冲液，所述缓冲体系的pH为7.5-9.0。在弱碱性环境中，生物催化剂均保持在较高的活性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)现有技术中，底物IBSN的浓度越大，转化越困难，产率越低，本发明可将底物IBSN的初始浓度提至150g/L。

(2)由外消旋底物IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率可达49.5％，e.e.为99.5％；

(3)实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，极大缩减了后续产物的分离纯化步骤，对简化普瑞巴林的生产工艺步骤，降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例4中腈水解酶催化IBSN水解反应液的气相色谱图。

图2为本发明实施例4中腈水解酶AaNIT催化IBSN水解的反应进程图。

图3为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成路线图。

图4为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的反应进程图。

图5为本发明实施例7中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的气相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》。

实施例1构建重组腈水解酶工程菌

根据NCBI中报道的芜菁(Brassica rapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999)全合成该基因序列，两端设计酶切位点XhoI和XbaI，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌BL21(DE3)，培养检测阳性菌，得到重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT、BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2、BL21(DE3)/pET28b-AtNIT和BL21(DE3)/pET28b-AaNIT。

实施例2构建重组酰胺酶工程菌

根据已报道的来源于Pantoea sp.YR343、Comamonas composti和D.tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494)，对其基因序列进行全合成。设计含有EcoRI和NcoI位点的上下游引物，扩增基因后插入pET28b中，构建表达载体，热击转化到BL21(DE3)感受态细胞中，得到酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami、BL21(DE3)/pET28b-Cc-Ami和BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami。

实施例3基因工程菌的表达培养

挑取单菌落接入5mL液体LB培养基中，卡那霉素终浓度为50mg/L。培养条件为37℃，200rpm，培养6-8h。将上述种子液以2％的体积比转接至新鲜的含有终浓度为50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体OD₆₀₀约为0.6-0.8时，向上述LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，终浓度为0.1mM)，28℃、150rpm诱导培养10-12h，收集发酵液于4℃，8000rpm的条件下离心10min，然后加入生理盐水洗涤菌体一次，将离心所得菌体置于-20℃冰箱保存，应用于以下实施例中。

实施例4重组腈水解酶催化IBSN及产物组成分析

(a)重组腈水解酶的活力及立体选择性

对实施例3中培养得到的重组腈水解酶基因工程菌进行活力和立体选择性测定，具体内容如下：

含腈水解酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH8.0)，外消旋异丁基丁二腈30g/L，湿菌体10g/L；反应液于30℃、200rpm条件下反应4h，取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应。

结果显示腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力：BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT，具体数据如表1所示：

表1重组腈水解酶催化IBSN水解结果

注：E意指“对映体选择率，enantiomeric ratio”，是表征酶立体选择性的参数。

(b)重组腈水解酶催化IBSN反应过程中产物组成分析

对重组腈水解酶催化IBSN反应产物进行气相色谱分析，结果显示除底物、产物峰外有另一色谱峰存在，如图1所示。为了确定该物质结构，对该物质进行了分离、纯化。具体步骤如下：收集反应液置于沸水中加热20min，利用减压抽滤去除截留的杂蛋白及部分底物。再加入2倍体积乙酸乙酯进行萃取，去除反应液中的底物(该步骤重复两次以确保底物有效去除)，收集下层水相并利用NaOH调pH至12.0，再次加入2倍体积乙酸乙酯萃取。收集上层有机相，旋蒸后得到浅黄色油状化合物，经结构鉴定为(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺。

NMR表征结果：¹H NMR(500MHz,CDCl₃-d₁):δ5.73(d,J＝37.8Hz,2H),3.21-3.13(m,1H),2.65-2.57(m,1H),2.45(dd,J＝15.3,6.6Hz,1H),1.95-1.81(m,1H),1.67-1.59(m,1H),1.39(tdd,J＝13.5,9.9,5.5Hz,1H),1.02-0.95(m,6H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃-d₁):δ170.77,121.60,40.80,38.49,26.23,26.02,22.93,21.25；

质谱表征结果：MS(ESI):m/z 155.1[M+H]⁺。

参照上述步骤(a)，对重组腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT，具体数据如表2所示。

表2重组腈水解酶催化IBSN反应过程产物组成

(c)重组腈水解酶催化IBSN的反应进程

据表1和表2数据结果显示，AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此对其催化IBSN的反应进程进行研究。将0.25g的含有腈水解酶的湿菌体BL21(DE3)/pET28b-AaNIT加入到10mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)中，并加入底物IBSN 0.5g。于30℃、200rpm条件下反应，每隔0.5h取样，对反应进程进行检测，反应进程如图2所示。8h后，底物IBSN转化为产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸(记为(S)-CMHA)的转化率为49.5％，e.e.为99.5％，(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(记为(S)-CMHM，相对于目标产物，可视为副产物)含量为0.7g/L。

产物3-氰基-5-甲基己酸含量的测定：利用液相色谱(岛津LC-16)外标法测定转化液中(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的含量。色谱柱为

C-18Column(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为缓冲液(0.58g/L磷酸氢二铵，1.83g/L高氯酸钠，高氯酸调节pH为1.8)：乙腈＝60:40(v/v)，流速为1mL/min，紫外检测波长225nm，柱温30℃。

底物外消旋异丁基丁二腈、产物3-氰基-5-甲基己酸和3-氰基-5-甲基己酰胺的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890N(安捷伦)，毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik Switzerland)。色谱条件为：进样量1.0μL，进样口、检测器温度均为250℃，柱温为170℃保持10min，10℃/min升温至200℃，保持5min。载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，分流比为50:1。

对映体过量值(e.e.)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(EnzymeMicrob.Technol.,1993,15:1051)。

实施例5重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解

(a)重组酰胺酶活力的测定

对实施例3中培养得到的重组酰胺酶基因工程菌进行活力的检测，具体步骤如下所示。

含酰胺酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH8.0)，(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺30g/L，湿菌体10g/L。反应液于30℃、200rpm条件下反应30min。取样500μL，加入200μL 2M HCl终止反应后，参照实施例4中的液相色谱法对转化液中的(S)-3-氰基-5-甲基己酸含量进行测定。结果如表3所示。

表3重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解

(b)酰胺酶添加量的优化

转化体系组成及操作如下：在20mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中加入2g的外消旋异丁基丁二腈(IBSN)及1g的湿菌体细胞，菌体细胞为含腈水解酶BrNIT与含酰胺酶Pa-Ami的细胞混合体，且两者之间的质量比分别设为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1、12:1及15:1)，于30℃、200rpm条件下反应，反应3h后取样进行检测，检测方法参照实施例4。结果显示，在比值达到12:1、9:1、7:1及更小比值时，副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无积累。比值为15:1和不添加酰胺酶时，副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无法完全被水解，且随着酰胺酶用量的减少，积累量逐渐增加。

实施例6双酶耦联一锅法催化IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸

重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

合成路线图如图3所示，将100mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)加入到250mL的三口烧瓶中，同时加入底物IBSN 8g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共6g(wcw，二者质量比为5:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应4.5h，转化率达到49.0％，e.e.为99.2％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累(图4)。

实施例7重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

分别称取5g实施例3中获得的重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和0.6g重组酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami的湿菌体，投入到含有100g/LIBSN的100mL Tris-HCl缓冲液中(50mM，pH＝8.0)，混匀并于30℃水浴反应8h，转化率达到47.5％，e.e.为99.1％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成(图5)。

实施例8双酶耦联一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

将10mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8.0)加入到50mL的具塞反应瓶中，同时加入底物IBSN 1.2g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共0.6g(wcw，二者质量比为9:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应10h，转化率达到49.1％，e.e.为98.7％，反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成。

需要指出的是，上述实验实例仅为说明本发明的构思及特点，其目的是让熟悉本发明的人了解本实验并据以实施，并不能限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质做出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：

外消旋异丁基丁二腈在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸；

所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT；

所述的酰胺酶为Pa-Ami或Dt-Ami。

2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10～150g/L。

3.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供；所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。

4.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。

5.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：

所述卡那霉素的浓度为30～60mg/L；

所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mM。

6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。

7.根据权利要求6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系，所述缓冲液体系的pH范围为6.0～11.0。