ES2331140T3 - Metodo para la preparacion enzimatica de acido (s)-3-ciano-5-metilhexanoico. - Google Patents
Metodo para la preparacion enzimatica de acido (s)-3-ciano-5-metilhexanoico. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para preparar ácido (S)-3-ciano-5-metilhexanoico, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto 2-isobutil-succinonitrilo racémico en un medio de reacción con un catalizador enzimático que tenga actividad nitrilasa; y (b) recuperar el ácido (S)-3-ciano-5-metilhexanoico del medio de reacción; y, opcionalmente, recuperar (R)-2isobutil-succinonitrilo inalterado.
Description
Método para la prepración enzimática de ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico.
La presente invención proporciona métodos para
la conversión enzimática de
2-isobutil-succinonitrilo en ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico,
el cual es un producto intermedio útil en la síntesis de ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina). La pregabalina puede usarse para tratar ciertas
enfermedades cerebrales, por ejemplo, en el tratamiento y
prevención de trastornos repentinos, dolor, y trastornos
psicóticos. Ya que la pregabalina es eficaz en mejorar las
funciones cerebrales, es también útil en el tratamiento de
pacientes geriátricos.
La hidrólisis enzimática de nitrilos orgánicos
en los correspondientes ácidos carboxílicos y amidas proporciona
un importante método sintético alternativo para un amplio espectro
de compuestos útiles. La hidrólisis química convencional de
nitrilos en los correspondientes ácidos carboxílicos y amidas se
lleva a cabo típicamente usando un catalizador de ácido o base
fuerte a altas temperaturas de reacción, haciéndola incompatible
con compuestos que contienen grupos funcionales sensibles. Además,
la poca selectividad de la hidrólisis química puede dar como
resultado subproductos no deseados junto con grandes cantidades de
sales inorgánicas. Por contraste, la hidrólisis enzimática de
nitrilos se produce bajo condiciones suaves (pH neutro, 30ºC),
ofreciendo el potencial para una alta quimio-, regio-, y
estereoselectividad. Como una ventaja añadida, se evita la
formación de sales inorgánicas como subproductos.
Las aplicaciones industriales mejor conocidas de
las enzimas que convierten nitrilos son la producción de
acrilamida (T. Nagasawa et al., Tibtech., 1992, vol.
10, 402-408) y nicotinamida (T. Nagasawa et
al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, vol. 54,
1766-1769), usando una
nitrilo-hidratasa de Rhodococcus rhodochrous
J1. Varias revisiones recientes (L. Martinková et al.,
Current Organic Chemistry, 2003, vol. 7,
1279-1295 y D. Cowan et al.,
Extremophiles, 1998, vol. 2, 207-216)
describen la bioquímica y las aplicaciones industriales potenciales
de enzimas que convierten nitrilos.
Las hidrólisis enzimáticas de nitrilos están
catalizadas por nitrilasas, que convierten nitrilos en los
correspondientes ácidos carboxílicos, y
nitrilo-hidratasas, que convierten nitrilos en las
correspondientes amidas. Las amidasas, que hidrolizan amidas en los
ácidos carboxílicos correspondientes, pueden usarse en combinación
con nitrilo-hidratasas para convertir nitrilos en
ácidos carboxílicos.
El uso de una enzima nitrilasa para preparar un
ácido carboxílico a partir del nitrilo correspondiente se describe
en el documento de patente WO 02/072856. La incorporación de la
enzima en una matriz polímera con reticulación, proporcionó un
catalizador con una integridad física y bioquímica mejorada.
La preparación regioselectiva de ácidos
\omega-nitrilo-carboxílicos a
partir de \alpha,\omega-dinitrilos alifáticos
con un biocatalizador fue descrita en la patente de EE.UU. Nº
5.814.508. Por ejemplo, se usó un catalizador que tenía actividad
nitrilasa para convertir 2-metilglutaronitrilo en
ácido 4-cianopentanoico.
K. Yamamoto, et al., J. Ferment.
Bioengineering, 1992, vol. 73, 125-129
describen el uso de células microbianas que tienen actividad tanto
nitrilo-hidratasa como amidasa, para convertir
trans-1,4-dicianociclohexano en ácido
trans-4-cianociclohexanocarboxílico.
Se ha informado de conversiones biocatalíticas
regioselectivas de dinitrilos en ácidos carboxílicos sustituidos
con ciano para una serie de compuestos de
\alpha,\omega-dinitrilos alifáticos, usando
células microbianas que tienen actividad nitrilasa alifática o una
combinación de actividades nitrilo-hidratasa y
amidasa (J. E. Gavagan et al., J. Org. Chem., 1998,
vol. 63, 4792-4801).
Se han descrito conversiones enzimáticas
estereoselectivas de nitrilos para la preparación de ácidos
carboxílicos y amidas quirales enriquecidos en un enantiómero (M.
Wieser et al., Chapter in Stereoselective
Biocatalysis, Marcel Dekker Inc.: New York, 2000,
461-486). Se usa una enzima nitrilasa
estereoselectiva de Alcaligenes faecalis ATCC 8750 para
preparar ácido (R)-mandélico a partir de
mandelonitrilo racémico (K. Yamamoto et al., Appl.
Environ. Microbiol., 1991, vol. 57, 3028-3032).
Una nitrilasa del Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
hidroliza preferentemente
(+)-2-metilhexanitrilo en una mezcla
racémica de 2-metilhexanitrilo, dejando
(-)-2-metilhexanitrilo sin
reaccionar (M. Gradley et al., Biotechnology Lett.,
1994, vol. 16, 41-46). La patente de EE.UU. Nº
5.593.871 describió un procedimiento para preparar amidas de ácidos
2-alcanoicos enriquecidas en un enantiómero, a
partir de nitrilos, usando microorganismos que contenían
nitrilo-hidratasas estereoselectivas. Se prepararon
\alpha-amino-ácidos y amidas enantioméricamente
puros a partir de nitrilos de glicina racémica sustituida con
\alpha-arilo y \alpha-alquilo,
usando Rhodococcus sp. AJ270 que contenía una
nitrilo-hidratasa estereoselectiva y una amidasa
estereoselectiva (M.-C. Wang et al., J. Org. Chem.,
2002, vol. 67, 6542).
Se ha encontrado que el valor terapéutico de la
pregabalina racémica, particularmente su eficacia como
anticonvulsivo, es atribuible principalmente al enantiómero
(S). Con el objetivo de proporcionar un tratamiento
farmacológico rentable con pregabalina, se han investigado varias
rutas sintéticas hacia el compuesto enriquecido en el enantiómero
(S). Por ejemplo, la hidrogenación asimétrica de la olefina
sustituida con ciano apropiada, seguido por reducción del grupo
ciano a la amina correspondiente, proporciona pregabalina
enriquecida sustancialmente en el enantiómero (S)
(publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nº
2003/0212290).
La síntesis de pregabalina, sus derivados y
análogos mediante métodos puramente químicos está descrita en las
patentes de EE.UU. 6.642.398; 6.635.673; y 6.046.353.
En el procedimiento de la presente invención, la
conversión biocatalítica regio- y estereoselectiva se logra usando
catalizadores enzimáticos que tienen actividad nitrilasa.
La presente invención se refiere a un método
para preparar un enantiómero (S) de un compuesto de fórmula
I:
en la que el C3 tiene una
configuración
(S);
que comprende las etapas de:
(1a) poner en contacto un compuesto de fórmula
II:
en un medio de reacción con un
catalizador enzimático que tenga actividad nitrilasa;
y
(1b) recuperar el isómero (S) del
compuesto de fórmula I del medio de reacción; y, opcionalmente,
recuperar isómero (R) inalterado del compuesto II.
El compuesto de fórmula I es útil en la síntesis
de compuestos que tienen actividad farmacéutica, tales como
pregabalina.
En una realización preferida de la invención, el
compuesto de fórmula II es una mezcla racémica que comprende los
isómeros 3R y 3S.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
un procedimiento por el que
2-isobutil-succinonitrilo racémico
es convertido en ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico,
que comprende las etapas de:
(2a) poner en contacto
2-isobutil-succinonitrilo racémico
en un medio de reacción con un catalizador enzimático que tenga
actividad nitrilasa; y
(2b) recuperar ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
de la mezcla acuosa; y, opcionalmente, recuperar
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado.
Preferiblemente, el medio de reacción es un
medio acuoso.
En una realización preferida de la presente
invención, el isómero (R) recuperado e inalterado del
compuesto II es posteriormente racemizado calentando con una base
débil, en presencia de un disolvente orgánico. Una base preferida
es
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno,
y un disolvente preferido es tolueno. Opcionalmente, el racemato
resultante de II puede reciclarse en cualquiera de los
procedimientos indicados anteriormente, en la etapa (1a) o
(2a).
En una realización de la presente invención, el
catalizador enzimático está en forma de células microbianas
enteras, extractos de células microbianas, enzimas parcialmente
purificadas, enzimas purificadas, o catalizadores enzimáticos que
están inmovilizados sobre un soporte.
En otra realización de la presente invención, el
catalizador enzimático es una enzima parcialmente purificada. Los
ejemplos de enzimas parcialmente purificadas incluyen, pero no
están limitados a, NIT-101,
NIT-102, NIT-103 (BioCatalytics
Inc., Pasadena, CA), y nitrilasa de Arabidopsis thaliana
(Jülich Fine Chemicals, Jülich, Alemania).
En una realización preferida de la presente
invención, el catalizador enzimático de nitrilasa está inmovilizado
sobre un soporte. Los ejemplos de catalizadores enzimáticos de
nitrilasa inmovilizados incluyen, pero no están limitados a,
NIT-102 C2 (BioCatalytics Inc., Pasadena, CA),
NIT-102 inmovilizado sobre Eupergit (Röhm GmbH &
Co. KG, Darmstadt, Alemania), y nitrilasa de Arabidopsis
thaliana inmovilizada sobre Eupergit. En una realización
preferida, el catalizador enzimático de nitrilasa inmovilizado es
NIT-102 C2.
En otra realización, los medios de reacción
comprenden agua destilada o agua tamponada. Preferiblemente, el
agua tamponada está tamponada a un pH en el intervalo desde
aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 10,0, y lo más
preferiblemente a un pH en el intervalo desde aproximadamente 6,0
hasta aproximadamente 8,0.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la preparación de ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina), que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto
2-isobutil-succinonitrilo racémico
en un medio de reacción con un catalizador enzimático que tenga
actividad nitrilasa;
(b) recuperar ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
del medio de reacción;
(c) convertir ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
en una sal de ácido; y
(d) hidrogenar la sal de ácido para formar ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina).
Preferiblemente, la sal de ácido tiene la
fórmula
en la que M es Na, K, Li, NH_{4},
NH_{2}R^{6}R^{7},
NH_{3}R^{1} o NH
(R^{6})_{2}R^{7} en el que R^{6} y R^{7} son cada
uno independientemente alquilo
(C_{1}-C_{6}).
Por comodidad, se recogen aquí ciertas
expresiones empleadas en la memoria descriptiva, ejemplos y
reivindicaciones adjuntas. A no ser que se defina de otra manera,
todas las expresiones técnicas y científicas usadas en la presente
invención tienen el mismo significado, como entienden comúnmente
las personas de habilidad normal en la técnica a la que esta
invención pertenece.
La expresión "alquilo" es un grupo lineal o
ramificado desde 1 hasta 8 átomos de carbono, que incluye, pero no
está limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo,
iso-butilo, y terc-butilo.
La expresión "cicloalquilo", como se usa en
la presente invención, incluye restos derivados de hidrocarburos
cíclicos que contienen desde tres hasta siete átomos de carbono en
el anillo, que incluyen restos hidrocarbonados cíclicos sustituidos
con restos alquílicos lineales o ramificados.
La expresión "alcoxi", como se usa en la
presente invención, quiere decir "alquil-O-",
en el que "alquilo" se define como anteriormente.
La expresión "alquenilo" tiene la finalidad
de incluir cadenas hidrocarbonadas de una configuración o lineal o
ramificada, que comprende uno o más dobles enlaces
carbono-carbono que puedan existir en cualquier
punto estable a lo largo de la cadena, tales como etenilo y
propenilo. Los grupos alquenilo tendrán típicamente desde 2 hasta
aproximadamente 12 átomos de carbono, más típicamente desde 2 hasta
aproximadamente 8 átomos de carbono.
La expresión racemato, como se usa en la
presente invención, quiere decir una mezcla equimolar de una pareja
de enantiómeros. Un racemato se forma usualmente cuando la
síntesis da como resultado la generación de un estereocentro. Como
se usa en la presente invención, la expresión mezcla racémica
quiere decir racemato.
\newpage
Como se usa en la presente invención, la
expresión enantiómeros hace referencia a compuestos que, a nivel
molecular, no son superponibles con imágenes especulares de cada uno
de ellos. Los enantiómeros pueden existir en cualquiera de las
configuraciones (R) o (S).
Como se usa en la presente invención, la
expresión síntesis estereoselectiva hace referencia a una reacción
química que conduce a la formación de un único estereoisómero o a
una mezcla de isómeros enriquecida en un enantiómero, de entre dos
o más estereoisómeros posibles. Como se usa en la presente
invención, la expresión regioselectiva hace referencia a una
reacción que tiene lugar en un único átomo o grupo de átomos de
entre dos o más átomos o grupos de átomos posibles.
La hidrólisis regioselectiva de un dinitrilo da
como resultado la conversión de un único grupo de nitrilo en un
grupo carboxílico.
"ºC" quiere decir grados Celsius;
La expresión "catalizador enzimático", como
se usa en la presente invención, quiere decir un catalizador que se
caracteriza o por una actividad nitrilasa o por una combinación de
actividad nitrilo-hidratasa y una actividad
amidasa. El catalizador puede estar en forma de una célula
microbiana entera, célula(s) microbiana(s)
permeabilizada(s), uno o más componentes celulares de un
extracto de célula microbiana, enzima(s) parcialmente
purificada(s), o enzima(s) purificada(s).
Como se usa en la presente invención, la
expresión exceso enantiomérico hace referencia a la fracción molar
del enantiómero dominante en una mezcla de enantiómeros, expresada
como tanto por ciento.
La expresión "mezcla de reacción acuosa"
quiere decir una mezcla del sustrato y el catalizador enzimático en
un medio acuoso en su mayor parte.
La expresión "actividad nitrilasa" quiere
decir una actividad enzimática que convierte un grupo de nitrilo en
un grupo de ácido carboxílico.
La expresión "actividad
nitrilo-hidratasa", como se usa en la presente
invención, quiere decir una actividad enzimática que convierte un
grupo de nitrilo en un grupo de amida.
La expresión "actividad amidasa" quiere
decir una actividad enzimática que convierte un grupo de amida en
un grupo de ácido carboxílico.
ATCC es American Type Culture Collection,
ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, Va.,
20110-2209, EE.UU. BioCatalytics Inc. está ubicada
en 129 N. Hill Avenue, Suite 103, Pasadena, CA, 91106, EE.UU.
Jülich Fine Chemicals GmbH está ubicada en
Rudolf-Schulten-Straße 5,
D-52428 Jülich, Alemania.
La presente invención proporciona un método
enzimático para preparar el ácido cianocarboxílico alifático de
fórmula I a partir de un dinitrilo de fórmula II. Puede usarse
cualquier método adecuado usado comúnmente en la técnica para
preparar los materiales de partida de dinitrilo (II).
El esquema 1 hace referencia a una realización
específica de la presente invención, en la que se usa un método
quimioenzimático en la conversión de
2-isobutil-succinonitrilo (V) en
ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
(VI). El compuesto VI puede usarse como un producto intermedio en
la síntesis de pregabalina (VII), como se ilustra en el esquema 2.
La etapa 3 del esquema 1 representa la racemización del subproducto
isómero (R) (Va), y su posterior reciclado en la etapa
2.
En la etapa 1 del esquema 1 se forma
2-isobutil-succinonitrilo racémico
(V), por condensación de isovaleraldehído (III) con cianoacetato de
etilo (IV), seguido por adición de KCN. El racemato surge del
estereocentro creado en el átomo de carbono C3 de V.
La etapa 2 del esquema 1 representa la
hidrólisis regio- y estereoselectiva del racemato del dinitrilo V,
proporcionando ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
(VI) más el isómero (R) de V inalterado.
La hidrólisis catalizada por nitrilasa de
2-isobutil-succinonitrilo (V) en
ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
(VI) es tanto regioselectiva como estereoselectiva. La
regioselectividad se basa en la conversión del grupo de ciano en un
grupo carboxílico sólo en el átomo de carbono C1. La reacción es
estereoselectiva por cuanto el enantiómero (S) de V está
implicado predominantemente en la conversión, dejando esencialmente
inalterado el enantiómero (R).
Como se ilustra en el esquema 2, una sal de
ácido VIa de ácido S-ciano VI es hidrogenada en una etapa
posterior, para obtener ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina). La reacción se lleva a cabo en presencia de un
catalizador de hidrogenación, preferiblemente níquel Raney. Las
sales de ácido aceptables incluyen compuestos de fórmula VIa, en la
que M es Na, K, Li, NH_{4}, NH_{2}R^{6}R^{7},
NH_{3}R^{6} o NH (R^{6})_{2}R^{7}, en las que
R^{6} y R^{7} son independientemente alquilo
(C_{1}-C_{6}).
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
En la conversión regio- y estereoselectiva del
racemato V en ácido (S)-ciano VI, como se
representa en el esquema 1, la enzima nitrilasa reacciona
predominantemente con el enantiómero (S). Por consiguiente,
la mezcla de reacción se enriquece cada vez más con el enantiómero
(R) Va, según progresa la conversión.
Otro objetivo es evitar un despilfarro
económico, reciclando o reusando el dinitrilo (R) Va
inalterado. Se describe adicionalmente, por lo tanto, un método
para la racemización del dinitrilo (R) (etapa 3, esquema 1),
y su reciclado posterior a través de la etapa 2 del esquema 1.
Pueden encontrarse diversas enzimas que tienen
actividad nitrilasa o una combinación de actividades
nitrilo-hidratasa y amidasa, a través de protocolos
de escrutinio, tales como técnicas de aislamiento por
enriquecimiento, que seleccionan inicialmente microorganismos con
base en su capacidad para proliferar en medios que contienen el
nitrilo enriquecido. Las técnicas de aislamiento por
enriquecimiento implican típicamente el uso de medios limitados en
carbono o limitados en nitrógeno complementados con un nitrilo de
enriquecimiento, que puede ser el sustrato de nitrilo para la
bioconversión deseada, o un compuesto de nitrilo estructuralmente
similar. Los microorganismos que poseen actividad nitrilasa pueden
seleccionarse inicialmente con base en su capacidad para proliferar
en medios que contienen el nitrilo de enriquecimiento. Gavagan et
al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999), vol. 52,
654-659) usaron técnicas de enriquecimiento para
aislar una bacteria gramnegativa, Acidovorax facilis 72W
(ATCC 55746), del suelo, usando 2-etilsuccinonitrilo
como la única fuente de nitrógeno. Acidovorax facilis 72W
(ATCC 55746) mostró ser útil para la conversión selectiva de
2-metilglutaronitrilo en ácido
4-cianopentanoico. También se usaron técnicas de
enriquecimiento para aislar la bacteria termófila Bacillus
pallidus Dac521, que cataliza la conversión de
3-cianopiridina en ácido nicotínico (Almatawah y
Cowan, Enzyme Microb. Technol. (1999), vol. 25,
718-724). Pueden ensayarse los microorganismos
aislados por técnicas de enriquecimiento para determinar la
actividad de hidrólisis de nitrilos, poniendo en contacto
suspensiones de células microbianas con un compuesto de nitrilo, y
ensayando la presencia del ácido carboxílico correspondiente,
usando métodos analíticos tales como cromatografía líquida de alta
resolución, cromatografía gas-líquido, o
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LCMS). Se
informa de las técnicas para ensayar la actividad de hidrólisis de
nitrilos de Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) en la
patente de EE.UU. Nº.5.814.508.
Una vez aislado un microorganismo que tiene
actividad nitrilasa o actividades nitrilo-hidratasa
y amidasa, puede emplearse ingeniería de enzimas para mejorar
diversos aspectos de la(s) enzima(s). Estas mejoras
pueden ser útiles para el presente método, e incluyen una creciente
selectividad, eficacia catalítica de la enzima, estabilidad a
temperaturas superiores, y un intervalo más amplio de pH, y
permitiendo que la enzima funcione en un medio de reacción que
incluye una mezcla de tampón acuoso y disolvente orgánico.
Pueden emplearse una variedad de técnicas para
producir un catalizador enzimático que tenga actividad nitrilasa o
actividades nitrilo-hidratasa y amidasa, además de
tener un rendimiento y producción mejorados, y calidad del producto
adecuada para un procedimiento particular de bioconversión,
incluyen, pero no están limitadas a, técnicas de ingeniería de
enzimas tales como métodos de diseño racional, que incluyen
mutagénesis dirigida, y técnicas de evolución dirigida que utilizan
mutagénesis al azar o técnicas de DNA shuffling (expresión
inglesa que significa una fusión de dominios de distintas proteínas
mediante intercambio de los fragmentos de ADN de los genes
correspondientes).
Los catalizadores enzimáticos adecuados para la
conversión del compuesto de fórmula II en un compuesto de fórmula I
están en forma de células microbianas enteras, células microbianas
permeabilizadas, extractos de células microbianas, enzimas
parcialmente purificadas o enzimas purificadas, y tales
catalizadores pueden ser inmovilizados sobre un soporte.
Este procedimiento puede llevarse a cabo en una
sola fase, poniendo en contacto
2-isobutil-succinonitrilo con un
catalizador enzimático en agua destilada, o en una disolución
acuosa de un tampón, que mantendrá el pH inicial de la reacción
entre 5,0 y 10,0, preferiblemente entre 6,0 y 8,0. Los agentes
tamponantes adecuados incluyen fosfato potásico y acetato cálcico.
Según avanza la reacción, el pH de la mezcla de reacción puede
cambiar debido a la formación de una sal de amonio del ácido
carboxílico que proviene de la funcionalidad de nitrilo
correspondiente del dinitrilo. La reacción puede transcurrir sin
control de pH, o puede añadirse un ácido o base adecuado durante el
curso de la reacción, para mantener el pH deseado. Sin embargo,
como se ha indicado anteriormente, es posible preparar
catalizadores enzimáticos usando tecnologías tales como ingeniería
de enzimas y evolución dirigida, que funcionarán eficazmente en
intervalos de pH más amplios.
Este procedimiento puede llevarse a cabo en
mezclas de reacción que comprenden dos fases: una fase acuosa, que
contiene inicialmente enzima y
2-isobutil-succinonitrilo disuelto,
y una fase orgánica, que consiste principalmente en
2-isobutil-succinonitrilo racémico.
Se preparan mezclas de reacción de dos fases añadiendo
2-isobutil-succinonitrilo a una
disolución acuosa de enzima y agentes tamponantes, de tal manera
que la cantidad de
2-isobutil-succinonitrilo añadido
rebase su límite de solubilidad en agua. El límite de solubilidad
en agua de 2-isobutil-succinonitrilo
en fosfato potásico 50 mM (30ºC, pH 7,5) es aproximadamente 0,06 M.
Durante el curso de la reacción, se forma la sal de amonio del ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico,
y aumenta su concentración en la fase acuosa, mientras que la fase
orgánica disminuye en volumen y se enriquece en
(R)-2-isobutil-succinonitrilo.
Alternativamente, este procedimiento puede llevarse a cabo también
en mezclas de reacción que comprenden tres fases: una fase acuosa,
que contiene inicialmente
2-isobutil-succinonitrilo disuelto,
una fase orgánica, que consiste principalmente en
2-isobutil-succinonitrilo racémico,
y una fase sólida, que consiste en enzima inmovilizada sobre un
soporte insoluble. Se preparan mezclas de reacción de tres fases
mediante el procedimiento descrito para una mezcla de reacción de
dos fases, excepto que se usa una enzima inmovilizada sobre un
soporte insoluble en lugar de una enzima no inmovilizada.
Opcionalmente, la enzima puede ser inmovilizada
en una matriz polímera o un soporte insoluble. Los catalizadores
enzimáticos inmovilizados pueden usarse repetidamente y en
procedimientos continuos, y pueden ser separados de los productos
del procedimiento enzimático más fácilmente que los catalizadores
enzimáticos no inmovilizados. Los métodos para la inmovilización de
enzimas en una matriz polímera, tal como alginato cálcico o
poliacrilamida, o un soporte insoluble, tal como Celite, son bien
conocidos por los expertos en la técnica. NIT-102
C2 (BioCatalytics Inc., Pasadena, CA), que es una enzima nitrilasa
inmovilizada sobre un soporte insoluble, es particularmente útil
para la conversión de II en III, ya que puede utilizarse
repetidamente en procedimientos discontinuos o continuos. La
concentración de NIT-102 C2 usada en una reacción
está elegida para obtener una velocidad de reacción deseada, y
depende de la actividad específica del catalizador y de la
concentración del sustrato. Típicamente, se usa
NIT-102 C2 en el intervalo desde aproximadamente
0,001 g hasta 0,3 g de peso húmedo por ml de volumen de reacción,
con un intervalo preferido desde 0,01 hasta 0,15 g de peso húmedo
por ml de volumen de reacción.
Adicionalmente, varios lisados liofilizados
preparados a partir de células microbianas, y designados como
NIT-101, NIT-102,
NIT-103 (BioCatalytics Inc., Pasadena, CA), y
nitrilasa de Arabidopsis thaliana (Jülich Fine Chemicals,
Jülich, Alemania), son útiles también para la conversión de II en
III. El contacto de NIT-101,
NIT-102, NIT-103 y nitrilasa de
A. thaliana con I, en una mezcla de reacción acuosa, da como
resultado la formación de II. Las reacciones en las que se usa
NIT-101, NIT-102,
NIT-103 y nitrilasa de Arabidopsis thaliana,
pueden llevarse a cabo en mezclas de reacción de dos fases, usando
concentraciones de catalizador que varían desde
0,001-0,04 g de peso seco por ml de volumen de
reacción, con un intervalo preferido de 0,002-0,02
g de peso seco por ml de volumen de reacción.
\newpage
La temperatura de la reacción de hidrólisis se
elige para optimizar tanto la velocidad de reacción como la
estabilidad de la actividad del catalizador enzimático. La
temperatura de la reacción puede variar desde justo por encima del
punto de congelación de la suspensión (aproximadamente 0ºC) hasta
60ºC, con un intervalo preferido de temperatura de reacción desde
5ºC hasta 35ºC.
La recuperación del isómero (3S) del compuesto
de fórmula I y la recuperación del isómero (3R) inalterado del
compuesto de fórmula II pueden llevarse a cabo usando técnicas
adecuadas de separación, aislamiento y purificación, bien conocidas
por los expertos en la técnicas.
En un método preferido de recuperación, el
isómero (3R) inalterado del compuesto de fórmula II se separa de la
mezcla de reacción acuosa básica mediante extracción con un
disolvente orgánico, tal como acetato de etilo. La sal de ácido del
isómero (3S) del compuesto de fórmula I se disuelve preferentemente
en la capa acuosa, y se aísla posteriormente por acidificación y
extracción con un disolvente orgánico, tal como acetato de
etilo.
El compuesto de fórmula I puede usarse para
sintetizar compuestos, tales como pregabalina, que tienen utilidad
en el tratamiento de trastornos tales como epilepsia,
convulsiones, ansiedad, dolor, y trastornos neurogenerativos, que
incluyen enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington y enfermedad
de Parkinson.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de cianoacetato de etilo (733 g, 6,48
moles), isovaleraldehído (613,9 g, 7,13 moles), piperidina (5,5 g,
0,065 moles), y hexano (0,5 l) se puso a reflujo con retirada
continua del agua. Cuando no se recogió más agua, la mezcla de
reacción se enfrió y se destiló a vacío para retirar el disolvente.
Se añadió isopropanol (1 l) al aceite que quedaba, seguido por una
disolución de cianuro potásico (422 g, 6,48 moles) en agua (2 l).
La mezcla de reacción se mantuvo por debajo de 35ºC durante la
adición del cianuro potásico, y luego se mantuvo a aproximadamente
35ºC durante 4 h. La mezcla de reacción se destiló a presión
atmosférica hasta que se alcanzó una temperatura de 95ºC, y luego
se refluyó a esta temperatura durante 5 h. La mezcla de reacción se
enfrió, se diluyó con agua (0,5 l), y se extrajo con 1 l de
metil-tert-butil-éter (MTBE). El
extracto de MTBE se lavó con agua (0,5 l), se secó sobre sulfato
magnésico anhidro, se filtró, y se concentró a vacío para
proporcionar 873,4 g de
2-isobutil-succinonitrilo como un
aceite. Pueden obtenerse muestras purificadas de
2-isobutil-succinonitrilo por
destilación a vacío (90ºC a 0,275 mm de Hg).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta
0,93-0,99 (m, 6H), 1,43-1,50 (m,
1H), 1,71-1,78 (m, 1H), 1,81-1,91
(m, 1H), 2,69 (d, 2H, J= 6,5 Hz), 2,90-2,97 (m,
1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Tres frasquitos de vidrio con tapa roscada de 8
ml se cargaron cada uno con
2-isobutil-succinonitrilo (20 mg), 1
ml de tampón de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, ditiotreitol (DTT)
2 mM), y 10 mg de una enzima nitrilasa seleccionada de
NIT-101, NIT-102, o
NIT-103 (BioCatalytics Inc., Pasadena, CA). Un
frasquito de vidrio con tapa roscada de 8 ml se cargó con
2-isobutil-succinonitrilo (20 mg) y
1 ml de una disolución de nitrilasa de Arabidopsis thaliana
en tampón de fosfato 50 mM (pH 7,8) que contenía ácido
etilendiamin-tetraacético (EDTA) 100 mM y DTT 2 mM
(Jülich Fine Chemicals, Jülich, Alemania). Las cuatro mezclas de
reacción se agitaron con barras agitadoras magnéticas durante 15 h
a 30ºC, y luego se extrajeron individualmente con acetato de etilo
(2 x 6 ml). Después de retirar los extractos de acetato de etilo,
las partes acuosas se trataron con HC1 4 N (0,15 ml) y se
extrajeron con acetato de etilo (3 x 6 ml). Los extractos de
acetato de etilo de las partes acuosas acidificadas se concentraron
a vacío para proporcionar 7,8 mg (34,2% de rendimiento), 8,8 mg
(38,6% de rendimiento), 8,1 mg (35,5% de rendimiento), y 4,0 mg
(17,5% de rendimiento) de ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
((S)-CMHA), respectivamente, para las
reacciones llevadas a cabo con NIT-101,
NIT-102, NIT-103, y nitrilasa de
A. thaliana. Las muestras de ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
de cada una de las reacciones se trataron con un exceso de
(trimetilsilil)-diazometano, para proporcionar sus
derivados de éster metílico, y se analizaron mediante cromatografía
de gases (CG) en una columna Chiraldex^{TM} G-TA
(30 m x 0,25 mm de DI, grosor de película de 125 micrómetros) para
determinar las purezas enantioméricas. Las purezas enantioméricas
de los productos de reacción de NIT-101,
NIT-102, NIT-103, y nitrilasa de
A. thaliana fueron 96,3%, 91,1%, 95,5%, y 98,5% de e.e.,
respectivamente (e.e. quiere decir "exceso enantiomérico").
\vskip1.000000\baselineskip
Un recipiente de reacción de 125 ml con camisa
exterior mantenido a 30ºC se cargó con
2-isobutil-succinonitrilo (3,33 g),
NIT-102 (0,5 g) y 122 ml de tampón de fosfato
potásico 50 mM (pH 7,5) que contenía DTT 5 mM y EDTA 1 mM (tampón
de reacción). Después de agitarse durante 12,5 h, la mezcla de
productos se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 ml). Los
extractos de acetato de etilo se retiraron, y la parte acuosa se
ajustó a pH 2,5 con HCl 4 M, y se extrajo con acetato de etilo (3 x
50 ml). Los extractos de acetato de etilo de la parte acuosa
acidificada se combinaron, se secaron con MgSO_{4} anhidro, se
filtraron, y se concentraron a vacío para proporcionar 1,56 g de
(S)-CMHA (41,1%). Una muestra del producto de
reacción se trató con (trimetilsilil)-diazometano,
y se analizó mediante CG como se describe en el ejemplo 2, para
revelar una pureza enantiomérica de 98,5% de e.e.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta
0,93-0,97 (m, 6H), 1,30-1,37 (m,
1H), 1,61-1,68 (m, 1H), 1,82-1,89
(m, 1H), 2,57-2,63 (m, 1H),
2,72-2,78 (m, 1H), 2,98-3,06 (m,
1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos recipientes de reacción de 125 ml con camisa
exterior mantenidos a 30ºC se cargaron cada uno con
2-isobutil-succinonitrilo (6,81 g),
NIT-102 C2 (1,70 g) y 118,2 ml de tampón de
reacción. Después de agitarse durante 24 h, las mezclas de
productos se decantaron, dejando el catalizador enzimático en los
recipientes de reacción. Se añadió tampón de reacción (20 ml) a
cada recipiente de reacción, se agitó durante aproximadamente 2
min., y luego se decantó y se añadió a las mezclas de productos.
Las reacciones se repitieron añadiendo
2-isobutil-succinonitrilo (6,81 g) y
tampón de reacción (118,2 ml) a cada recipiente de reacción, y
agitando las mezclas de reacción durante 24 h. Después de
completarse cuatro reacciones en cada recipiente (un total de ocho
reacciones discontinuas), las mezclas de productos se combinaron y
se extrajeron con MTBE (3 x 500 ml). Los extractos de MTBE se
retiraron, y la parte acuosa se ajustó a pH 2,1 con ácido
fosfórico, y se extrajo con MTBE (2 x 500 ml). El extracto de MTBE
de la parte acuosa acidificada se concentró a vacío, para
proporcionar un aceite, que se trató con agua (100 ml) y KOH (8,5
g). La disolución resultante se concentró a vacío para proporcionar
24,2 g (31,3%) de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
potásico. Se preparó
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
de metilo a partir de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
potásico, y se analizó mediante CG quiral, para revelar una pureza
enantiomérica de 99,1% de e.e.
^{1}H RMN (D_{2}O, 400 MHz): \delta
0,75-0,78 (m, 6H), 1,18-1,25 (m,
1H), 1,43-1,50 (m, 1H), 1,53-1,68
(m, 1H), 2,28-2,38 (d, 2H, J= 6,5 Hz),
2,86-2,93 (m, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Un recipiente de reacción de 125 ml con camisa
exterior mantenido a 30ºC se cargó con
2-isobutil-succinonitrilo (6,53 g),
NIT-102 C2 (2,61 g), y 120 g de tampón de reacción,
y se purgó con nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 24
h y luego se decantó en un frasco de vidrio de 250 ml, dejando el
catalizador en el recipiente de reacción. La reacción se repitió
recargando el recipiente de reacción que contenía el catalizador
usado con 2-isobutil-succinonitrilo
(6,53 g) y 120 g de tampón de reacción, purgando con nitrógeno, y
agitando la mezcla resultante durante 24 h. Las muestras de
reacción (0,1 ml) se mezclaron con 0,4 ml de agua:metanol:ácido
trifluoroacético (60:40:0,09, v/v/v), y se analizaron mediante HPLC
en una columna Symmetry^{TM} C8 (150 x 3,9 mm), mantenida a 30ºC.
La columna se eluyó con agua:metanol:ácido trifluoroacético
(60:40:0,09, v/v/v), y la detección se llevó a cabo con un detector
de índice de refracción.
Se llevaron a cabo un total de cincuenta
reacciones discontinuas con reciclado del catalizador. Se
combinaron las mezclas de productos de dos reacciones discontinuas
consecutivas, y se extrajeron con acetato de etilo (2 x 150 ml). La
parte acuosa se ajustó luego a pH 2 con HCl 4 M, y se extrajo con
acetato de etilo (2 x 150 ml). Los extractos de acetato de etilo de
la parte acuosa acidificada se combinaron, se secaron sobre sulfato
magnésico anhidro, se filtraron, y se concentraron a vacío, para
proporcionar (S)-CMHA. Se obtuvieron un total
de 160,8 g (43,2% de rendimiento) de
(S)-CMHA de las cincuenta reacciones
discontinuas. Las velocidades iniciales para las reacciones uno,
veintiséis, y cincuenta, fueron 14,8, 17,4, y 15,1 mM de
(S)-CMHA/h, respectivamente. El análisis
mediante CG quiral del derivado de éster metílico del
(S)-CMHA aislado de las reacciones
discontinuas 39 a 50 reveló una pureza enantiomérica media de 99,0%
de e.e.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una serie de reacciones
discontinuas para la conversión de
2-isobutil-succinonitrilo en
(S)-CMHA, usando NIT-102 C2
como se describe en el ejemplo 5, excepto que las reacciones se
llevaron a cabo bajo atmósfera ambiente en lugar de bajo atmósfera
de nitrógeno. Las muestras de reacción se analizaron mediante HPLC
como se describe en el ejemplo 5.
Se llevaron a cabo un total de cincuenta
reacciones discontinuas, con reciclado de catalizador, bajo
atmósfera ambiente. Las velocidades iniciales de reacción
determinadas a partir de las muestras de reacción, tomadas a las
cuatro horas fueron 14,2, 13,2 y 9,3 mM
de(S)-CMHA/h para las reacciones una,
veintiséis, y cincuenta, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de productos de la conversión de
2-isobutil-succinonitrilo en
(S)-CMHA (ejemplo 6, reacciones
37-44), se combinaron y se extrajeron con acetato de
etilo (2 x 250 ml). Los extractos de acetato de etilo se secaron
sobre sulfato magnésico anhidro, se filtraron y se concentraron a
vacío, para proporcionar un aceite (32,5 g, 62,2% de rendimiento),
que fue en su mayor parte
(R)-2-isobutil-succinonitrilo.
La parte acuosa se ajustó a pH 2 con HCl 4 M, y se extrajo con
acetato de etilo (2 x 250 ml). Los extractos de acetato de etilo se
concentraron hasta un volumen de 470 ml, y luego se agitaron
mientras se añadía gota a gota terc-butilamina (15,9 ml,
151,5 mmoles). La sal cristalina blanca que se formó se recogió por
filtración, y se secó al aire durante la noche para proporcionar
30,0 g de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
de t-butilamonio. Se preparó
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
de metilo a partir de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
de t-butilamonio, y se analizó mediante CG quiral, para
revelar una pureza enantiomérica de 99,5% de e.e.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta
0,90-0,94 (m, 6H), 1,26-1,32 (m,
10H), 1,54-1,61 (m, 1H), 1,78-1,88
(m, 1H), 2,30-2,35 (m, 1H),
2,43-2,50 (m, 1H), 2,96-3,04 (m,
1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
potásico (20 g, 103,5 inmoles), agua (50 ml), KOH al 45% (12 g),
isopropanol (12 g), y níquel Raney se agitaron durante la noche en
un agitador Parr bajo 344,7 kPa (50 psi) de hidrógeno. La mezcla de
reacción se filtró, se calentó a aproximadamente 50ºC, se trató con
ácido acético (6,5 ml), y se agitó durante la noche a temperatura
ambiente. Luego, la mezcla se ajustó a un pH ligeramente superior a
7 con KOH al 45%, y se concentró a vacío para retirar la mayor
parte del isopropanol. Se añadió isopropanol (20 ml) a la mezcla,
que se acidificó luego con ácido acético, se agitó durante la noche
a temperatura ambiente, y se filtró para proporcionar 4,3 g de
ácido
(S)-3-aminometil-5-metilhexanoico
como un sólido cristalino blanco. Se determinó que la pureza
enantiomérica era 100% de e.e. preparando un derivado de ácido
(S)-3-aminometil-5-metilhexanoico,
usando reactivo de Marfey
(N\alpha-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alaninamida)
y analizando mediante HPLC en una columna BDS Hypersil C18 (250 x
4,6 mm, 5 \mu), eluida con acetonitrilo:trietilamina al 1% (pH 3)
(38:62, v/v).
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de
(S)-3-ciano-5-metilhexanoato
de t-butilamonio (26 g, 113,9 mmoles), agua (48,8 ml), etanol
(35,8 ml), KOH (7,2 g, 91% en escamas), y Sponge Niquel^{TM}
(A-7000, humedad de 16,3 g de agua, Activated Metals
& Chemicals, Inc., Sevierville, TN) se agitó durante la noche
en un agitador Parr bajo 344,7 kPa (50 psi) de hidrógeno. La mezcla
de reacción se filtró (Celite), y el sólido se lavó con agua (10
ml) y etanol (5 ml). Se añadió ácido acético (9,4 ml) a las aguas
de filtrado, y la mezcla resultante se agitó durante la noche a
4ºC. El producto se filtró, se lavó con 10 ml de alcohol
isopropílico, y se secó a vacío para proporcionar 11,1 g (61%) de
un sólido blanco. Una porción de este material (10,0 g) se
cristalizó en una mezcla 1:1 de alcohol isopropílico y agua, para
proporcionar 8,8 g de ácido
(S)-3-aminometil-5-metilhexanoico
con 100% de e.e.
\vskip1.000000\baselineskip
La racemización de
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
se llevó a cabo sobre material recuperado de la bioconversión de
2-isobutil-succinonitrilo racémico
con NIT-102 C2. Una mezcla de
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
(1,36 g, 10 mmoles, 69% de e.e.), tolueno (5 ml), y
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU, 0,076 g, 5 mmoles) se refluyó durante 2 h. Se añadió agua (10
ml) a la mezcla de reacción, y la mezcla resultante se extrajo con
acetato de etilo (2 x 10 ml). Los extractos orgánicos combinados se
lavaron sucesivamente con HCl al 5% (20 ml) y cloruro sódico
acuoso saturado (20 ml), se secaron sobre sulfato magnésico anhidro,
se filtraron, y se concentraron a vacío para proporcionar
2-isobutil-succinonitrilo racémico
(1,14 g, 84%). La pureza enantiomérica se determinó mediante CG
usando una columna Chiraldex^{TM} G-TA (30 m x
0,25 mm de DI, grosor de película de 125 micrómetros).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó resina de Amberlite®
IRA-400 (1 g de peso húmedo, Rohm & Haas,
Philadelphia, PA) con NaOH al 5% (10 ml) durante 10 minutos, y se
lavó con agua hasta que las aguas de lavado fueron neutras. Se
añadieron etanol (25 ml) y
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
(69% de e.e.) a la resina, y la mezcla resultante se refluyó
durante 2 h. La mezcla de reacción se filtró y se concentró a
vacío. El residuo se extrajo con acetato de etilo (25 ml) y se lavó
con agua (3 x 100 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato
magnésico anhidro, se filtró, y se concentró a vacío para
proporcionar
2-isobutil-succinonitrilo racémico
(0,81 g, 81%).
Claims (8)
1. Un método para preparar ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico,
que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto
2-isobutil-succinonitrilo racémico
en un medio de reacción con un catalizador enzimático que tenga
actividad nitrilasa; y
(b) recuperar el ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
del medio de reacción; y, opcionalmente, recuperar
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado recuperado de la etapa (b), es racemizado en
2-isobutil-succinonitrilo racémico
calentando con una base en un disolvente.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
la etapa (a) se repite usando el
2-isobutil-succinonitrilo racémico
racemizado del
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado recuperado de la etapa (b).
4. Un procedimiento para preparar ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina), que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto
2-isobutil-succinonitrilo en un
medio de reacción con un catalizador enzimático que tenga actividad
nitrilasa;
(b) recuperar ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
del medio de reacción;
(c) convertir ácido
(S)-3-ciano-5-metilhexanoico
en una sal de ácido; y
(d) hidrogenar la sal de ácido para formar ácido
(S)-3-(aminometil)-5-metilhexanoico
(pregabalina).
5. El procedimiento conforme a la reivindicación
4, en el que el
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado se recupera del medio de reacción de la etapa (a).
6. El procedimiento conforme a la reivindicación
5, en el que dicho
(R)-2-isobutil-succinonitrilo
inalterado de la etapa (a) es racemizado calentando con una base en
un disolvente orgánico, para formar
2-isobutil-succinonitrilo racémico,
y la etapa (a) se repite usando dicho
2-isobutil-succinonitrilo
racémico.
7. El procedimiento conforme a la
reivindicación 4, en el que dicho catalizador enzimático es una
nitrilasa en forma de células microbianas enteras, células
microbianas permeabilizadas, extractos de células microbianas,
enzimas parcialmente purificadas, enzimas purificadas, o un
catalizador enzimático inmovilizado sobre un soporte.
8. El procedimiento conforme a la
reivindicación 4, en el que dicho catalizador enzimático se
selecciona del grupo que consiste en NIT-101,
NIT-102, NIT-103 y nitrilasa de
Arabidopsis thaliana.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US56213304P | 2004-04-14 | 2004-04-14 | |
| US562133P | 2004-04-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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ID=34962755
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