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Optisch aktive a-Hydroxycarbonsäuren finden beispielsweise als Zusatzstoffe zu Futtermitteln oder bei der Gewinnung pharmazeutischer Wirkstoffe, Vitamine und Flüssigkristalle Verwendung.
Diese optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren lassen sich weiters beispielsweise nach Effen- berger et al., Angew. Chem. 95 (1983) Nr. 1, Seite 50, vorteilhaft in anderweitig nur sehr schwer herzustellende N-substituierte optisch aktive a-Aminosäuren überführen.
Chirale a-Hydroxycarbonsäuren sind heutzutage chemisch, fermentativ oder enzymatisch zu- gänglich.
Aus der Literatur ist deshalb eine Reihe verschiedener Synthesemöglichkeiten von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren bekannt.
So können racemische Cyanhydrine unter Zusatz geeigneter Mikroorganismen zu den ge- wünschten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren hydrolysiert werden.
Die Herstellung von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, speziell die Herstellung von optisch akti- ver Milchsäure oder Mandelsäure aus racemischen Cyanhydrinen mit verschiedenen Mikroorga- nismen der Gattungen Alicaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Candida u. s.w. ist beispielsweise in EP 0 449 684, EP 0 527 553, EP 0 610 048, u. s.w. beschrieben.
Aus diesem Stand der Technik ist es auch bekannt, dass wenn ein racemisches Cyanhydrin enzymatisch unter Verwendung einer Nitrilase zu der korrespondierenden a-Hydroxycarbonsäure hydrolysiert wird, das Problem auftritt, dass das Enzym innerhalb kurzer Zeit inaktiviert wird und so die gewünschte a-Hydroxycarbonsäure meist nur in geringen Ausbeuten und Konzentrationen erhalten wird. Dies gilt auch bei der Verwendung von Nitrilhydratasen, die das Cyanhydrin zu dem korrespondierenden a-Hydroxyamid umwandeln. Die Hydroxyamide können sodann wiederum zu den korrespondierenden a-Hydroxycarbonsäuren umgesetzt werden.
Es ist auch bekannt, beispielsweise aus Angew. Chem. 1994,106, Seite1615f., dass sich op- tisch aktive Cyanhydrine ohne Racemisierung mit konzentrierter Salzsäure zu den korrespondie- renden chiralen a-Hydroxycarbonsäuren hydrolysieren lassen. Die optische Reinheit der so herge- stellten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren entspricht dabei der optischen Reinheit des eingesetzten chiralen Cyanhydrins, auch wenn dieses in-situ durch enzymkatalysierte Addition einer Cyanid- gruppe an einen entsprechenden Aldehyd oder ein Keton erhalten und ohne Isolierung bzw. Auf- reinigung weiterverarbeitet wird.
Nachteilig bei dieser Reaktion ist, dass empfindliche Substrate zersetzt werden und das Auftre- ten von Korrosion.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, bei welchem so polare Nitrile wie chirale Cyanhydrine mit einer milden und effizienten Methode in die korrespondierenden chiralen Hydroxycarbonsäuren überführt werden können, wobei die Hydroxycarbonsäuren in etwa die gleiche enantiomere Reinheit wie die Cyanhydrine aufweisen.
Unerwarteterweise konnte diese Aufgabe durch die Verwendung eines speziellen Bakteriums aus der Gattung Rhodococcus gelöst werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von chira- len a-Hydroxycarbonsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass (R)- oder (S)-Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R)- oder (S)-a-Hydroxycarbonsäuren überführt werden.
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Hydroxycarbonsäuren mit einer optischen Reinheit von bis zu > 99%ee überführt.
Als Ausgangsverbindungen dienen (R)- und (S)- Cyanhydrine, die durch enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entsprechenden Aldehyde oder Ketone hergestellt werden.
Die enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entspre- chenden Aldehyde oder Ketone kann dabei analog dem Stand der Technik, beispielsweise analog EP 0 951 561, EP 0 927 766, EP 0 632 130, EP 0547 655, EP 0 326 063 u.s.w., erfolgen.
Als Ausgangsverbindungen eignen sich die im Stand der Technik zitierten Aldehyde und Ketone.
Beispiele für geeignete Aldehyde sind dabei aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Aldehyde. Unter aliphatischen Aldehyden sind dabei gesättigte oder ungesättigte aliphatische, geradkettige, verzweigte oder cyclische Aldehyde zu verstehen. Bevorzugte aliphatische Aldehyde sind geradkettige Aldehyde mit insbesondere 2 bis 18 C-Atomen, besonders bevorzugt von 2 bis
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12, die gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sind. Der Aldehyd kann dabei sowohl C-C- Doppelbindungen als auch C-C-Dreifachbindungen aufweisen.
Der Aldehyd kann unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen, wie Phenyl- oder Indolylgruppen,
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atome aus der Gruppe 0, S, P, oder N aufweisen können, Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Car- bonsäure-, Carbonsäureester-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein.
Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Aldehyde sind Benzaldezyd bzw. verschie- den substituierte Benzaldehyde wie etwa 2-Chlorbenzaldehyd, 3,4-Difluorbenzaldehyd, 4- Methylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd, 4-Fluor-3-phenoxybenzaldehyd, weiters Furfural, Anthracen-9-carbaldehyd, Furan-3-carbaldehyd, Indol-3-carbaldehyd, Naphthalin-1-carbaldehyd, Phthaldialdehyd, Pyrazol-3-carbaldehyd, Pyrrol-2-carbaldehyd, Thiophen-2-carbaldehyd, Isophtha- laldehyd oder Pyridinaldehyde u. s.w..
Beispiele für Ketone sind aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Ketone, bei denen das Carbonylkohlenstoffatom ungleich substituiert ist. Unter aliphatischen Ketonen sind geradketti- ge, verzweigte oder cyclische Ketone zu verstehen. Die Ketone können gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein. Sie können unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen wie Phenyl- oder Indolylgruppen, durch Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein.
Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Ketone sind Acetophenon, Indolylaceton u.s.w..
Bevorzugt werden (R) - oder (S)-Cyanhydrine der Formel
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in der R1 und R2 unabhängig voneinander H, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter
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einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituen- ten substituierten Phenylrest bedeuten, mit der Massgabe, dass R1 und R2 nicht beide H sind.
Bevorzugte unter den Reaktionsbedingungen inerte Substituenten sind beispielsweise Haloge-
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substituiertes Phenyl und Phenyloxy.
Besonders bevorzugt eignen sich für das erfindungsgemässe Verfahren (R)- oder (S)- Cyanhydrine, wie etwa (R)- oder (S)-2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril, (R)- oder (S)-2- Chlormandelonitril, (R)- oder (S)-Mandelonitril, (R)- oder (S)-4-Methylmandelonitril, (R)- oder (S)-3- Phenoxymandelonitril, (R)- oder (S)-2-Hydroxy-2-methyl-heptannitril, (R) - oder (S)-2-Hydroxy-2- phenyl-propionitril, (R)- oder (S)-2-Hydroxy-3-pentennitril, (R)- oder (S)-1-Hydroxy-cyclohexannitril, (R) - oder (S)-Acetophenoncynahydrin.
Das entsprechende (R)- oder (S)- Cyanhydrin wird sodann erfindungsgemäss enzymatisch hydrolysiert.
Die enzymatische Hydrolyse erfolgt erfindungsgemäss in Anwesenheit von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540.
Mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wurde unerwarteterweise ein Mikroorganismus gefunden, der sich dadurch auszeichnet, dass er über ein Nitrilhydratase/Amidase-Enzymsystem verfügt, das die Nitrilfunktion von derart polaren Nitrilen, wie die oben angeführten Cyanhydrine hydrolysieren kann.
Durch das Nitrilhydratase/Amidase-Enzymsystem von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden die chiralen Cyanhydrine im ersten Schritt durch die Nitrilhydratase in das korrespondie- rende chirale Hydroxyamid hydrolysiert, welches sodann in einem zweiten Hydrolyseschritt durch die Amidase in die entsprechende chirale a-Hydroxycarbonsäure überführt wird.
Der Mikroorganismus kann bei dem erfindungsgemässen Verfahren in jeglicher Form, bei- spielsweise in Form von gemahlenen Zellen, rohen oder gereinigten Enzymen, rekombinanten
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Enzymen, immobilisierten Zellen oder Enzymen, lyophilisierten Zellen oder von "resting cells", d. h. von ruhenden Zellen, die nicht mehr wachsen, da sie in der Nährstoffversorgung limitiert sind, eingesetzt werden.
Bevorzugt werden rekombinante Enzyme, resting cells oder lyophilisierte Zellen, besonders bevorzugt rekombinante Enzyme oder resting cells verwendet.
Neben dem direkten Einsatz der Nitrilhydratase/Amidase-aktiven Präparationen von Rhodo- coccus erythropolis NCIMB 11540 Zellen stellt die Verwendung von rekombinanten, in einem geeigneten Mikroorganismus, wie etwa E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces, Asperagillus, K Lactis u.s.w. exprimierten Präparationen eine gute Alternative dar. Dabei werden die entsprechen- den Gene mit Hilfe von Plasmidkonstrukten in geeignete Wirtszellen, beispielsweise in E. coli-, Pichia pastoris-, Saccharomyces-, Asperagillus-, K. Lactis- Wirtszellen eingebracht. Durch Wahl eines induzierbaren Promoters können sowohl die Nitrilhydratase als auch die Amidase in aktiver Form überexprimiert werden. Im Falle der Amidase können hierbei weit höhere Aktivitätsniveaus erreicht werden als bei entsprechender Fermentation der Rhodococcus Zellen.
Der Mikroorganismus wird sodann in der gewünschten Form in einem wässrigen Medium, wie Wasser oder einer Pufferlösung, suspendiert. Geeignete Pufferlösungen sind beispielsweise Phos- phatpuffer, wie etwa K/Na-Phosphatpuffer, PBS-Puffer, Butyratpuffer, Citratlösungen u. s.w..
Der pH-Wert der verwendeten Pufferlösung sollte dabei in einem Bereich von pH 4. 5 bis pH 11, bevorzugt von 5. 5 bis 8.5 liegen.
Anschliessend wird die so erhaltene Suspension mit dem entsprechenden chiralen Cyanhydrin versetzt. Da es sich bei den chiralen Cyanhydrinen um lipophile Verbindungen mit beschränkter Wasserlöslichkeit handelt, ist die Verwendung eines Lösungsvermittlers als Cosolvens notwendig, um die Cyanhydrine im wässrigen Medium in Lösung zu bringen.
Als Lösungsvermittler eignen sich beispielsweise organischen Lösungsmittel, Tenside, Phasen- transferkatalysatoren, u. s.w..
Organische Lösungsmittel, die sich für das erfindungsgemässe Verfahren als Cosolvens eignen sind solche, die erstens das Substrat ausreichend lösen und zweitens die Enzymaktivität so wenig wie möglich beeinträchtigen.
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etwa Methanol, Ethanol, i-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, t-Butanol oder 1-Pentanol, Toluol oder t.-Butylmethylether (TBME) oder Gemische derselben. Bevorzugt werden als Cosolvens DMSO, DMF, Ethanol, i-Propanol oder Gemische derselben und besonders bevorzugt DMSO und DMF eingesetzt.
Der Cosolvensanteil sollte zwischen 0,5 und 20 Vol.%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Reaktionslösung liegen.
Bevorzugt liegt der Cosolvensanteil zwischen 1 und 15 Vol% und besonders bevorzugt zwischen 2 und 10 Vol%.
Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung sollte bei dem erfindungsgemässen Verfah-
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sung) liegen, wobei die Akzeptanz einer ausreichend hohen Substratkonzentration die Grundvor- aussetzung für die Anwendung der erfindungsgemässen enzymatischen Hydrolyse im präparativen Massstab ist.
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Die mögliche umsetzbare Substratkonzentration hängt von der eingesetzten Enzymmenge ab.
Für eine effiziente, quantitative Umsetzung muss der erste Hydrolyseschritt sehr rasch erfolgen, um den Zerfall des Cyanhydrins und die dadurch bedingte Racemisierung zu vermeiden, sodass relativ hohe Zelldichten erforderlich sind.
Es ist dabei zu beachten, dass eine ausreichende Durchmischung des Reaktionssystems ge- währleistet ist.
Die Zell- bzw. Enzymmenge hängt von der Aktivität des Mikroorganismus in der eingesetzten Form, sowie von der Substratkonzentration und dem Cosolvens ab.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches sollte zwischen 4. 5 und 11, bevorzugt zwischen 5,5 und 8 liegen.
Gegebenenfalls kann dem Reaktionsgemisch zur Einstellung des pH-Wertes noch eine geeig- nete Säure bzw. saure Salze, wie etwa Phosphorsäure, Borsäure, Citronensäure, u.s.w. zugesetzt
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werden.
Die erfindungsgemässe enzymatische Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 10 bis 60 C, bevorzugt bei 15 bis 50 C und besonders bevorzugt bei 20 bis 45 C durchgeführt.
Nach erfolgter Hydrolyse zu den gewünschten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, erfolgt deren Isolierung aus dem Reaktionsgemisch mittels einer bekannten Technik, wie etwa Abzentrifugieren der Zellen, Extraktion des Produktes nach Ansäuern mit HCI (z. B.: pH 2) und gegebenenfalls weitere Aufreinigung durch Aktivkohlefiltration und Umkristallisation.
Durch die erfindungsgemässe Verwendung von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden somit so polare Nitrile, wie chirale Cyanhydrine auf einfache und effiziente Weise unter milden Bedingungen in die korrespondierenden chiralen a-Hydroxycarbonsäuren überführt, wobei keinerlei Racemisierung auftritt. Die gewünschten a-Hydroxycarbonsäuren werden dabei, in Abhängigkeit vom ee-Wert des eingesetzten Cyanhydrins, in hoher optischer Reinheit von bis zu über 99% und in hohen Ausbeuten von bis zu über 98% erhalten.
Beispiel 1: Herstellung des Biokatalysators
Für die Herstellung der Biomasse von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wurde ein komplexes Standardmedium (Medium A, s. Tab. 1) verwendet. Die Stammhaltung erfolgte auf Agar-
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mit Parafilm verschlossen und im Kühlschrank bei 4 C gelagert.
Das Wachstum der Flüssigkulturen erfolgte in 1000ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 250m1 Medium A bei 30 C und 130rpm.
Variante I (ohne Vorkultur): Etwa die Hälfte der Biomasse einer Agarplatte wurde in 5ml steri- ler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellsuspension wurde 250m1 Kulturmedi- um zugesetzt.
Variante ll (mit Vorkultur): Für die Vorkultur wurde etwas Biomasse einer Agarplatte in 5ml ste- riler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellesuspension wurde 100ml Kultur- medium zugesetzt (= Vorkultur). Nach 20-24h Wachstum wurden 5ml dieser Vorkultur je 250mL Kulturmedium zugesetzt.
Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation bei ca. 3000rpm für 30min bei 0-4 C. Die Zellen wurden einmal mit K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6. 5) gewaschen. Dann wurden die Zellen in frischem Puffer resuspendiert und entweder nach Schockfrieren lyophilisiert (Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen, Beispiel 2), oder diese Zellsuspension (ca. 6-8% des Kulturvolumens) wurde direkt für die biokatalytischen Umsetzungen verwendet (Umsetzungen mit Resting cells, Beispiel 3).
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EMI4.3
<tb> Sterilisationsgruppe <SEP> Substanz <SEP> Konzentration <SEP> [g/l]
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Na2HP04 <SEP> 4.
<SEP> 97
<tb>
<tb>
<tb> KH2P04 <SEP> 2.04
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ll <SEP> MgS04.7H20 <SEP> 0.2
<tb>
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<tb> Spurenlösung <SEP> SL-6 <SEP> 1 <SEP> ml/l
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lV <SEP> Hefeextrakt <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fleischpepton <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> V <SEP> Glucose <SEP> 10
<tb>
Beispiel 2 : Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen im analytischen Massstab 31. 6mg, 52. 6mg bzw. 105.2mg lyophilisierte Zellen wurden in 10ml Phosphatpuffer (50mM,
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den in 1.5m1 Eppendorf-Reaktionsgefässe überführt und mit 25 l einer ca. 200mM Substratlösung von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril in DMSO versetzt (3mg, 5mg bzw. 10mg Zellen/ml, S. -Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umsetzung wurde im Thermomixer bei 30 C und 1000rpm durchgeführt.
Nach 0,2, 4,6, 8, 10; 15,20, 30,60 und 120 Minuten wurde jeweils ein EppendorfReaktionsgefäss mit 0.5m1 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cyanhydrin, Hydroxyamid und Hydroxysäure mittels HPLC bestimmt.
Tabelle 2 Hydrolyse von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril durch lyophilisierte Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Zellen (10mg Zellen/ml; Substratkonz.: 10mM) Konzentration (mM) von Substrat, Hydroxyamid und Hydroxycarbonsäure in Abhängigkeit von der Zeit (min)
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<tb> 0 <SEP> min <SEP> 10min <SEP> 20min <SEP> 30min <SEP> 60min <SEP> 100min <SEP> 120min
<tb>
<tb> Substrat <SEP> 10mM <SEP> 1,9mM <SEP> 0,7mM <SEP> 0,25mM <SEP> OmM <SEP> OmM <SEP> OmM
<tb>
<tb> Amid <SEP> OmM <SEP> 4,7mM <SEP> 3,5mM <SEP> 3,2mM <SEP> 2mM <SEP> 1,1mM <SEP> 0,5mM
<tb>
<tb> Säure <SEP> OmM <SEP> 3,3mM <SEP> 5,4mM <SEP> 6,1mM <SEP> 7,5mM <SEP> 8,2mM <SEP> 8,5mM
<tb>
Beispiel 3 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von Resting cells und lyophili- sierten Zellen
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte analog Beispiel 1, Variante I, 2 Kulturkolben.
Nach
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fugiert und einmal mit K/Na-P04 Puffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen. Je 2 Zellproben wurden vor Aktivitätsbestimmung lyophilisiert, die anderen beiden wurden als Resting cells verwendet.
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200mM Substratlösung in DMSO gestartet (Substrat-Konz. ca. 20mM) und bei 30 C und 130rpm
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Tab. 3 dargestellt.
Tabelle 3 : Ergebnisse der Umsetzungen von Kultur 1 (OD546 3.5), Substrat : (R)-2-Chlormandelonitril
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<tb> OH
<tb> Resting <SEP> cells <SEP> Lyophilisierte <SEP> Zellen <SEP> (19mg/mL) <SEP>
<tb>
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<tb> 30min <SEP> 100 <SEP> 2 <SEP> 40 <SEP> < 1 <SEP>
<tb>
<tb> 60min <SEP> - <SEP> 4 <SEP> 41 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17h <SEP> 42 <SEP> 43 <SEP> < 1
<tb>
1 : Der Umsatz des Cyanhydrins (CH) bezieht sich auf beide Produkte (Hydroxyamid und Hydroxysäure).
2 : Der Umsatz des Hydroxyamides (HA) bezieht sich auf die Menge an Hydroxysäure, die aus dem vorhandenen Hydroxyamid gebildet wurde.
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Beispiel 4 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von unterschiedlichen Substratkonzentrationen
Versuch 4. 1:
Bei Versuch 4. 1 wurde die Reaktion im analytischen Massstab (Reaktionsvolumen 1 ml) mit 3
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Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll, 21 Fermentations- medium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6.1). Die Zellen aus 8 mal 10ml Fermentationslösung wurden in Kulturröhrchen abzentrifugiert. Die erhaltene Zellmasse wurde einmal mit je 2ml K/Na- Phosphatpuffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen. Der Inhalt von 2 Röhrchen wurde zur Bestimmung des Trockengewichtes lyophilisiert.
Auswaage : 1. 37mg lyophilisierte Zellen / 10ml Fermentationslösung
2.30mg (Diese Menge entsprach ca. dem Einsatz an Zellen/ml bei den folgenden Umsetzungen.)
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Eppendorfers überführt. Diesen Zellsuspensionen wurden je 50 l verschieden konzentrierter Substratlösungen (3 Konzentrationen, Parallelansätze, 5% DMSO als Cosolvens) zugesetzt. Die Eppendorfers wurden am Thermomixer bei 30 C und 1000rpm geschüttelt. Zur Umsatzkontrolle
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13.000rpm) und Verdünnung wurden die Umsätze mit HPLC bestimmt.
Folgende Konzentrationen (R)-2-Chlormandelonitril wurden verwendet:
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Ein Vergleich der Ansätze a-c ist in Tabelle 4. 1 anhand der Bildung der 2-Chlormandelsäure (in %) dargestellt. Bei allen Ansätzen wurde die Hydroxysäure quantitativ gebildet. Es zeigte sich, dass auch höhere Substratkonzentrationen problemlos akzeptiert werden.
Tabelle 4.1 : Vergleich der Ansätze a-c anhand der Bildung von (R)-2-Chlormandelsäure in %
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<tb> 10min <SEP> 20min <SEP> 30min <SEP> 40min <SEP> 50min
<tb>
<tb> a <SEP> 77% <SEP> 86% <SEP> 92% <SEP> 94% <SEP> 96% <SEP>
<tb>
<tb> b <SEP> 45% <SEP> 70% <SEP> 82% <SEP> 89% <SEP> 95% <SEP>
<tb>
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Versuch 4.2:
Bei Versuch 4. 2 wurde die Reaktion mit 2 verschiedenen Substratkonzentrationen (10g/l, 20g/l) im 5ml-Massstab durchgeführt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll, 21 Fermentations-
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(Resting cells, OD546 52). Jeweils 4.75ml dieser Zellsuspension wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.
Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallelansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 250 l Substratlösung gestartet und in Kulturröhr- chen im Schüttelschrank bei 30 C und 130rpm durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle wurden jeweils
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Verdünnung wurden die Umsätze mit HPLC bestimmt. a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250uL DMSO ([S] = 60mM, 10g/L, Cosolvens:
5% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h
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waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet.
Nach 20h war die Umsetzung quantitativ. b. 100mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250uL DMSO ([S] = 120mM, 20g/l, Cosolvens:
5% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 18h waren 36% Hydroxysäure gebildet. Nach 43h waren 41% Hydroxysäure gebildet, danach fand keine weitere Umsetzung mehr statt.
Versuch 4.3:
Beim Versuch 4. 3 wurden Umsetzungen mit 10g/1 und 15g/1 (R2-Chlormandelonitril durchgeführt. Weiters wurde nach vollständigem Umsatz der ee der gebildeten Hydroxysäure bestimmt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1 Variante ll, 2.751 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 200ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 44). Jeweils 4.85m1 dieser Zellsuspension wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.
Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallelansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 150 l Substratlösung gestartet und in Kulturröhrchen im Schüttelschrank bei 40 C und 150rpm durchgeführt. Die Umsatzkontrolle erfolgte mittels HPLC. Bei vollständigem Umsatz wurde die Hydroxysäure nach Ansäuern extrahiert und der ee bestimmt. a. 50mg (R2-Chlormandelonitril, gelöst in 150 l DMSO ([S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens:
3% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). b. 75mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 150 l DMSO ([S] = 90mM, 15g/l, Cosolvens:
3% DMSO).
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren ca. 60% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee = 99%).
Beispiel 5 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung unterschiedlicher Cosolventien
Versuch 5.1:
Bei Umsetzungen im 50ml-Massstab wurde DMSO mit EtOH als Cosolvens verglichen. Es wurde 5% Cosolvens verwendet, die Substratkonzentration betrug jedoch nur 4g/1 (R)-2Chlormandelonitril.
Biomasse aus 8 mal 250m1 (abzüglich 80ml, s. Versuch 4.1) Fermentationsmedium (OD - 6.1) wurde nach 20h geerntet. Die Zellen wurden in 100m1 K/Na- Phosphatpuffer (pH 6. 5, 50mM) suspendiert. Diese Zellsuspension (OD 60) wurde für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.
Die Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in DMSO oder EtOH wurden in 100m1 Schlifferlenmeyerkolben bei 150rpm und 30 C durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC
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Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. 50mL Zellsuspension wurden mit 200mg (R2-Chlormandelonitril ( > 99%) gelöst in 2300 l
DMSO und 200 l 0.1 % H3P04, versetzt.
Substratkonzentration : 4g/L (24mM), 5% DMSO als Cosolvens
Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure: 97% b. 50mL Zellsuspension werden mit 200mg (R)-2-Chlormandelonitril ( > 99%) gelöst in 2300 l
EtOH und 200 l 0.1 % H3P04, versetzt.
Substratkonzentration : 4g/1 (24mM), 5% EtOH als Cosolvens
Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure: > 99%
Versuch 5.2:
Hier wurden die Lösungsmittel DMSO, EtOH und 'PrOH wieder mit einem Anteil von 5% ver-
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5ml-Massstab durchgeführt.
Die Herstellung des Biokatalysators Beispiel 4, Versuch 4.2 (OD546 8. 4). Jeweils 4.75m1 der Zellsuspension (Resting cells, 00546 52) wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.
Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril ( > 99%) gelöst in DMSO, EtOH und i-PrOH wurden in Kulturröhrchen bei 150rpm und 30 C durchgeführt (Parallelansätze).
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zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.
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5% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet.
Nach 20h war die Umsetzung quantitativ (Produkt-ee = 95%). b. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250 l EtOH, ([S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens:
5% EtOH)
Bereits nach 30 Minuten ist das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h sind 35% Hydroxysäure gebildet, nach 19h ist die Hydrolyse zur Hydroxysäure zu 94% abgeschlossen, nach 28h ist die Umsetzung praktisch vollständig (Produkt-ee = 97%).
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5% i-PrOH)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h waren 8% Hydroxysäure gebildet, nach 44h waren 64% Hydroxysäure gebildet (Produkt-ee = 92.3)
Beispiel 6 : Enzymatische Hydrolyse bei unterschiedlichen Temperaturen
Versuch 6.1:
Bei Versuch 6. 1 wurde der Reaktionsverlauf bei Reaktionstemperaturen von 30 C, 35 C, und 40 C verglichen.
Die Ansätze wurden im 5ml-Massstab mit einer Substratkonzentration von 10g11 (R)-2-Chlormandelonitril durchgeführt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 4, Versuch 4.2, (OD546 8.4). Jeweils 4.75m1 der Zellsuspension (Resting cells, OD546 52) wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von 50mg (R)-2-Chlormandelonitril ( > 99%) ([S] = 60mM, 10g/I), gelöst in 250 l DMSO (5%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30 C, 35 C, 40 C) in Kulturröhrchen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).
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zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach ca. 20h war die Hydrolyse zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 95%). b.
T = 35 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 65% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 96.5%). c. T = 40 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 86% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R2-Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 97.9%).
Versuch 6.2 :
Bei Versuch 6. 2 wurde die Temperatur bis auf 50 C erhöht.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 4, Versuch 4.3 (OD546 44). Jeweils 4.85m1 der Zellsuspension (Resting cells, OD546 44) wurden für die enzymatischen Umsetzungen
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verwendet. Umsetzungen von 50mg (R)-2-Chlormandelonitril ( > 99%) ([S] = 60mM, 10g/I), gelöst in 150 l DMSO (3%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30 C, 40 C, 50 C) in Kulturröhr- chen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).
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zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). b.
T = 40 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). c. T = 50 C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 92% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%).
Beispiel 7 : Umsetzungen von Cyanhydrinen von Aldehyden mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Massstab
Für alle Umsetzungen wurde K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) verwendet. Die Reaktionsverfolgung erfolgte mit HPLC. Nach Probenahme wurde zum Abstoppen der biokatalytischen Reaktion mit Probenvolumen 1 N HCI versetzt (Parallelproben). Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) wurde mit HPLC-Laufmittel verdünnt.
Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 30min bei 4 C und 3000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1 N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert.
Versuch 7.1:
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll. 31 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 5.9). Die Zellen wurden zu ca. 180m1 in Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 80).
0. 6g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%), gelöst in 1.5m1 DMSO wurden 60ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 30 C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 17 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 0. 73g (109%)
Produkt-ee : > 99%
Versuch 7.2 :
In Versuch 7. 2 wurden einige Reaktionsparameter variiert. Als Standardbedingungen galten
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durchgeführt, ein weiterer mit 10g/1 Substrat und DMF als Cosolvens.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll. 31 Fermentations- medium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6. 8). Die Zellen wurden zu ca. 190m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 69). Drei Umsetzungen wurden durchgeführt.
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Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40 C und 150rpm im Schüttelschrank durchge- führt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 0.31 g (93%)
Produkt-ee : > 99%
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Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40 C und 150rpm im Schüttelschrank durchge-
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führt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 0. 30g (90%)
Produkt-ee : 98.5%
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Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40 C und 150rpm im Schüttelschrank durchge- führt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure praktisch vollständig.
Rohausbeute : 0.45g (90%)
Produkt-ee : > 99%
Versuch 7.3:
Hier wurden 2 Ansätze mit verschieden grosser Substratkonzentration (Ansatz A 10g/l, Ansatz B 15g/l) durchgeführt. Beide Umsetzungen verliefen nahezu gleich rasch und waren nach 2 Stun- den vollständig.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll. 31 Fermentations- medium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 1. 2). Die Zellen wurden in ca. 180m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 70). Zwei Umsetzungen wurden durchgeführt.
Ansatz A: 0,8g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%), gelöst in 1.6m1 DMSO wurden der Zellsus- pension (80m1) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50 C und 150rpm im Schüttelschrank durchge- führt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 0.85g (95%)
Produkt-ee : > 99%
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pension (80m1) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50 C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 1. 26g (94%)
Produkt-ee : 98. 9%
Versuch 7.4:
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll, 2.5l Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (ODe 6. 9). Die Zellen wurden in ca. 160m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD 63).
1. 3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%), gelöst in 2.5m1 DMSO wurden 140m1 dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40 C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 3 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 1.43g (98%)
Produkt-ee : > 99%
Versuch 7.5:
Bei dieser Umsetzung wurde 1g Mandelonitril bei einer Substratkonzentration von 8g/1 zur entsprechenden Hydroxysäure hydrolysiert.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäss Beispiel 1, Variante ll, 21 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 8. 4). Die Zellen wurden in ca. 120m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 74). Die Umsetzung wurde nach Tieffrieren des Biokatalysators über Nacht durchgeführt.
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Die Hydrolyse wurde bei 40 C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-Mandelsäure vollständig.
Rohausbeute : 1. 16g (100%)
Produkt-ee : 93%
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Beispiel 8 : Umsetzungen von Cyanhydrinen von Ketonen mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Massstab
Es wurde en K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6. 5) verwendet. Die Reaktionsverfolgung erfolg- te mit DC.
Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 20min bei 4 C und 6000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1 N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgt gemäss Beispiel 1, Variante ll. 2L Fermentations- medium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 60mL Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 60).
300mg (S) -Acetophenoncyanhydrin (25% Acetophenon, ee 94%), gelöst in 1 mL DMSO wurden der Zellsuspension zugesetzt. Nach 20h war die Umsetzung It. DC vollständig und das Produkt (enthält 1-Phenylethanol und Spuren anderer Verunreinigungen) wurde extrahiert. Die Umsetzung verlief ohne Verlust an Enantiomerenreinheit.
Rohausbeute : 357mg
Beispiel 9 : Erzeugung von Enzympräparationen von Nitrilhydratase und Amidase zur Hydrolyse substituierter Cyanhydrine mittels rekombinanter Expression in E. coli
Zur Expression der Nitrilhydratase, sowie zur Expression der Amidase wurde das pMS470- Plasmidsystem herangezogen. Dieses Plasmid verfügt neben den replikativen Elementen, einer selektionierbaren Ampicillin-Resistenz und dem Lac-Repressor-Gen /ac/ über einen induzierbaren tac-Promotor, welcher eine gesteuerte Überexpression der einklonierten offenen Leserahmen erlaubt.
Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Nitrilhydratase:
Die Plasmidkarte ist in Fig. 1 zu sehen. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pMS470Nhse7.3.
Es enthält neben den beiden Genabschnitten der Nitrilhydratase (a- und #-Untereinheit) noch einen dritten offenen Leserahmen, welcher für ein Aktivatorprotein codiert.
Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Amidase:
Anders als bei der Nitrilhydratase ist für die Expression der Amidase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 nur ein einziger Leserahmen notwendig und dieser wurde im Plasmid pMS470-33/3/1/11 hinter dem tac-Promotor einkloniert. Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte dieses Konstruktes.
Fermentation der rekombinanten Nitrilhydratase und Amidase
Die Fermentation der beiden Enzyme erfolgte grundsätzlich nach dem allgemeinen Protokoll, ausgearbeitet für die Überexpression von Enzymen im pMS470 System.
Dabei wurde: -aus einer Über-Nacht-Kultur (ONC) in eine Hauptkultur mit LB-Medium und Antibiotikum im Schüttelkolben überimpft.
-bis in die exponentielle Phase anwachsen gelassen -bei OD600 (Optische Dichte bei 600nm) 0. 8 bis 1.5 mit IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) induziert -für 18h weiter induziert (Proteinexpression) -geerntet (Zentrifugation) und aufgeschlossen (Ultraschall)
Expression der Nitrilhydratase
Die mit pMS470Nhase7. 3 (bzw. pMSNhasetactac7. 3) transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB-Ampicillin-Platten vereinzelt und eine ONC von 100m1 LB-Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft. Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250m1 LB-Ampicillin Medium in einem 1000m1 Schikanenkolben auf eine OD6oo von 0. 01 bis 0. 03 (Beck- mann Photometer) beimpft.
Die Wachstumstemperatur wurde auf 25 C eingeregelt, da bei höheren Temperaturen ausschliesslich die Bildung von unlöslichen Einschlusskörperchen erfolgt. Nach Erreichen der Induktionsdichte (OD6oo=1 Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz
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von IPTG zu einer Konzentration von 0.1 mM induziert. Zusätzlich wurden die Medien mit 0.1 mM
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geerntet (Zentrifugation bei ca. 3000*g für 15min) und einmal mit ca. 100ml PBS-Puffer gewa- schen. Das Zellpellet wurde im Anschluss in PBS-Puffer resuspendiert (ca. 5ml Gesamtvolumen) und mit einer Ultraschallsonde (BRANSON Sonifier 250,60% Leistungseinstellung, Konstantbe- schallung; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Kühlung) aufgeschlossen (Visuelle Kontrolle der Vollständigkeit unter dem Mikroskop).
Die so erhaltenen Rohlysate besassen eine typische Aktivität von ca. 100-250 U/ml (ca. 350-500U/ml für pMSNhasetactac7.3), analysiert mit Methacrylonitril als Substrat unter den nachfolgend angeführten Bedingungen.
Zur Konservierung wurden die Lysate bei -20 C gelagert. Lagerung bei Raumtemperatur ist mit einem schnellen Verlust an Aktivität verbunden.
Aktivitätsbestimmung : Rohlysate wurden unmittelbar vor der Aktivitätsbestimmung 1:10 mit PBS-Puffer verdünnt. 1.4ml einer 40mM Methacrylonitril Lösung in PBS-Puffer wurden mit 20 l des verdünnten Lysats versetzt und bei 28 C inkubiert (Eppendorf Thermomixer 5436). Zum Zeit-
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0. 17% Phosphorsäure die Enzymreaktion in diesen Proben gestoppt. Nach Zentrifugation (16000*g, 10 Minuten) wurden die Proben spektrophotometrisch (Perkin Eimer UVNIS- Spekrometer Lambda Bio) bei 224nm vermessen. Der Anstieg der Extinktion wurde mit der Zu-
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herangezogen wurde.
Expression der Amidase
Die mit pMS470-33/3/1/11 transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB-AmpicillinPlatten vereinzelt und eine ONC von 100m1 LB-Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft.
Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250m1 SOC-Ampicillin Medium in einem 1000m1 Schikanenkolben auf eine OD600 von 0. 01 bis 0. 03 (Beckmann Photometer) beimpft. Die Wachstumstemperatur wurde auf 30 C eingeregelt, da die Fermentation bei 37 C ausschliesslich zur Bildung von unlöslichem und inaktiven Protein führt. Nach Erreichen der Induktionsdichte (OD600=1 Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz von IPTG zu einer Konzentration von 0. 3mM induziert. Nach einer Induktionszeit von 16h wurden die Zellen geerntet (Zentrifugation 3000*g, 10min) und mit Natriumphospatpuffer (0.1 M, pH=7) gewaschen.
Das gewonnene Pellett wurde auf ca. 5ml Gesamtvolumen im Waschpuffer resuspendiert und mit einer Ultraschallsonde (BRANSON Sonifier 250, 60% Leistungseinstellung, Konstantbeschallung; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Kühlung) unter ständiger Kühlung bis zur Vollständigkeit aufgeschlossen (Visuelle Kontrolle der Vollständigkeit unter dem Mikroskop). Die derart gewonnenen Rohlysate wurden zur Konservierung bei -20 C eingefroren. Die Lysate besassen eine Aktivität von ca. 75 U/ml. bestimmt mit Acetamid (40mM) als Substrat in PBS-Puffer bei 37 C (Bestimmung von freigesetztem Ammonium nach der Indophenolblau-Methode).
Bestimmung der Amidaseaktivität:
Folgende Lösungen wurden verwendet:
Substratlösung: 40 mM Acetamid in PBS Lösung A : 10%(w/v) Phenol in Ethanol (95%) Lösung B : 0.5%(w/v) Nitroprussidnatrium in ddH20
Lösung C: 100g tri-Natriumcitrat and 5g of Natriumydroxid in 550 ml Wasser
Lösung D: 600ml handelsübliche Natriumhypochlorit-Lösung verdünnt auf 1000m1
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1.4m1 Substratlösung wurden mit 10 l Enzymverdünnung (1:10 in PBS) bei 30 C inkubiert (Ep- pendorf Thermomixer 5436). In 100 l Proben wurden nach 0,1, 2,5, 10 und 15 Minuten mit 20 l Lösung A die Enzymreaktion gestoppt. Nach Entnahme der letzten Probe wurden die so erhalte- nen Lösungen mit 400 l Wasser verdünnt.
Zur Kalibrierung wurden weiters Ammoniumstandard- Lösungen (je 500m1) mit 20 l Lösung A vesetzt. Zu Proben sowie Standards wurden darauf 20 l der Lösung B und 50 l eines Gemisches von 4 Teilen Lösung C mit 1 Teil Lösung D zupippettiert.
Gute Durchmischung wurde durch Vortexen sichergestellt. Die so behandelten Proben und Stan- dards wurden bei 37 C für 15min belassen. Die entstandene Blaufärbung wurde nach Verdünnung aller Proben und Standards 1 :10 Wasser im Spektrophotometer (Perkin Eimer UVNIS-
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Spektrometer Lambda Bio) bei 640nm quantifiziert. Durch Korrelation der Zunahme der Blaufärbung über die Zeit mit den Extinktionswerten der Standards konnte auf die Aktivität ( Mol freigesetztes Ammonium pro Minute) rückgerechnet werden.
Beispiel 10 : Hydrolyse unter Verwendung des rekombinanten Enzyms
Bei diesen Umsetzungen wurde klonierte Nitrilhydratase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 als Rohlysat des E. coli Klons 7. 3 (hergestellt gemäss Beispiel 9) verwendet.
Durchführung:
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einer ca. 200mM Substratlösung in DMSO versetzt (5mg Protein/mL S. -Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umsetzung wurde im Thermomixer bei 30 C und 1000rpm durchgeführt. Nach 0, 2,4, 6,8, 10,15, 20,30, 60 und 120 Minuten wurde jeweils ein Eppendorfer mit 0.5mL 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cyanhydrin und Hydroxyamid mittels HPLC bestimmt. Die Aktivität der Nitrilhydratase wurde anhand der Geschwindigkeit der Bildung des Hydroxyamides ermittelt (Steigung im Anfangsbereich). Als Standardsubstrat (100% Aktivität) wurde 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril verwendet. Die Aktivität bei der Hydrolyse der anderen Substrate wurde mit der Aktivität an 2Hydroxy-4-phenyl-butyronitril verglichen (Tab. 5).
Ergebnisse:
Die Aktivität der Nitrilhydratase im Rohlysat des E. coli Klons 7. 3 bei der Hydrolyse von 2-
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an den verschiedenen Substraten dargestellt.
Tabelle 5 : Vergleich der Aktivität der Nitrilhydratase aus dem E. coli Klon 7. 3 an den verschiedenen Substraten.
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Umsetzung von (R)-2-Chlormandelonitril im halb-präparativen Massstab
50mL eines Rohlysates der klonierten Nitrilhydratase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 (E. coli Klon 7. 3, hergestellt gemäss Beispiel 9) wurden mit 100mL Puffer (K/Na-P04-Puffer, 50mM, pH 6.5) verdünnt. Nach Zusatz von 1.0g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%) in 1.5mL DMSO wurde die Suspension bei 150rpm und 30 C geschüttelt. Nach vollständigem Umsatz
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wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und das Produkt wurde 4 Tage mit CH2CI2 kontinuierlich extrahiert. ee des Rohproduktes : Ausbeute nach Reinigung : (82%)
PATENTANSPRÜCHE:
1.
Verfahren zur Herstellung von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, dadurch gekennzeich- net, dass (R)- oder (S) -Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB
11540 durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R)- oder (S)- a-Hydroxycarbonsäuren überführt werden.