WO2004076385A2 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG CHIRALER α-HYDROXYCARBONSÄUREN DURCH ENZYMATISCHE HYDROLYSE VON CHIRALEN CYANHYDRINEN - Google Patents

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Ingrid Osprian
Hans-Egbert Schoemaker
Christoph Reisinger
Helmut Schwab
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Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Co. Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • Optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acids are used, for example, as additives in animal feed or in the production of active pharmaceutical ingredients, vitamins and liquid crystals.
  • optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acids can also be described, for example, by Effenberger et al., Angew. Chem. 95 (1983) No. 1, page 50, advantageously convert it into N-substituted optically active ⁇ -amino acids which are otherwise very difficult to produce.
  • Chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids are now chemically, fermentatively or enzymatically accessible.
  • Racemic cyanohydrins can be hydrolyzed to the desired chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids with the addition of suitable microorganisms.
  • optically active cyanohydrins can be hydrolyzed with concentrated hydrochloric acid without racemization to give the corresponding chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids.
  • the optical purity of the chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids thus produced corresponds to the optical purity of the chiral cyanohydrin used, even if it is obtained in situ by enzyme-catalyzed addition of a cyanide group to a corresponding aldehyde or a ketone and is further processed without isolation or purification.
  • the present invention accordingly relates to a process for the preparation of chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids, which is characterized in that (R) - or (S) -cyanohydrins in the presence of Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 by enzymatic hydrolysis into the corresponding (R) - or (S) - ⁇ - Hydroxycarboxylic acids are transferred.
  • (R) ⁇ and (SJ-cyanohydrins are converted into (R) - and SJ- ⁇ -hydroxycarboxylic acids with an optical purity of up to> 99% ee.
  • the starting compounds used are (R) - and (S) - cyanohydrins, which are produced by enzymatic or chemically catalyzed addition of a cyanide group to the corresponding aldehydes or ketones.
  • aldehydes are aliphatic, aromatic or heteroaromatic aldehydes.
  • Aliphatic aldehydes are to be understood as meaning saturated or unsaturated aliphatic, straight-chain, branched or cyclic aldehydes.
  • Preferred aliphatic aldehydes are straight-chain aldehydes having in particular 2 to 18 carbon atoms, particularly preferably 2 to 12, which are saturated or mono- or polyunsaturated.
  • the aldehyde can have both CC double bonds and CC triple bonds.
  • the aldehyde can be unsubstituted or one or more times by groups which are inert under the reaction conditions, for example by optionally substituted aryl or heteroaryl groups, such as phenyl or indolyl groups, by C 1 -C 6 -alkyl, optionally substituted cycloalkyl groups which have one or more heteroatoms from the group O, S, P, or N can be substituted, halogen, ether, alcohol, acyl, carboxylic acid, carboxylic acid ester, nitro or azido groups.
  • groups which are inert under the reaction conditions for example by optionally substituted aryl or heteroaryl groups, such as phenyl or indolyl groups, by C 1 -C 6 -alkyl, optionally substituted cycloalkyl groups which have one or more heteroatoms from the group O, S, P, or N can be substituted, halogen, ether, alcohol, acyl, carboxylic acid, carboxylic acid
  • aromatic or heteroaromatic aldehydes are benzaldehyde or variously substituted benzaldehydes such as 2-chlorobenzaldehyde, 3,4- Difluorobenzaldehyde, 4-methylbenzaldehyde, 3-phenoxybenzaldehyde, 4-fluor-3-phenoxybenzaldehyde, further furfural, anthracene-9-carbaldehyde, furan-3-carbaldehyde, indole-3-carbaldehyde, naphthalene-1-carbaldehyde, phthalaldehyde, pyrazole -3-carbaldehyde, pyrrole-2-carbaldehyde, thiophene-2-carbaldehyde, isophthalaldehyde or pyridine aldehydes, etc.
  • benzaldehyde or variously substituted benzaldehydes such as 2-chlorobenzaldehyde, 3,4
  • ketones are aliphatic, aromatic or heteroaromatic ketones in which the carbonyl carbon atom is unequally substituted.
  • Aliphatic ketones are straight-chain, branched or cyclic ketones.
  • the ketones can be saturated or mono- or polyunsaturated. You can unsubstituted or one or more times by groups inert under the reaction conditions, for example by optionally substituted aryl or heteroaryl groups such as phenyl or indolyl groups, by halogen, ether, alcohol, acyl, carboxylic acid, carboxylic acid ester, Nitro or azido groups can be substituted.
  • aromatic or heteroaromatic ketones are acetophenone, indolylacetone, etc.
  • R1 X R2 z in the R1 and R2 are independently H, an optionally mono- or polysubstituted with inert under the reaction conditions substituent substituted C- ⁇ -C 6 - alkyl or alkenyl radical or an optionally mono- or polysubstituted with inert under the reaction conditions substituent substituted phenyl radical, with the proviso that R1 and R2 are not both H.
  • Preferred substituents which are inert under the reaction conditions are, for example, halogens, such as fluorine, bromine and chlorine, C 1 -C 6 -alkyl or alkoxy, ethers, esters, acetals or optionally substituted phenyl and phenyloxy.
  • (R) - or (S) - cyanohydrins such as (R) - or (S) -2-hydroxy-4-phenyl-butyronitrile, (R) - or (S) -2 - Chloromandelonitrile, (R) - or (S) -mandelonitrile, (R) - or (S) -4-methylmandelonitrile, (R) - or (S) -3-phenoxymandelonitrile, (R) - or (S) -2 -Hydroxy-2-methyl-heptanenitrile, (R) - or (S) -2-hydroxy-2-phenyl-propionitrile, (R) - or (S) -2-hydroxy-3-pentenenitrile, (R) - or (S) -l-hydroxy-cyclohexanenitrile, (R) - or (S) -acetophenonecyna
  • the enzymatic hydrolysis takes place in the presence of Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540.
  • Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 has unexpectedly found a microorganism which is distinguished by the fact that it has a nitrile hydrate / amidase enzyme system which can hydrolyze the nitrile function of such polar nitriles as the cyanohydrins mentioned above.
  • the chiral cyanohydrins are hydrolyzed in the first step by the nitrile hydratase into the corresponding chiral hydroxyamide, which is then converted in a second hydrolysis step by the amidase into the corresponding chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acid.
  • microorganism can be used in the method according to the invention in any form, for example in the form of ground cells, crude or purified enzymes, recombinant enzymes, immobilized cells or enzymes, lyophilized cells or "resting cells".
  • Recombinant enzymes, resting cells or lyophilized cells are preferably used, particularly preferably recombinant enzymes or resting cells.
  • a suitable microorganism such as E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces, Asperagillus, K. Lactis, etc.
  • the corresponding genes are introduced with the aid of plasmid constructs into suitable host cells, for example in E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces, Asperagillus, K. Lactis host cells.
  • both the nitrile hydratase and the amidase can be overexpressed in active form.
  • amidase much higher activity levels can be achieved than with corresponding fermentation of the Rhodococcus cells.
  • aqueous medium such as water or a buffer solution.
  • aqueous medium such as water or a buffer solution.
  • buffer solutions are, for example, phosphate buffers such as K / Na phosphate buffers, PBS buffers, butyrate buffers, citrate solutions, etc.
  • the pH of the buffer solution used should be in a range from pH 4.5 to pH 11, preferably from 5.5 to 8.5.
  • the corresponding chiral cyanohydrin is then added to the suspension thus obtained. Since the chiral cyanohydrins are lipophilic compounds with limited water solubility, the use of a solubilizer as a cosolvent is necessary in order to dissolve the cyanohydrins in an aqueous medium.
  • Suitable solubilizers are, for example, organic solvents, surfactants, phase transfer catalysts, etc.
  • Organic solvents which are suitable as cosolvents for the process according to the invention are those which firstly sufficiently dissolve the substrate and secondly impair the enzyme activity as little as possible.
  • Examples include dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), Ci-C ⁇ alcohols, such as methanol, ethanol, i-propanol, 1-butanol, 2-butanol, t-butanol or 1-pentanol, toluene or t.- Butyl methyl ether (TBME) or mixtures thereof.
  • DMSO, DMF, ethanol, i-propanol or mixtures thereof, and particularly preferably DMSO and DMF are preferably used as cosolvents.
  • the proportion of cosolvents should be between 0.5 and 20% by volume, based on the total volume of the reaction solution.
  • the cosolvent fraction is preferably between 1 and 15 vol% and particularly preferably between 2 and 10 vol%.
  • the substrate concentration in the reaction solution in the process according to the invention should be in a range from 1 g / l to 10Og / l (based on the total volume of the reaction solution), the acceptance of a sufficiently high substrate concentration being the basic prerequisite for the use of the enzymatic hydrolysis according to the invention in the preparative Scale is.
  • Substrate concentrations of up to 50 g / l are preferred, particularly preferably up to 25 g / l.
  • the possible convertible substrate concentration depends on the amount of enzyme used.
  • the first hydrolysis step has to be carried out very quickly in order to avoid the disintegration of the cyanohydrin and the resulting racemization, so that relatively high cell densities are required.
  • the amount of cells or enzyme depends on the activity of the microorganism in the form used, as well as on the substrate concentration and the cosolvent.
  • the pH of the reaction mixture should be between 4.5 and 11, preferably between 5.5 and 8.
  • a suitable acid or acidic salts such as phosphoric acid, boric acid, citric acid, etc., can be added to the reaction mixture to adjust the pH. be added.
  • the enzymatic hydrolysis according to the invention is carried out at a temperature of 10 to 60 ° C., preferably at 15 to 50 ° C. and particularly preferably at 20 to 45 ° C.
  • hydrolysis to the desired chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids After hydrolysis to the desired chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids, they are isolated from the reaction mixture using a known technique, such as centrifuging the cells, extracting the product after acidification with HCl (e.g. pH 2) and, if appropriate, further purifying it by activated carbon filtration and recrystallization.
  • HCl e.g. pH 2
  • Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 thus converts polar nitriles, such as chiral cyanohydrins, into the corresponding chiral ⁇ -hydroxycarboxylic acids in a simple and efficient manner under mild conditions, with no racemization occurring.
  • polar nitriles such as chiral cyanohydrins
  • the desired ⁇ -hydroxycarboxylic acids are obtained in high optical purity of up to over 99% and in high yields of up to over 98%.
  • a complex standard medium (Medium A, see Table 1) was used to produce the Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 biomass.
  • the stock was kept on agar plates with medium A (solidification with 15 g / l agar). The plates were sealed by wrapping parafilm on the side and stored in the refrigerator at 4 ° C.
  • Variant I (without preculture): About half of the biomass of an agar plate was suspended in 5 ml of sterile, physiological saline. One cell suspension each was added to 250 ml of culture medium.
  • the cells were harvested by centrifugation at approx. 3000rpm for 30min at 0-4 ° C.
  • the cells were washed once with K / Na phosphate buffer (50mM, pH 6.5).
  • the cells were then resuspended in fresh buffer and either lyophilized after shock freezing (reactions with lyophilized cells, example 2), or this cell suspension (about 6-8% of the culture volume) was used directly for the biocatalytic reactions (reactions with resting cells, example 3).
  • Example 2 Reactions with lyophilized cells on an analytical scale
  • Example 3 Enzymatic hydrolysis using resting cells and lyophilized cells
  • the cells were resuspended in 1.8 ml K / Na-PO 4 buffer (pH 6.5, 50 mM) (lyophilized cells were shaken for 1 hour for rehydration).
  • the reaction was started by adding 200 ⁇ l of a 200mM substrate solution in DMSO (substrate concentration approx. 20mM) and carried out at 30 ° C. and 130rpm in a shaker. After 30 min, 60 min and 17 h, 200 ⁇ l were removed and 200 ⁇ l of 1N HCl were added. After centrifugation (5 min, 13,000 rpm) and dilution, the conversions were determined by means of HPLC. Only the substrate and the two products were taken into account.
  • the conversion of the hydroxyamide (HA) relates to the amount of hydroxy acid that was formed from the hydroxyamide present.
  • reaction was carried out on an analytical scale (reaction volume 1 ml) with 3 substrate concentrations (2.2g / l, 6.6g / l, 13.2g / l).
  • the biocatalyst was prepared according to Example 1, Variant II, 21 fermentation medium, harvest after 20 hours (ODs 46 6.1).
  • the cells from 8 x 10 ml fermentation solution were centrifuged off in culture tubes.
  • the cell mass obtained was washed once with 2 ml of K Na phosphate buffer (pH 6.5, 50 mM).
  • the contents of 2 tubes were lyophilized to determine the dry weight.
  • Substrate solution 11mg (R) -2-chloromandelonitrile in 250 ⁇ l DMSO (approx. 260mM) substrate concentration in the batch: 2.2g / l (13.1mM) b.
  • Substrate concentration in the batch Substrate concentration: 6.6g / l (39.4mM)
  • Substrate concentration in the batch 13.2g / l (78.8mM)
  • reaction was carried out with 2 different substrate concentrations (10 g / l, 20 g / l) on a 5 ml scale.
  • the biocatalyst was prepared according to Example 1, Variant II, 21 fermentation medium, harvest after 19 hours (OD 546 8.4).
  • the cells were resuspended in approx. 140 ml buffer (Resting cells, OD 5 6 52). 4.75 ml each of this cell suspension was used for the enzymatic reactions.
  • Two different concentrations of (R) -2-chloromandelonitrile were investigated in parallel.
  • the reaction was started by adding 250 ⁇ l of substrate solution and carried out in culture tubes in a shaking cabinet at 30 ° C. and 130 rpm. To check the turnover, 200 ⁇ l were taken in each case and 200 ⁇ l of 1 N HCl were added. After centrifugation (5 min, 13,000 rpm) and dilution, the conversions were determined using HPLC.
  • the biocatalyst was prepared according to Example 1, Variant II, 2.75I fermentation medium, harvested after 20 hours.
  • the cells were resuspended in approx. 200 ml buffer (Resting cells, OD 5 6 44). 4.85 ml each of this cell suspension were used for the enzymatic reactions.
  • the cells were suspended in 100 ml K / Na phosphate buffer (pH 6.5, 50mM). This cell suspension (OD 60) was used for the enzymatic reactions.
  • the reactions of (R) -2-chloromandelonitrile, dissolved in DMSO or EtOH, were carried out in 100 ml Schlifferienmeyer flasks at 150rpm and 30 ° C.
  • 200 ⁇ l of sample were mixed with 200 ⁇ l of 1N HCl, centrifuged (5 min, 13,000 rpm) and diluted before the measurement. After complete conversion, the ee of the product was determined.
  • the substrate concentration was 10 g / l (R) -2-chloromandelonitrile.
  • the reaction was carried out on a 5 ml scale.
  • Example 7 Reactions of cyanohydrins from aldehydes with Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 on a semi-preparative scale
  • the biocatalyst was produced in accordance with Example 1, variant II. 31 fermentation medium, harvest after 20 hours (ODs 46 5.9). The cells were resuspended to about 180 ml in buffer (Resting cells, OD54 6 80).
  • experiment 7.2 some reaction parameters were varied.
  • the standard conditions were 10 g / l substrate and DMSO as cosolvent (here 2.5%).
  • a second batch was carried out with 15 g / l substrate, another with 10 g / l substrate and DMF as cosolvent.
  • the biocatalyst was produced in accordance with Example 1, variant II. 31 fermentation medium, harvest after 20 hours (ODs 4 6 6.8). The cells were resuspended to about 190 ml buffer (Resting cells, OD54 6 69). Three implementations were carried out.
  • Batch A 0.3 g (R) -2-chloromandelonitrile (ee> 99%), dissolved in 750 ⁇ l DMSO, 30 ml of this cell suspension were added.
  • the hydrolysis was carried out at 40 ° C. and 150 rpm in the shaker. After 30 minutes the cyanohydrin was completely hydrolyzed, after 5 hours the conversion to (R) -2-chloromandelic acid was complete. Crude yield: 0.31g (93%) Product ee:> 99%
  • Batch B 0.3 g (R) -2-chloromandelonitrile (ee> 99%), dissolved in 750 ⁇ l DMF, 30 ml of this cell suspension were added.
  • batch A 10g / l batches with different substrate concentrations (batch A 10g / l, batch B 15g / l) were carried out. Both implementations were almost equally quick and were complete after 2 hours.
  • the biocatalyst was produced in accordance with Example 1, variant II. 31 fermentation medium, harvest after 20 hours (OD 546 1.2). The cells were resuspended in approximately 180 ml of buffer (Resting cells, OD 546 70). Two implementations were carried out.
  • the biocatalyst was produced according to Example 1, variant II, 2.5I fermentation medium, harvest after 20 hours (OD 546 6.9).
  • the cells were resuspended in approx. 160 ml buffer (Resting cells, OD 546 63).
  • the biocatalyst was produced according to Example 1, Variant II, 21 fermentation medium, harvest after 20 hours (OD 546 8.4).
  • the cells were resuspended in approx. 120 ml buffer (Resting cells, OD 546 74).
  • the reaction was carried out after freezing the biocatalyst overnight.
  • the hydrolysis was carried out at 40 ° C. and 150 rpm in the shaker. After 15 minutes the cyanohydrin was completely hydrolyzed, after 5 hours the conversion to (R) -mandelic acid was complete. Crude yield: 1.16g (100%) Product ee: 93%
  • Example 8 Reactions of cyanohydrins from ketones with Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 on a semi-preparative scale
  • the biomass was centrifuged off at 4 ° C. and 6000 rpm for 20 min and once with H 2 0 dist. washed. After acidifying the supernatant with 1 N HCl to pH 2, extraction was carried out 3-4 times with TBME.
  • the biocatalyst is produced according to Example 1, variant II, 2L fermentation medium, harvest after 20 hours.
  • the cells were resuspended in approx. 60 ml buffer (Resting cells, OD 546 60).
  • the pMS470 plasmid system was used to express the nitrile hydratase and to express the amidase.
  • this plasmid has an inducible tac promoter which allows controlled overexpression of the cloned open reading frames.
  • the plasmid map can be seen in Figure 1.
  • the plasmid is called pMS470Nhse7.3.
  • ⁇ and ⁇ subunit In addition to the two gene segments of nitrile hydratase ( ⁇ and ⁇ subunit), it also contains a third open reading frame which codes for an activator protein.
  • the fermentation of the two enzymes was basically carried out according to the general protocol, worked out for the overexpression of enzymes in the pMS470 system.
  • the E. coli B BL21 cells transformed with pMS470Nhase7.3 (or pMSNhasetactac7.3) were separated on LB ampicillin plates and an ONC of 100 ml LB ampicillin medium was inoculated with a single colony.
  • pMS470Nhase7.3 or pMSNhasetactac7.3
  • the growth temperature was controlled at 25 ° C., since at higher temperatures only insoluble inclusion bodies are formed.
  • the cultures were induced by adding IPTG to a concentration of 0.1 mM.
  • the media were supplemented with 0.1 mM ammonium iron (III) citrate.
  • the cultures were harvested (centrifugation at approx. 3000 * g for 15 min) and washed once with approx. 100 ml PBS buffer.
  • the cell pellet was then resuspended in PBS buffer (approx. 5ml total volume) and disrupted with an ultrasound probe (BRANSON Sonifier 250, 60% power setting, constant sonication; 5 times 30s with 1 minute break for cooling) (visual check of completeness under the Microscope).
  • the crude lysates thus obtained had a typical activity of approx. 100-250 U / ml (approx.
  • the E. coli B BL21 cells transformed with pMS470-33 / 3/1/11 were isolated on LB-ampicillin plates and an ONC of 100 ml LB-ampicillin medium was inoculated with a single colony.
  • a main culture consisting of 250 ml SOC ampicillin medium in a 1000 ml baffle flask was inoculated to an OD 6 oo of 0.01 to 0.03 (Beckmann photometer).
  • the growth temperature was adjusted to 30 ° C because the fermentation at 37 ° C only leads to the formation of insoluble and inactive protein.
  • the cultures were induced by adding IPTG to a concentration of 0.3mM.
  • the pellet obtained was resuspended to a total volume of approx. 5 ml in the wash buffer and disrupted to completion with an ultrasound probe (BRANSON Sonifier 250, 60% power setting, constant sonication; 5 times 30 s with 1 min break for cooling) with constant cooling (visual check of completeness Under the microscope).
  • the crude lysates obtained in this way were frozen at -20 ° C for preservation.
  • the lysates had an activity of approx. 75 U / ml, determined with acetamide (40mM) as substrate in PBS buffer at 37 ° C
  • Solution A 10% (w / v) phenol in ethanol (95%)
  • Solution B 0.5% (w / v) nitroprusside sodium in ddH 2 0
  • Solution C 100g tri-sodium citrate and 5g of sodium hydroxide in 550 ml water
  • Solution D 600ml commercial sodium hypochlorite solution diluted to 1000ml
  • Ammonium standards 0, 80, 120, 200, 280, 400 ⁇ g / l ammonium sulfate in water
  • Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 nitrile hydratase was used as the crude lysate of E. coli clone 7.3 (prepared according to Example 9).
  • the activity of the nitrile hydratase was determined on the basis of the rate of formation of the hydroxyamide (slope in the initial region).
  • 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitrile was used as the standard substrate (100% activity).
  • the activity in the hydrolysis of the other substrates was compared with the activity on 2-hydroxy-4-phenyl-butyronitrile (Table 5).

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren, bei welchem (R)-oder (S)-Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R)- oder (S)- α-Hydroxycarbonsäuren überführt werden.

Description

Verfahren zur Herstellung chiraler α-Hydroxycarbonsäuren durch enzymatische Hydrolyse von chiralen Cyanhydrinen
Optisch aktive α-Hydroxycarbonsäuren finden beispielsweise als Zusatzstoffe zu Futtermitteln oder bei der Gewinnung pharmazeutischer Wirkstoffe, Vitamine und Flüssigkristalle Verwendung.
Diese optisch aktiven α-Hydroxycarbonsäuren lassen sich weiters beispielsweise nach Effenberger et al., Angew. Chem. 95 (1983) Nr.1 , Seite 50, vorteilhaft in anderweitig nur sehr schwer herzustellende N-substituierte optisch aktive α-Aminosäuren überführen.
Chirale α-Hydroxycarbonsäuren sind heutzutage chemisch, fermentativ oder enzy- matisch zugänglich.
Aus der Literatur ist deshalb eine Reihe verschiedener Synthesemöglichkeiten von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren bekannt.
So können racemische Cyanhydrine unter Zusatz geeigneter Mikroorganismen zu den gewünschten chiralen α-Hydroxycarbonsäuren hydrolysiert werden.
Die Herstellung von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren, speziell die Herstellung von optisch aktiver Milchsäure oder Mandelsäure aus racemischen Cyanhydrinen mit verschiedenen Mikroorganismen der Gattungen Alicaligenes, Pseudomonas, Acine- tobacter, Rhodococcus, Candida u.s.w. ist beispielsweise in EP 0 449 684, EP 0 527
553, EP 0 610 048, u.s.w. beschrieben.
Aus diesem Stand der Technik ist es auch bekannt, dass wenn ein racemisches Cy- anhydrin enzymatisch unter Verwendung einer Nitrilase zu der korrespondierenden α-Hydroxycarbonsäure hydrolysiert wird, das Problem auftritt, dass das Enzym innerhalb kurzer Zeit inaktiviert wird und so die gewünschte α-Hydroxycarbonsäure meist nur in geringen Ausbeuten und Konzentrationen erhalten wird. Dies gilt auch bei der Verwendung von Nitrilhydratasen, die das Cyanhydrin zu dem korrespondie- renden α-Hydroxyamid umwandeln. Die Hydroxyamide können sodann wiederum zu den korrespondierenden α-Hydroxycarbonsäuren umgesetzt werden.
Es ist auch bekannt, beispielsweise aus Angew. Chem. 1994, 106, Seite1615f., dass sich optisch aktive Cyanhydrine ohne Racemisierung mit konzentrierter Salzsäure zu den korrespondierenden chiralen α-Hydroxycarbonsäuren hydrolysieren lassen. Die optische Reinheit der so hergestellten chiralen α-Hydroxycarbonsäuren entspricht dabei der optischen Reinheit des eingesetzten chiralen Cyanhydrins, auch wenn dieses in-situ durch enzymkatalysierte Addition einer Cyanidgruppe an einen entsprechenden Aldehyd oder ein Keton erhalten und ohne Isolierung bzw. Aufreinigung weiterverarbeitet wird.
Nachteilig bei dieser Reaktion ist, dass empfindliche Substrate zersetzt werden und das Auftreten von Korrosion.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, bei welchem so polare Nitrile wie chirale Cyanhydrine mit einer milden und effizienten Methode in die korrespondierenden chiralen Hydroxycarbonsäuren überführt werden können, wobei die Hydroxycarbonsäuren in etwa die gleiche enantiomere Reinheit wie die Cyanhydrine aufweisen.
Unerwarteterweise konnte diese Aufgabe durch die Verwendung eines speziellen Bakteriums aus der Gattung Rhodococcus gelöst werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass (R)- oder (S)-Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R)- oder (S)-α- Hydroxycarbonsäuren überführt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden (R)~ und (SJ-Cyanhydrine in (R)- und SJ-α-Hydroxycarbonsäuren mit einer optischen Reinheit von bis zu > 99%ee überführt.
Als Ausgangsverbindungen dienen (R)- und (S)- Cyanhydrine, die durch enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entsprechenden Aldehyde oder Ketone hergestellt werden.
Die enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entsprechenden Aldehyde oder Ketone kann dabei analog dem Stand der Technik, beispielsweise analog EP 0 951 561 , EP 0 927 766, EP 0 632 130, EP 0547 655, EP 0 326 063 u.s.w., erfolgen.
Als Ausgangsverbindungen eignen sich die im Stand der Technik zitierten Aldehyde und Ketone.
Beispiele für geeignete Aldehyde sind dabei aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Aldehyde. Unter aliphatischen Aldehyden sind dabei gesättigte oder ungesättigte aliphatische, geradkettige, verzweigte oder cyclische Aldehyde zu verstehen. Bevorzugte aliphatische Aldehyde sind geradkettige Aldehyde mit insbesondere 2 bis 18 C-Atomen, besonders bevorzugt von 2 bis 12, die gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sind. Der Aldehyd kann dabei sowohl C-C- Doppelbindungen als auch C-C-Dreifachbindungen aufweisen. Der Aldehyd kann unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroa- rylgruppen, wie Phenyl- oder Indolylgruppen, durch Cι-C6-Alkyl, gegebenenfalls substituierte Cycloalkylgruppen, die ein oder mehrere Heteroatome aus der Gruppe O, S, P, oder N aufweisen können, Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein. Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Aldehyde sind Benzaldezyd bzw. verschieden substituierte Benzaldehyde wie etwa 2-Chlorbenzaldehyd, 3,4- Difluorbenzaldehyd, 4-Methylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd, 4-FIuor-3- phenoxybenzaldehyd, weiters Furfural, Anthracen-9-carbaldehyd, Furan-3- carbaldehyd, lndol-3-carbaldehyd, Naphthalin-1-carbaldehyd, Phthaldialdehyd, Pyra- zol-3-carbaldehyd, Pyrrol-2-carbaldehyd, Thiophen-2-carbaldehyd, Isophthalaldehyd oder Pyridinaldehyde u.s.w..
Beispiele für Ketone sind aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Ketone, bei denen das Carbonylkohlenstoffatom ungleich substituiert ist. Unter aliphatischen Ketonen sind geradkettige, verzweigte oder cyclische Ketone zu verstehen. Die Ketone können gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein. Sie können unsubsti- tuiert oder ein- oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen wie Phenyl- oder Indolylgruppen, durch Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein. Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Ketone sind Acetophenon, Indoly- laceton u.s.w..
Bevorzugt werden (R)- oder (S)-Cyanhydrine der Formel
HO CN
R1 X R2 z in der R1und R2 unabhängig voneinander H, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten C-ι-C-6- Alkyl- oder Alkenylrest oder einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten Phenylrest bedeuten, mit der Maßgabe, dass R1 und R2 nicht beide H sind.
Bevorzugte unter den Reaktionsbedingungen inerte Substituenten sind beispielsweise Halogene, wie Fluor, Brom und Chlor, Cι-C6-Alkyl oder -Alkoxy, Ether, Ester, Ace- tale oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl und Phenyloxy. Besonders bevorzugt eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren (R)- oder (S)- Cyanhydrine, wie etwa (R)- oder (S)-2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril, (R)- oder (S)-2- Chlormandelonitril, (R)- oder (S)-Mandelonitril, (R)- oder (S)-4-Methylmandelonitril, (R)- oder (S)-3-Phenoxymandelonitril, (R)- oder (S)-2-Hydroxy-2-methyl-heptannitril, (R)- oder (S)-2-Hydroxy-2-phenyl-propionitril, (R)- oder (S)-2-Hydroxy-3-pentennitril, (R)- oder (S)-l-Hydroxy-cyclohexannitril, (R)- oder (S)-Acetophenoncynahydrin.
Das entsprechende (R)- oder (S)- Cyanhydrin wird sodann erfindungsgemäß enzy- matisch hydrolysiert.
Die enzymatische Hydrolyse erfolgt erfindungsgemäß in Anwesenheit von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540.
Mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wurde unerwarteterweise ein Mikroorganismus gefunden, der sich dadurch auszeichnet, dass er über ein Nitrilhydrata- se/Amidase-Enzymsystem verfügt, das die Nitrilfunktion von derart polaren Nitrilen, wie die oben angeführten Cyanhydrine hydrolysieren kann.
Durch das Nitrilhydratase/Amidase-Enzymsystem von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden die chiralen Cyanhydrine im ersten Schritt durch die Nitril- hydratase in das korrespondierende chirale Hydroxyamid hydrolysiert, welches sodann in einem zweiten Hydrolyseschritt durch die Amidase in die entsprechende chirale α-Hydroxycarbonsäure überführt wird.
Der Mikroorganismus kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in jeglicher Form, beispielsweise in Form von gemahlenen Zellen, rohen oder gereinigten Enzymen, rekombinanten Enzymen, immobilisierten Zellen oder Enzymen, lyophilisierten Zellen oder von „resting cells" eingesetzt werden.
Bevorzugt werden rekombinante Enzyme, resting cells oder lyophilisierte Zellen, besonders bevorzugt rekombinante Enzyme oder resting cells verwendet. Neben dem direkten Einsatz der Nitrilhydratase/Amidase-aktiven Präparationen von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Zellen stellt die Verwendung von rekombinanten, in einem geeigneten Mikroorganismus, wie etwa E. coli, Pichia pastoris, Sac- charomyces, Asperagillus, K. Lactis u.s.w. exprimierten Präparationen eine gute Alternative dar. Dabei werden die entsprechenden Gene mit Hilfe von Plasmid- konstrukten in geeignete Wirtszellen, beispielsweise in E. coli-, Pichia pastoris-, Sac- charomyces-, Asperagillus-, K. Lactis- Wirtszellen eingebracht. Durch Wahl eines induzierbaren Promoters können sowohl die Nitrilhydratase als auch die Amidase in aktiver Form überexprimiert werden. Im Falle der Amidase können hierbei weit höhere Aktivitätsniveaus erreicht werden als bei entsprechender Fermentation der Rhodococcus Zellen.
Der Mikroorganismus wird sodann in der gewünschten Form in einem wässrigen Medium, wie Wasser oder einer Pufferlösung, suspendiert. Geeignete Pufferlösungen sind beispielsweise Phosphatpuffer, wie etwa K/Na-Phosphatpuffer, PBS-Puffer, Butyratpuffer, Citratlösungen u.s.w..
Der pH-Wert der verwendeten Pufferlösung sollte dabei in einem Bereich von pH 4.5 bis pH 11 , bevorzugt von 5.5 bis 8.5 liegen.
Anschließend wird die so erhaltene Suspension mit dem entsprechenden chiralen Cyanhydrin versetzt. Da es sich bei den chiralen Cyanhydrinen um lipophile Verbindungen mit beschränkter Wasserlöslichkeit handelt, ist die Verwendung eines Lösungsvermittlers als Cosolvens notwendig, um die Cyanhydrine im wässrigen Medium in Lösung zu bringen.
Als Lösungsvermittler eignen sich beispielsweise organischen Lösungsmittel, Tensi- de, Phasentransferkatalysatoren, u.s.w..
Organische Lösungsmittel, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren als Cosolvens eignen sind solche, die erstens das Substrat ausreichend lösen und zweitens die Enzymaktivität so wenig wie möglich beeinträchtigen. Beispiele dafür sind Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), C-i-Cβ- Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, i-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, t-Butanol oder 1-Pentanol, Toluol oder t.-Butylmethylether (TBME) oder Gemische derselben. Bevorzugt werden als Cosolvens DMSO, DMF, Ethanol, i-Propanol oder Gemische derselben und besonders bevorzugt DMSO und DMF eingesetzt.
Der Cosolvensanteil sollte zwischen 0,5 und 20 Vol.%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Reaktionslösung liegen.
Bevorzugt liegt der Cosolvensanteil zwischen 1 und 15 Vol% und besonders bevorzugt zwischen 2 und 10 Vol%.
Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung sollte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Bereich von 1g/l bis zu 10Og/l (bezogen auf das Gesamtvolumen der Reaktionslösung) liegen, wobei die Akzeptanz einer ausreichend hohen Substratkonzentration die Grundvoraussetzung für die Anwendung der erfindungsgemäßen enzymatischen Hydrolyse im präparativen Maßstab ist.
Bevorzugt sind Substratkonzentrationen bis zu 50g/l, besonders bevorzugt bis zu 25g/l.
Die mögliche umsetzbare Substratkonzentration hängt von der eingesetzten Enzymmenge ab. Für eine effiziente, quantitative Umsetzung muss der erste Hydrolyseschritt sehr rasch erfolgen, um den Zerfall des Cyanhydrins und die dadurch bedingte Racemisierung zu vermeiden, sodass relativ hohe Zelldichten erforderlich sind.
Es ist dabei zu beachten, dass eine ausreichende Durchmischung des Reaktionssystems gewährleistet ist.
Die Zeil- bzw. Enzymmenge hängt von der Aktivität des Mikroorganismus in der eingesetzten Form, sowie von der Substratkonzentration und dem Cosolvens ab. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches sollte zwischen 4.5 und 11 , bevorzugt zwischen 5,5 und 8 liegen.
Gegebenenfalls kann dem Reaktionsgemisch zur Einstellung des pH-Wertes noch eine geeignete Säure bzw. saure Salze, wie etwa Phosphorsäure, Borsäure, Citro- nensäure, u.s.w. zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäße enzymatische Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 10 bis 60°C, bevorzugt bei 15 bis 50°C und besonders bevorzugt bei 20 bis 45°C durchgeführt.
Nach erfolgter Hydrolyse zu den gewünschten chiralen α-Hydroxycarbonsäuren, erfolgt deren Isolierung aus dem Reaktionsgemisch mittels einer bekannten Technik, wie etwa Abzentrifugieren der Zellen, Extraktion des Produktes nach Ansäuern mit HCI (z.B.: pH 2) und gegebenenfalls weitere Aufreinigung durch Aktivkohlefiltration und Umkristallisation.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden somit so polare Nitrile, wie chirale Cyanhydrine auf einfache und effiziente Weise unter milden Bedingungen in die korrespondierenden chiralen α- Hydroxycarbonsäuren überführt, wobei keinerlei Racemisierung auftritt. Die gewünschten α-Hydroxycarbonsäuren werden dabei, in Abhängigkeit vom ee-Wert des eingesetzten Cyanhydrins, in hoher optischer Reinheit von bis zu über 99% und in hohen Ausbeuten von bis zu über 98% erhalten.
Beispiel 1 : Hersteilung des Biokatalysators
Für die Herstellung der Biomasse von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wurde ein komplexes Standardmedium (Medium A, s. Tab.1) verwendet. Die Stammhaltung erfolgte auf Agar-Platten mit Medium A (Verfestigung mit 15g/l Agar). Die Platten wurden durch seitliches Umwickeln mit Parafilm verschlossen und im Kühlschrank bei 4° C gelagert.
Das Wachstum der Flüssigkulturen erfolgte in 1000ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 250ml Medium A bei 30°C und 130rpm.
Variante I (ohne Vorkultur): Etwa die Hälfte der Biomasse einer Agarplatte wurde in 5ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellsuspension wurde 250ml Kulturmedium zugesetzt.
Variante II (mit Vorkultur): Für die Vorkultur wurde etwas Biomasse einer Agarplatte in 5ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellesuspension wurde 100ml Kulturmedium zugesetzt (= Vorkultur). Nach 20-24h Wachstum wurden 5ml dieser Vorkultur je 250mL Kulturmedium zugesetzt.
Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation bei ca. 3000rpm für 30min bei 0-4°C. Die Zellen wurden einmal mit K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) gewaschen. Dann wurden die Zellen in frischem Puffer resuspendiert und entweder nach Schockfrieren lyophilisiert (Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen, Beispiel 2), oder diese Zellsuspension (ca. 6-8% des Kulturvolumens) wurde direkt für die biokatalytischen Umsetzungen verwendet (Umsetzungen mit Resting cells, Beispiel 3). Tabellel : Zusammensetzung von Medium A
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Beispiel 2: Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen im analytischen Maßstab
31.6mg, 52.6mg bzw. 105.2mg lyophilisierte Zellen wurden in 10ml Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) ca. 1 Stunde bei 130rpm und 20-25°C rehydratisiert. Je 475μl dieser Zellsuspension wurden in 1.5ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und mit 25μl einer ca. 200mM Substratlösung von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril in DMSO versetzt (3mg, 5mg bzw. 10mg Zellen/ml, S.-Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umsetzung wurde im Thermomixer bei 30°C und 1000rpm durchgeführt. Nach 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 60 und 120 Minuten wurde jeweils ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 0.5ml 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cyanhydrin, Hydroxyamid und Hydro- xysäure mittels HPLC bestimmt. Tabelle 2 Hydrolyse von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril durch lyophilisierte Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Zellen (10mg Zellen/ml; Substratkonz.: 10mM) Konzentration (mM) von Substrat, Hydroxyamid und Hydroxycarbonsäure in Abhängigkeit von der Zeit (min)
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Beispiel 3: Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von Resting cells und lyophilisierten Zellen
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte analog Beispiel 1 , Variante I, 2 Kulturkolben. Nach 20 Stunden (OD 6 = 3.5 bzw. 1.8) wurden Zellen aus je 4 mal 10ml Fermentationsbrühe abzentrifugiert und einmal mit K/Na-P04 Puffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen. Je 2 Zellproben wurden vor Aktivitätsbestimmung lyophilisiert, die anderen beiden wurden als Resting cells verwendet.
Die Zellen wurden in 1.8ml K/Na-P04 Puffer (pH 6.5, 50mM) resuspendiert (lyophilisierte Zellen wurden zur Rehydratation 1h geschüttelt). Die Reaktion wurde durch Zusatz von 200μl einer 200mM Substratlösung in DMSO gestartet ( Substrat-Konz. ca. 20mM ) und bei 30°C und 130rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min, 60min und 17h wurden 200μl entnommen und mit 200μl 1N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und Verdünnung wurden mittels HPLC die Umsätze bestimmt. Dabei wurden nur das Substrat und die beiden Produkte berücksichtigt Als Substrat wurde (R)-2-Chlormandelonitril (ee >99%) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tab. 3 dargestellt. Tabelle 3: Ergebnisse der Umsetzungen von Kultur 1 (OD5 6 3.5), Substrat: (R)-2- Chlormandelonitril
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1 : Der Umsatz des Cyanhydrins (CH) bezieht sich auf beide Produkte (Hydroxyamid und Hydroxysäure).
2: Der Umsatz des Hydroxyamides (HA) bezieht sich auf die Menge an Hydroxysäure, die aus dem vorhandenen Hydroxyamid gebildet wurde.
Beispiel 4: Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von unterschiedlichen Substratkonzentrationen
Versuch 4.1:
Bei Versuch 4.1 wurde die Reaktion im analytischen Maßstab (Reaktionsvolumen 1 ml) mit 3 Substratkonzentrationen (2.2g/l, 6.6g/l, 13.2g/l) durchgeführt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II, 21 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (ODs46 6.1). Die Zellen aus 8 mal 10ml Fermentationslösung wurden in Kulturröhrchen abzentrifugiert. Die erhaltene Zellmasse wurde einmal mit je 2ml K Na- Phosphatpuffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen. Der Inhalt von 2 Röhrchen wurde zur Bestimmung des Trockengewichtes lyophili- siert. Auswaage: 1. 37mg lyophilisierte Zellen / 10ml Fermentationslösung
2. 30mg (Diese Menge entsprach ca. dem Einsatz an Zellen/ml bei den folgenden Umsetzungen.)
Der Inhalt der restlichen 6 Röhrchen wurde in 950μl Puffer resuspendiert (OD ca. 40) und in Eppendorfers überführt. Diesen Zellsuspensionen wurden je 50μl verschieden konzentrierter Substratlösungen (3 Konzentrationen, Parallelansätze, 5% DMSO als Cosolvens) zugesetzt. Die Eppendorfers wurden am Thermomixer bei 30°C und lOOOrpm geschüttelt. Zur Umsatzkontrolle wurden jeweils 200μl entnommen und mit 200μl 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und Verdünnung wurden die Umsätze mit HPLC bestimmt. Folgende Konzentrationen (R)-2-Chlormandelonitril wurden verwendet: a. Substratlösung: 11mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250μl DMSO (ca. 260mM) Substratkonzentration im Ansatz: 2.2g/l (13.1mM) b. Substratlösung: 33mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250μl DMSO (ca. 290mM) Substratkonzentration im Ansatz: Substratkonzentration: 6.6g/l (39.4mM) c. Substratlösung: 66mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250μl DMSO (ca. 1580mM) Substratkonzentration im Ansatz: 13.2g/l (78.8mM)
Ein Vergleich der Ansätze a-c ist in Tabelle 4.1 anhand der Bildung der 2- Chlormandelsäure (in %) dargestellt. Bei allen Ansätzen wurde die Hydroxysäure quantitativ gebildet. Es zeigte sich, dass auch höhere Substratkonzentrationen problemlos akzeptiert werden.
Tabelle 4.1 : Vergleich der Ansätze a-c anhand der Bildung von (R)-2- Chlormandelsäure in %
Figure imgf000015_0001
Versuch 4.2:
Bei Versuch 4.2 wurde die Reaktion mit 2 verschiedenen Substratkonzentrationen (10g/l, 20g/l) im 5ml-Maßstab durchgeführt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II, 21 Fermentationsmedium, Ernte nach 19 Stunden (OD546 8.4). Die Zellen wurden in ca. 140ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD5 6 52). Jeweils 4.75ml dieser Zellsuspension wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet. Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallelansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 250μl Substratlösung gestartet und in Kulturröhrchen im Schüttelschrank bei 30°C und 130rpm durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle wurden jeweils 200μl entnommen und mit 200μl 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und Verdünnung wurden die Umsätze mit HPLC bestimmt.
a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250μL DMSO ( [S] = 60mM, 10g/L,
Cosolvens: 5% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet. Nach 20h war die Umsetzung quantitativ. b. 100mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250μL DMSO ( [S] = 120mM, 20g/l,
Cosolvens: 5% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 18h waren 36% Hydroxysäure gebildet. Nach 43h waren 41% Hydroxysäure gebildet, danach fand keine weitere Umsetzung mehr statt.
Versuch 4.3:
Beim Versuch 4.3 wurden Umsetzungen mit 10g/I und 15g/l (r?)-2-Chlormandelonitril durchgeführt. Weiters wurde nach vollständigem Umsatz der ee der gebildeten Hydroxysäure bestimmt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 Variante II, 2.75I Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 200ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD5 6 44). Jeweils 4.85ml dieser Zellsuspension wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.
Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallelansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 150μl Substratlösung gestartet und in Kulturröhrchen im Schüttelschrank bei 40°C und 150rpm durchgeführt. Die Umsatzkontrolle erfolgte mittels HPLC. Bei vollständigem Umsatz wurde die Hydroxysäure nach Ansäuern extrahiert und der ee bestimmt.
a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 150μl DMSO ( [S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens: 3% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). b. 75mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 150μl DMSO ( [S] = 90mM, 15g/l, Cosolvens: 3% DMSO).
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren ca. 60% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee = 99%).
Beispiel 5: Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung unterschiedlicher Co- solventien
Versuch 5.1:
Bei Umsetzungen im 50ml-Maßstab wurde DMSO mit EtOH als Cosolvens verglichen. Es wurde 5% Cosolvens verwendet, die Substratkonzentration betrug jedoch nur 4g/l (R)-2-Chlormandelonitril.
Biomasse aus 8 mal 250ml (abzüglich 80ml, s. Versuch 4.1) Fermentationsmedium (OD ~ 6.1) wurde nach 20h geerntet. Die Zellen wurden in 100ml K/Na- Phosphatpuffer (pH 6.5, 50mM) suspendiert. Diese Zellsuspension (OD 60) wurde für die enzy- matischen Umsetzungen verwendet. Die Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in DMSO oder EtOH wurden in 100ml Schlifferienmeyerkolben bei 150rpm und 30°C durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200μl Probe mit 200μl 1 N HCI versetzt, zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.
a . 50mL Zellsuspension wurden mit 200mg (f?)-2-Chlormandelonitril (>99%) gelöst in 2300μl DMSO und 200μl 0.1% H3P04, versetzt. Substratkonzentration: 4g/L (24mM), 5% DMSO als Cosolvens Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure : 97% b. 50mL Zellsuspension werden mit 200mg (R)-2-Chlormandelonitril (>99%) gelöst in 2300μl EtOH und 200μl 0.1% H3P04, versetzt. Substratkonzentration: 4g/l (24mM), 5% EtOH als Cosolvens Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure: >99%
Versuch 5.2:
Hier wurden die Lösungsmittel DMSO, EtOH und 'PrOH wieder mit einem Anteil von 5% verwendet, die Substratkonzentration betrug 10g/l (R)-2-Chlormandelonitril. Die Reaktion wurde im 5ml-Maßstab durchgeführt.
Die Herstellung des Biokatalysators Beispiel 4, Versuch 4.2 (ODs 6 8.4). Jeweils 4.75ml der Zellsuspension (Resting cells, OD546 52) wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril (>99%) gelöst in DMSO, EtOH und i-PrOH wurden in Kulturröhrchen bei 150rpm und 30°C durchgeführt (Parallelansätze).
Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200μl Probe mit 200μl 1 N HCI versetzt, zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.
a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250μl DMSO ( [S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens: 5% DMSO)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet. Nach 20h war die Umsetzung quantitativ (Produkt-ee = 95%).
b. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250μl EtOH, ( [S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens: 5% EtOH)
Bereits nach 30 Minuten ist das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h sind 35% Hydroxysäure gebildet, nach 19h ist die Hydrolyse zur Hydroxysäure zu 94% abgeschlossen, nach 28h ist die Umsetzung praktisch vollständig (Produkt-ee =
97%).
c. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250μl /-PrOH, ( [S] = 60mM, 10g/l, Cosolvens: 5% /-PrOH)
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h waren 8% Hydroxysäure gebildet, nach 44h waren 64 % Hydroxysäure gebildet (Produkt-ee = 92.3)
Beispiel 6: Enzymatische Hydrolyse bei unterschiedlichen Temperaturen
Versuch 6.1:
Bei Versuch 6.1 wurde der Reaktionsverlauf bei Reaktionstemperaturen von 30°C, 35°C, und 40°C verglichen. Die Ansätze wurden im 5ml-Maßstab mit einer Substratkonzentration von 10g/l (R)-2-Chlormandelonitril durchgeführt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 4, Versuch 4.2, (OD546 8.4). Jeweils 4.75ml der Zellsuspension (Resting cells, OD546 52) wurden für die en- zymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von 50mg (R)-2- Chlormandelonitril (>99%) ( [S] = 60mM, 10g/l), gelöst in 250μl DMSO (5%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30°C, 35°C, 40°C) in Kulturröhrchen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).
Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200μl Probe mit 200μl 1 N HCI versetzt, zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid. umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach ca. 20h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 95%).
b. T = 35°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 65% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 96.5%).
c. T = 40°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 86% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 97.9%).
Versuch 6.2:
Bei Versuch 6.2 wurde die Temperatur bis auf 50°C erhöht.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 4, Versuch 4.3 (OD5 6 44). Jeweils 4.85ml der Zellsuspension (Resting cells, OD546 44) wurden für die en- zymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von 50mg (R)-2- Chlormandelonitril (>99%) ( [S] = 60mM, 10g/l), gelöst in 150μl DMSO (3%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30°C, 40°C, 50°C) in Kulturröhrchen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).
Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200μl Probe mit 200μl 1 N HCI versetzt, zentrifugiert (5min, 13.000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%).
b. T = 40°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%).
c. T = 50°C
Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 92% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%).
Beispiel 7: Umsetzungen von Cyanhydrinen von Aldehyden mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Maßstab
Für alle Umsetzungen wurde K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) verwendet. Die Reaktionsverfolgung erfolgte mit HPLC. Nach Probenahme wurde zum Abstoppen der biokatalytischen Reaktion mit Probenvolumen 1 N HCI versetzt (Parallelproben). Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) wurde mit HPLC-Laufmittel verdünnt.
Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 30min bei 4°C und 3000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1 N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert. Versuch 7.1:
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II. 31 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (ODs46 5.9). Die Zellen wurden zu ca. 180ml in Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 80).
0.6g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%), gelöst in 1.5ml DMSO wurden 60ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 30°C und 150rpm im Schüttel- schrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 17 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 0.73g (109%) Produkt-ee: >99%
Versuch 7.2:
In Versuch 7.2 wurden einige Reaktionsparameter variiert. Als Standardbedingungen galten lOg/l Substrat und DMSO als Cosolvens (hier 2.5%). Ein zweiter Ansatz wurde mit 15g/l Substrat durchgeführt, ein weiterer mit 10g/I Substrat und DMF als Cosolvens.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II. 31 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (ODs46 6.8). Die Zellen wurden zu ca. 190ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 69). Drei Umsetzungen wurden durchgeführt.
Ansatz A: 0.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750μl DMSO wurden 30ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 0.31g (93%) Produkt-ee: >99% Ansatz B: 0.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750μl DMF wurden 30ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 0.30g (90%) Produkt-ee: 98.5%
Ansatz C: 0.45g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750μl DMSO wurden 30ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure praktisch vollständig. '
Rohausbeute: 0.45g (90%) Produkt-ee: >99%
Versuch 7.3:
Hier wurden 2 Ansätze mit verschieden großer Substratkonzentration (Ansatz A 10g/I, Ansatz B 15g/l) durchgeführt. Beide Umsetzungen verliefen nahezu gleich rasch und waren nach 2 Stunden vollständig.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II. 31 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 1.2). Die Zellen wurden in ca. 180ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 70). Zwei Umsetzungen wurden durchgeführt.
Ansatz A: 0,8g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 1.6ml DMSO wurden der Zellsuspension (80ml) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 0.85g (95%) Produkt-ee: >99%
Ansatz B: 1.2g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 1.6ml DMSO wurden der Zellsuspension (80ml) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 1.26g (94%) Produkt-ee: 98.9%
Versuch 7.4:
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II, 2.5I Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6.9). Die Zellen wurden in ca. 160ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 63).
1.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 2.5ml DMSO wurden 140ml dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 3 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig. Rohausbeute: 1.43g (98%) Produkt-ee: >99%
Versuch 7.5:
Bei dieser Umsetzung wurde 1g Mandelonitril bei einer Substratkonzentration von 8g/l zur entsprechenden Hydroxysäure hydrolysiert.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 , Variante II, 21 Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 8.4). Die Zellen wurden in ca. 120ml Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 74). Die Umsetzung wurde nach Tieffrieren des Biokatalysators über Nacht durchgeführt. 1.0g (R)-(+)-Mandelonitril, gelöst in 2.4ml DMSO wurde der Zellsuspension (120ml) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-Mandelsäure vollständig. Rohausbeute: 1.16g (100%) Produkt-ee: 93%
Beispiel 8: Umsetzungen von Cyanhydrinen von Ketonen mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Maßstab
Es wurde en K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) verwendet. Die Reaktionsverfolgung erfolgte mit DC.
Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 20min bei 4°C und 6000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1 N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert.
Die Herstellung des Biokatalysators erfolgt gemäß Beispiel 1 , Variante II, 2L Fermentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 60mL Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 60).
300mg (S)-Acetophenoncyanhydrin (25% Acetophenon, ee 94%), gelöst in 1mL DMSO wurden der Zellsuspension zugesetzt. Nach 20h war die Umsetzung It. DC vollständig und das Produkt (enthält 1-Phenylethanol und Spuren anderer Verunreinigungen) wurde extrahiert. Die Umsetzung verlief ohne Verlust an Enantiomeren- reinheit. Rohausbeute: 357mg Beispiel 9: Erzeugung von Enzympräparationen von Nitrilhydratase und Amidase zur Hydrolyse substituierter Cyanhydrine mittels rekombinanter Expression in E. coli
Zur Expression der Nitrilhydratase, sowie zur Expression der Amidase wurde das pMS470-Plasmidsystem herangezogen. Dieses Plasmid verfügt neben den replikati- ven Elementen, einer selektionierbaren Ampicillin-Resistenz und dem Lac- Repressor-Gen lad über einen induzierbaren tac-Promotor, welcher eine gesteuerte Überexpression der einklonierten offenen Leserahmen erlaubt.
Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Nitrilhydratase:
Die Plasmidkarte ist in Abbildung 1 zu sehen. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pMS470Nhse7.3. Es enthält neben den beiden Genabschnitten der Nitrilhydratase (α- und ß-Untereinheit) noch einen dritten offenen Leserahmen, welcher für ein Aktivatorprotein codiert.
Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 A- midase:
Anders als bei der Nitrilhydratase ist für die Expression der Amidase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 nur ein einziger Leserahmen notwendig und dieser wurde im Plasmid pMS470-33/3/1/11 hinter dem tac-Promotor einkloniert. Die Abbildung 2 zeigt die Plasmidkarte dieses Konstruktes.
Fermentation der rekombinanten Nitrilhydratase und Amidase
Die Fermentation der beiden Enzyme erfolgte grundsätzlich nach dem allgemeinen Protokoll, ausgearbeitet für die Überexpression von Enzymen im pMS470 System.
Dabei wurde:
-aus einer Über-Nacht-Kultur (ONC) in eine Hauptkultur mit LB-Medium und Antibiotikum im Schüttelkolben überimpft. -bis in die exponentielle Phase anwachsen gelassen
-bei OD6oo (Optische Dichte bei 600nm) 0.8 bis 1.5 mit IPTG (Isopropylthiogalactopy- ranosid) induziert
-für 18h weiter induziert (Proteinexpression)
-geerntet (Zentrifugation) und aufgeschlossen (Ultraschall)
Expression der Nitrilhydratase
Die mit pMS470Nhase7.3 (bzw. pMSNhasetactac7.3) transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB-Ampicillin-Platten vereinzelt und eine ONC von 100ml LB- Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft. Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250ml LB-Ampicillin Medium in einem 1000ml Schikanenkolben auf eine OD6oo von 0.01 bis 0.03 (Beckmann Photometer) beimpft. Die Wachstumstemperatur wurde auf 25°C eingeregelt, da bei höheren Temperaturen ausschließlich die Bildung von unlöslichen Einschlußkörperchen erfolgt. Nach Erreichen der Induktionsdichte
Figure imgf000027_0001
Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz von IPTG zu einer Konzentration von 0.1 mM induziert. Zusätzlich wurden die Medien mit 0.1 mM Ammoniumeisen(lll)citrat supplementiert. Nach Erreichen einer OD6oo>4 wurden die Kulturen geerntet (Zentrifugation bei ca. 3000*g für 15min) und einmal mit ca.100ml PBS-Puffer gewaschen. Das Zellpellet wurde im Anschluß in PBS-Puffer resuspendiert (ca. 5ml Gesamtvolumen) und mit einer Ultraschallsonde (BRANSON Sonifier 250, 60% Leistungseinstellung, Konstantbeschallung; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Kühlung) aufgeschlossen (Visuelle Kontrolle der Vollständigkeit unter dem Mikroskop). Die so erhaltenen Rohlysate besaßen eine typische Aktivität von ca. 100-250 U/ml (ca. 350-500U/ml für pMSNhasetactac7.3), analysiert mit Methacrylonitril als Substrat unter den nachfolgend angeführten Bedingungen. Zur Konservierung wurden die Lysate bei -20°C gelagert. Lagerung bei Raumtemperatur ist mit einem schnellen Verlust an Aktivität verbunden.
Aktivitätsbestimmung: Rohlysate wurden unmittelbar vor der Aktivitätsbestimmung 1 :10 mit PBS-Puffer verdünnt. 1.4ml einer 40mM Methacrylonitril Lösung in PBS- Puffer wurden mit 20 μl des verdünnten Lysats versetzt und bei 28°C inkubiert (Ep- pendorf Thermomixer 5436). Zum Zeitpunkt 0, 1 , 2, 5, 10 und 15 Minuten wurden 200μl Proben entnommen und unmittelbar mit 800μl 0.17% Phosphorsäure die Enzymreaktion in diesen Proben gestoppt. Nach Zentrifugation (16000*g, 10 Minuten) wurden die Proben spektrophotometrisch ( Perkin Eimer UVΛ/IS-Spekrometer Lambda Bio) bei 224nm vermessen. Der Anstieg der Extinktion wurde mit der Zunahme der Konzentration an Methacrylamid korreliert, wobei ein ε-Wert von 0,57 l*mmo 1*crτϊ1 herangezogen wurde.
Expression der Amidase
Die mit pMS470-33/3/1/11 transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB- Ampicillin-Platten vereinzelt und eine ONC von 100ml LB-Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft. Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250ml SOC-Ampicillin Medium in einem 1000ml Schikanenkolben auf eine OD6oo von 0.01 bis 0.03 (Beckmann Photometer) beimpft. Die Wachstumstemperatur wurde auf 30°C eingeregelt, da die Fermentation bei 37°C ausschließlich zur Bildung von unlöslichem und inaktiven Protein führt. Nach Erreichen der Induktionsdichte (OD6oo=1 Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz von IPTG zu einer Konzentration von 0.3mM induziert. Nach einer Induktionszeit von 16h wurden die Zellen geerntet (Zentrifugation 3000*g, 10min) und mit Natriumphospatpuffer (0.1 M, pH=7) gewaschen. Das gewonnene Pellett wurde auf ca. 5ml Gesamtvolumen im Waschpuffer resuspendiert und mit einer Ultraschallsonde (BRANSON Sonifier 250, 60% Leistungseinstellung, Konstantbeschallung; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Kühlung) unter ständiger Kühlung bis zur Vollständigkeit aufgeschlossen (Visuelle Kontrolle der Vollständigkeit unter dem Mikroskop). Die derart gewonnenen Rohlysate wurden zur Konservierung bei -20°C eingefroren. Die Lysate besaßen eine Aktivität von ca. 75 U/ml, bestimmt mit Acetamid (40mM) als Substrat in PBS-Puffer bei 37°C
(Bestimmung von freigesetztem Ammonium nach der Indophenolblau-Methode).
Bestimmung der Amidaseaktivität :
Folgende Lösungen wurden verwendet:
Substratlösung: 40 mM Acetamid in PBS
Lösung A: 10% (w/v) Phenol in Ethanol (95%)
Lösung B: 0.5% (w/v) Nitroprussidnatrium in ddH20
Lösung C: 100g tri-Natriumcitrat and 5g of Natriumydroxid in 550 ml Wasser
Lösung D: 600ml handelsübliche Natriumhypochlorit-Lösung verdünnt auf 1000ml
Ammoniumstandards: 0, 80, 120, 200, 280, 400μg/l Ammoniumsulfat in Wasser
1.4ml Substratlösung wurden mit 10μl Enzymverdünnung (1 :10 in PBS) bei 30°C inkubiert (Eppendorf Thermomixer 5436). In 100μl Proben wurden nach 0, 1 , 2, 5, 10 und 15 Minuten mit20μl Lösung A die Enzymreaktion gestoppt. Nach Entnahme der letzten Probe wurden die so erhaltenen Lösungen mit 400μl Wasser verdünnt. Zur Kalibrierung wurden weiters Ammoniumstandard-Lösungen (je 500ml) mit 20μl Lösung A vesetzt. Zu Proben sowie Standards wurden darauf 20μl der Lösung B und 50μl eines Gemisches von 4 Teilen Lösung C mit 1 Teil Lösung D zupippettiert. Gute Durchmischung wurde durch Vortexen sichergestellt. Die so behandelten Proben und Standards wurden bei 37°C für 15min belassen. Die entstandene Blaufärbung wurde nach Verdünnung aller Proben und Standards 1 :10 mit Wasser im Spektrophotome- ter (Perkin Eimer UV/VIS-Spektrometer Lambda Bio) bei 640nm quantifiziert. Durch Korrelation der Zunahme der Blaufärbung über die Zeit mit den Extinktionswerten der Standards konnte auf die Aktivität (μMol freigesetztes Ammonium pro Minute) rückgerechnet werden. Beispiel 10: Hydrolyse unter Verwendung des rekombinanten Enzyms
Bei diesen Umsetzungen wurde klonierte Nitrilhydratase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 als Rohlysat des E. coli Klons 7.3 (hergestellt gemäß Beispiel 9) verwendet.
Durchführung:
50μL Rohlysat wurden mit 425μL Puffer (K/Na-P04-Puffer, pH 7, 50mM) verdünnt und mit 25μL einer ca. 200mM Substratlösung in DMSO versetzt (5mg Protein/mL S.-Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umsetzung wurde im Thermomixer bei 30°C und 1000rpm durchgeführt. Nach 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 60 und 120 Minuten wurde jeweils ein Eppendorfer mit 0.5mL 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13.000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cyanhydrin und Hydroxyamid mittels HPLC bestimmt. Die Aktivität der Nitrilhydratase wurde anhand der Geschwindigkeit der Bildung des Hydroxyamides ermittelt (Steigung im Anfangsbereich). Als Standardsubstrat (100% Aktivität) wurde 2-Hydroxy-4- phenyl-butyronitril verwendet. Die Aktivität bei der Hydrolyse der anderen Substrate wurde mit der Aktivität an 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril verglichen (Tab. 5).
Ergebnisse:
Die Aktivität der Nitrilhydratase im Rohlysat des E. coli Klons 7.3 bei der Hydrolyse von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril betrug ca. 0.3umol*mg"1*min"1. In Tabelle 5 ist ein Aktivitätsvergleich an den verschiedenen Substraten dargestellt. Tabelle 5: Vergleich der Aktivität der Nitrilhydratase aus dem E. coli Klon 7.3 an den verschiedenen Substraten.
Figure imgf000031_0001
Umsetzung von (/?)-2-Chlormandelonitril im halb-präparativen Maßstab
50mL eines Rohlysates der klonierten Nitrilhydratase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 (E. coli Klon 7.3, hergestellt gemäß Beispiel 9) wurden mit 100mL Puffer (K/Na-P04-Puffer, 50mM, pH 6.5) verdünnt. Nach Zusatz von 1.0g (R)-2- Chlormandelonitril (ee>99%) in 1.5mL DMSO wurde die Suspension bei 150rpm und 30°C geschüttelt. Nach vollständigem Umsatz wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und das Produkt wurde 4 Tage mit CH2CI2 kontinuierlich extrahiert, ee des Rohproduktes: >99% Ausbeute nach Reinigung: 0.91g (82%)

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von chiralen α-Hydroxycarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass (R)- oder (S)-Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R)- oder (S)- α-Hydroxycarbonsäuren überführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass (R)- oder (S)- Cyanhydrine als Edukte eingesetzt werden, die durch enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe and die entsprechenden aliphatischen, aromatischen oder heteroaromatischen Aldehyde oder Ketone erhalten werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass (R)- oder (S)- Cyanhydrine der Formel
HO CN
R1 X R2 /,) in der R1und R2 unabhängig voneinander H, einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten Cι-C6-Alkyl- oder -Alkenylrest oder einen gegebenenfalls ein- oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten Phenyl- rest bedeuten, mit der Maßgabe, dass R1 und R2 nicht beide H sind, eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 in Form von gemahlenen Zellen, rohen oder gereinigten Enzymen, rekombinanten Enzymen, immobilisierten Zellen oder Enzymen, lyophilisierten Zellen oder von „resting cells" eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 in einem wässrigen Medium suspendiert wird und die so erhaltene Suspension mit dem entsprechenden chiralen Cyanhydrin in Gegenwart eines Lösungsvermittlers als Cosolvens versetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsvermittler organische Lösungsmittel, Tenside oder Phasentransferkatalysatoren eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches Lösungsmittel DMSO, DMF, Cι-C6-Alkohole, TMBE oder Gemische derselben eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Cosolvensanteil zwischen 0,5 und 20Vol% bezogen auf das Gesamtvolumen der Reaktionslösung liegt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 4.5 und 11 liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse bei einer Temperatur zwischen 10 und 60°C durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als rekombinantes Enzym ein durch Expression des pMS470-Plasmidsystems in einer geeigneten Wirtszelle erhaltenes Enzym eingesetzt wird.
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