WO1998027222A1 - Verfahren zur herstellung von d-prolinderivaten - Google Patents

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WO1998027222A1
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Martin Sauter
Daniel Venetz
Oleg Werbitzky
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to new microorganisms which are capable of a proline derivative in the form of the racemate or its optically active isomers of the general formula
  • R 1 is alkyl, acyl or hydrogen
  • R 2 is hydrogen or hydroxy
  • R is -NH 2 , aryloxy, or alkoxy to be used as the only nitrogen source, the only carbon source or the only carbon and nitrogen source.
  • D-proline and its derivatives are important intermediates for the manufacture of pharmaceuticals (J Org Chetn, 1994, 59, 7496 - 7498)
  • JP-A-92183399 describes a process for the preparation of D-proline starting from (DL) -proline using microorganisms of the genus Candida or Trichospora Dies
  • JP-A-07127354 describes a process for the preparation of D-proline starting from ornithine by means of microorganisms of the species Proteus mitajiri.
  • a disadvantage of this process is that on the one hand the educt ornithine is too expensive, and on the other hand that D-proline in poor yield is obtained
  • JP-A-07289275 describes a process for the preparation of D-proline starting from L-proline.
  • L-proline is racemized by means of microorganisms of the genus Escherichia, which have racemase activity, to (DL) -proline, which is then raced with L -Proline-degrading microorganisms are cultivated in order to obtain D-proline.
  • DL genus Escherichia
  • L-Proline-degrading microorganisms are cultivated in order to obtain D-proline.
  • a disadvantage of this process is that the D-proline obtained in this way has to be purified further and this is associated with high losses in yield
  • DE-A-43 30 678 encompasses a process for the preparation of N-carbamoyl-D-proline starting from a bicyclic hydantoin.
  • the bicyclic hydantoin is converted to N-carbamoyl-D-proline by means of the microorganisms Agrobacterium radiobacter the disadvantage that the reaction time is too long, and on the other hand that the corresponding D-proline derivative is only obtained in moderate yield
  • the object of the present invention is to isolate microorganisms which can be used for a simple and technically viable process for the preparation of D-proline derivatives of the general formulas II and VI.
  • the corresponding products should be isolated in good yield with good enantiomeric purity
  • microorganisms according to the invention can be isolated from soil samples, sludge or waste water with the aid of customary microbiological techniques. According to the invention, these microorganisms are isolated in such a way that they are present in a medium containing a proline derivative of the general formula I in the form of the racemate or one of its optically active isomers
  • the radical R 1 in the proline derivative of the general formula I means alkyl, acyl or hydrogen.
  • the radical R 2 means hydrogen or hydroxy.
  • the radical R means -NH 2 , alkoxy or aryloxy
  • Alkyl is hereinafter referred to a C ⁇ alkyl group, substituted or unsubstituted, as defined Suitable substituents are for example halogen, in particular fluorine, chlorine and bromine, and examples of an unsubstituted hydroxy C ⁇ - 5 alkyl group are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl , Isobutyl, Tertiarbutyl, Pentyl, Isopentyl, (Isoamyl) Examples of a substituted C ⁇ - 5 alkyl group are chloromethyl, trifluoromethyl, 2-bromopropyl and hydroxymethyl
  • Acyl is defined below as acetyl, formyl, propionyl, butyryl, pentyryl, benzoyl or phenylacetyl
  • Alkoxy is defined below as a C] - 5 alkoxy group, substituted or unsubstituted. Suitable substituents are, for example, the substituents mentioned above for alkyl. Examples of an unsubstituted C] - 5 alkoxy group are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, pentoxy , Isopentoxy or Isobutoxy Examples of a substituted C 5 alkoxy group are trifluoromethoxy, chloromethoxy, 2-chloropropoxy and hydroxymethoxy
  • Aryloxy is defined below as benzyloxy and phenyloxy
  • the microorganisms can use, for example, sugar, polyols, peptones, carboxylic acids or amino acids as a growth substrate as a suitable carbon source.
  • Hexoses such as glucose or fructose
  • pentoses such as xylose
  • disaccharides such as maltose or sucrose
  • glycols, glycerol, sugar alcohols such as mannitol can be used as polyols
  • Sorbitol or inositol can be used.
  • the carboxylic acids used are di- or tricarboxylic acids or their salts, such as, for example, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, azelaic acid, sebacic acid, maleic acid, fumaric acid, sorbic acid, 1,2, citric acid, agaric acid 3- propanetricarboxylic acid, citrate, fumarate, oxalate or malate
  • amino acids or their salts all proteinogenic amino acids or their salts, such as aspartic acid, glutamic acid, aspartate, glutamate, glutamine, asparagine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, Tryptophan, phenylalanine, methioni n, glycine, serine, tyrosine, threonine, cysteine, histidine, arginine can be used
  • a sugar or sugar alcohol is preferably used as the
  • the microorganisms can use, for example, ammonium compounds or amino acids or their amides as a suitable nitrogen source.
  • ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate or ammonium acetate can be used as the ammonium compound.
  • the amino acid can be alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, glycine, serine , Tyrosine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, lysine, arginine or histidine.
  • Appropriate representatives of the amino acid amides are prolinamide, alanine amide, glycinamide, serine amide and valine amide
  • Pipecolinic acid amide can be used as the piperidinecarboxylic acid amide, nicotinic acid amide as the pyridinecarboxylic acid amide and lactic acid amide as the hydroxycarboxylic acid amide
  • the selection and cultivation medium which can be used are those customary in the art, for example that described in Table 1
  • the active enzymes of the microorganisms are expediently induced during the cultivation and selection.
  • L- and DL-lactic acid amide or their N-methylated derivatives such as N-methyl-L-lactic acid amide and N, N-dimethyl-L-lactic acid amide can preferably be used as the enzyme inducer the L-enantiomer used
  • the inductor concentration is expediently between 0.05 and 10 g / 1, preferably between 0.5 and 3 g / 1
  • the cultivation and selection is usually carried out at a temperature of 10 to 40 ° C., preferably 25 to 35 ° C. and at a pH between pH 4 and pH 10, preferably between pH 6 and pH 8
  • Preferred microorganisms are L-proline-utilizing the genus Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia or Pseudomonas
  • microorganisms of the species Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens or Aureobacterium sp LS10 (DSM 10203), as well as their functionally equivalent variants and mutants isolated The microorganisms Aureobacterium sp LS10 were deposited on 29 August 1995 with the DSM-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroderweg 1 b, D-38124 Braunschweig, according to the Budapest contract
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms or enzymes which have essentially the same properties and functions as the original microorganisms or the enzymes obtained from them. Variants and mutants of this type can be formed accidentally, for example by UV radiation become
  • the enzymes according to the invention the L-prolinester hydrolases or L-prolinamide hydrolases, which are capable of hydrolyzing proline derivatives of the formula I can be obtained, for example, by digestion of the microorganisms which is customary in the art.
  • the ultrasonic, French press or Lysozyme method can be used
  • an L-proline derivative of the general formula is expediently used
  • racemized can either be carried out in a known manner, for example in accordance with EP-A-0 057 092, or the racemization takes place in a strongly alkaline environment
  • the second stage, the esterification, the production of amides or the alkylation or acylation on the nitrogen atom, of the racemic proline derivative to the proline derivative of the general formula I is likewise carried out in a manner known per se.
  • the esterification can be carried out by reaction with an alcohol in accordance with the organic agent, 1976 , S 498ff, the preparation of the amides, for example by ammonolysis with ammonia according to Organikum, 1976, S 509ff, the alkylation on the nitrogen atom by reacting, for example, with an alkyl halide
  • microorganisms of the genus Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia or Pseudomonas described above are particularly suitable for the method.
  • the microorganisms of the genus Aureobacterium such as Aureobacterium sp LS10 (DSM 10203) or its functionally equivalent variants and mutants are suitable for the biotransformation
  • the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells which no longer require a carbon and energy source) or with growing cells.
  • the biotransformation is preferably carried out with resting cells
  • biotransformation media customary in the art can be used, such as, for example, low-molar phosphate buffers, Tris buffers, or the medium described in Table 1.
  • the biotransformation is preferably carried out in the medium in accordance with Table 1
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of the proline derivative of the formula I in such a way that the concentration does not exceed 40% by weight, preferably 20% by weight
  • the pH of the medium can be in a range from 4 to 10, preferably in a range from 5 to 8.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C.
  • the biotransformation can be carried out in the absence of the alcohols formed in the prolinester hydrolysis, preferably in the absence of ethanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol, isopentyl alcohol (isoamyl alcohol) and benzyl alcohol.
  • the corresponding alcohols can be removed, for example, by adsorption
  • the process is preferably carried out without isolation of the racemic proline derivative of the formula V.
  • the proline derivatives according to formula VI are prepared by hydrolysis of the proline derivatives according to formula II.
  • the hydrolysis is carried out in a manner customary in the art, for example according to Organikum S 476 and S 477
  • Vitamin solution 1.0 ml / 1 pH 7.0
  • Fructose (5 g / 1) was added as a carbon source (C source).
  • C source carbon source
  • N source nitrogen source
  • Different batches were then inoculated with soil samples from different locations and incubated (30 ° C, 120 rpm) until clearly visible growth was evident. An aliquot of this culture was then inoculated into an equal volume of fresh medium and incubated again until it became cloudy This process was repeated three times.
  • the enriched microorganisms were then separated and purified on a solid medium (same composition as liquid medium, only addition of 20 g / 1 agar agar). In this way, more than 20 different bacterial isolates were obtained which were capable of prolinamide to be used as the only N source
  • Example 2 Example 2:
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 were propagated in the medium described there, but using L-prolinamide (1 g / 1) as an N source and a small amount of yeast extract (0.2 g / 1)
  • the cells thus produced were harvested by centrifugation and then resuspended in buffer solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) and washed. After resuspending in buffer again, the ability to hydrolize L-prolinamide was tested with resting cells.
  • Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens and Aureobacterium sp were found with a high enantioselectivity
  • Aureobacterium sp LS 10 was grown in the minimal medium described in Table 1 with glucose (10 g / 1) as the C source and some yeast extract (0.2 g / 1).
  • Various N sources (2 g / 1, except peptone 10 g / l) were added, such as amino acids and acid amides.
  • Cultures which achieved a good cell density (OD 50 > 0.5 in 48 h) were analyzed for their enzymatic activity (hydrolysis of L-proline butyl ester). The activity after cultivation with L-prolinamide as the N source was used as the 100% value Table 2
  • Aureobacterium sp LS10 was able to use a wide variety of C sources, but preferred sugar and sugar alcohols. The enzymatic activity was only influenced when amino acids were used as C sources (see Table 3)
  • Aureobacterium sp LS10 was grown in the minimal medium described in Table 1 with yeast extract (2 g / 1) as the N source and glucose (10 g / 1) as the C source. In addition, the cultures were grown after reaching a sufficient cell density their enzymatic activity (hydrolysis of L-proline butyl ester) was analyzed, L-lactic acid amide or other compounds structurally related to L-lactic acid amide were added (each 1 g / 1) to test their potency as an inducer of L-proline ester hydrolase In addition to the racemate of lactic acid amide, only the N-methylated derivatives of L-lactic acid amide showed an inducing effect (see Table 4) Table 4 Enzymatic activity of Aureobacterium sp. LSIO when grown with various potential inductors
  • Aureobacterium sp LSIO was grown as described under 4a).
  • L-lactic acid amide, DL-lactic acid amide or N-methyl-L-lactic acid amide was used as an inducer in various concentrations and, after reaching a good cell density, the enzymatic activity (hydrolysis of L-proline butyl ester) was determined .
  • the enzymatic activity at 1 g / 1 L-lactic acid amide was used as a 100% value
  • N-methyl-L-lactic acid amide reaches an activity plateau, since the rate of hydrolysis is likely to be significantly reduced.
  • N-methyl-L-lactic acid amide is only effective at higher concentrations than L-lactic acid amide, made possible at the optimum (3.0 g / 1 ) but higher enzymatic activity
  • Aureobacterium sp LSIO was grown in the minimal medium described in Table 1 with glucose (10 g / 1) as the C source, L-lactic acid amide (2 g / 1) as the N source and some yeast extract (0.2 g / 1) Cultured After reaching a sufficient cell density, the culture was harvested, the cells were washed and resuspended in saline solution (0.9%). Aliquots of this bacterial suspension were tested for their hydrolysis activity against L- or D-proline butyl ester by varying various parameters
  • the enzymatic activity of the L-prolinester hydrolase is largely temperature-dependent. An increase in temperature by 15 ° C leads to a quadrupling of the activity. Increasing pH also leads to increased activity, but only to a relatively small extent. Increasing the cell density is almost proportional Achieving increased activity.
  • the stereoselectivity is largely independent of temperature. The most important parameter here is the pH value, which should be as low as possible. A high cell density also contributes slightly to improved selectivity. This experiment shows that at low pH, high cell density and high temperature the best compromise between enzymatic activity and stereoselectivity can be achieved
  • Example 6 For this purpose, Aureobacterium sp LSIO in the minimal medium described in Table 1 with glucose (10 g / 1) as the C source, L-lactic acid amide (2 g / 1) as the N source and some yeast extract (0.2 g / 1 ) attracted After reaching a sufficient cell density, the culture was harvested, the cells were washed and resuspended in saline solution (0.9%). The enzymatic activity against various L- or D-proline esters was then determined.
  • the hydrolysis was determined as 100% of L-proline butyl ester used at pH 7.0
  • the stereoselectivity of the enzyme was determined on the basis of the ratio of the activity towards the L-proline esters and the corresponding D-proline esters n determined (E value)
  • FIG. 3 shows the enzymatic activity of the L-proline ester hydrolase with various L-proline esters as a function of the pH
  • Proline isopropyl ester which had proven to be the cheapest substrate, was to be used to investigate which product concentrations can be achieved.
  • Aureobacterium sp LSIO was used in the minimal medium described in Table 1 with glucose (10 g / 1) as the C source, L-lactic acid amide (2 g / 1) as N source and some yeast extract (0.2 g / 1) grown. After reaching a sufficient cell density, the culture was harvested. The cells were then washed in saline solution (0.9%) and finally resuspended therein The test was carried out with DL-proline isopropyl ester as a substrate in various concentrations, while the other parameters were kept constant (25 ° C., pH 6.0, OD 650 ca 15). At different times, aliquots were taken, which were determined by HPLC to determine their content D- and L-proline isopropyl esters were analyzed
  • Aureobacterium sp LSIO was in a Chemap fermenter (working volume 5 1) in minimal medium (see Tab 1) with glucose (30 g / 1) and L-lactic acid amide (4 g / 1) as a C or N source at 30 ° C grown In order to facilitate the growth of the cells, the medium also contained a small amount of yeast extract (0.7 g / 1). During the course of the cultivation, further L-lactic acid amide was added as required by the cells until a sufficiently high cell density (OD 650 ca 23) and a good specific enzyme activity (> 1.2 ⁇ mol L-proline butyl ester hydrolyzed / min x OD 650 ) was achieved.
  • Aureobacterium sp LS10 was in a Chemap fermenter (working volume 2 1) in mineral medium (see Tab 1) with glucose (20 g / 1) as a C source and yeast extract (15 g / 1) as a N source at 30 ° C dressed In addition, the medium contained N-methyl-L-lactic acid amide (3 g / 1) as an inducer. After reaching a sufficient cell density (OD 650 ca 30), the cells were harvested by centrifugation After washing and resuspending in saline solution, the cells had good activity (approx.
  • racemic proline 160 g (1.39 mol) of L-proline was dissolved in 600 ml (10.49 mol) of acetic acid and 20 g (277 mmol) of butanal were added. This solution was dissolved in a
  • proline could also be racemized in an alkaline aqueous solution (see part of the one-pot reaction in 10 3)
  • DL-proline isopropyl ester from L-proline can also be prepared in a one-pot process.
  • 80 g (695 mmol) of L-proline in 26 ml of 4 N NaOH (104 mmol ) and 148.5 g of water was dissolved.
  • This solution was then heated in an autoclave to 160 ° C., a pressure of about 5 bar being reached, and kept at this temperature for 14 hours.
  • the water was then passed through as well as possible Distillation removed, using the effect of azeotropic distillation after the addition of 250 ml of isopropanol to remove residual amounts of water.

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Abstract

Beschrieben werden neue Mikroorganismen, die befähigt sind ein Prolinderivat in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere der allgemeinen Formel (I), worin R1 Alkyl, Acyl oder Wasserstoff, R2 Wasserstoff oder Hydroxy und R3 -NH2, Aryloxy, oder Alkoxy bedeutet, als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten. Diese Mikroorganismen werden für neue Verfahren zur Herstellung von D-Prolinderivaten eingesetzt.

Description

Verfahren zur Herstellung von D-Prolinderivaten
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die befähigt sind, ein Prolinderivat in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere der allgemeinen Formel
Figure imgf000003_0001
worin R1 Alkyl, Acyl oder Wasserstoff, R2 Wasserstoff oder Hydroxy und R -NH2, Aryloxy, oder Alkoxy bedeutet, als einzige Stickstoffquelle, einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten. Diese Mikroorganismen bzw deren zellfreien Enzyme werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von einem D-Prolinderivat der allgemeinen Formel II und einem D-Prolinderivat der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000003_0002
1 7 worin R , R und R die genannte Bedeutung haben, eingesetzt
D-Prolin bzw dessen Derivate sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika (J Org Chetn , 1994, 59, 7496 - 7498)
Zur Herstellung von D-Prolin sind mehrere Verfahren bekannt
Die JP-A-92183399 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von (DL)-Prolin mittels Mikroorganismen der Gattung Candida oder Trichospora Dieses
Verfahren hat den Nachteil, dass die Umsetzungszeit zu lang ist und D-Prolin in geringer Ausbeute erhalten wird Die JP-A-07127354 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von Ornithin mittels Mikroorganismen der Spezies Proteus mitajiri Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass zum einen das Edukt Ornithin zu kostspielig ist, zum anderen, dass D-Prolin in schlechter Ausbeute erhalten wird
Desweiteren beschreibt die JP-A-07289275 ein Verfahren zur Herstellung von D-Prolin ausgehend von L-Prolin Dabei wird L-Prolin mittels Mikroorganismen der Gattung Escherichia, welche Racemase- Aktivität besitzen, zu (DL)-Prolin racemisiert, welches dann mit L-Prolin abbauenden Mikroorganismen kultiviert wird, um D-Prolin zu erhalten Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass das dabei erhaltene D-Prolin noch weiter gereinigt werden muss und dies mit hohen Ausbeuteverlusten verbunden ist
Die DE-A-43 30 678 umfasst ein Verfahren zur Herstellung von N-Carbamoyl-D-prolin ausgehend von einem bicyclischen Hydantoin Dabei wird das bicyclische Hydantoin mittels den Mikroorganismen Agrobacterium radiobacter zum N-Carbamoyl-D-prolin umgesetzt Dieses Verfahren hat zum einen den Nachteil, dass die Umsetzungszeit zu lang ist, zum anderen, dass das entprechende D-Prolinderivat nur in massiger Ausbeute erhalten wird
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Mikroorganismen zu isolieren, die für ein einfaches und technisch gangbares Verfahren zur Herstellung von D-Prolinderivaten der allgemeinen Formel II und VI eingesetzt werden können Die entsprechenden Produkte sollen dabei in guter Ausbeute mit guter Enantiomerenreinheit isoliert werden
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen, sowie Enzymextrakten daraus, gemass Anspruch 1 mit den Enzymen gemass Anspruch 5 und mit den Verfahren gemass Anspmch 6 und 10 gelost
Die erfindungsgemassen Mikroorganismen können aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden Erfindungsgemass erfolgt die Isolation dieser Mikroorganismen derart, dass man diese in einem Medium enthaltend ein Prolinderivat der allgemeinen Formel I in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomere
- als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle oder
- als einzige Stickstoffquelle mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle oder - als einzige Kohlenstoffquelle mit einer geeigneten Stickstoffquelle auf übliche Weise züchtet Aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur werden dann zweckmassig jene selektioniert, die ein L-Prolinamid der allgemeinen Formel I als einzige Stickstoffquelle verwerten Der Rest R1 im Prolinderivat der allgemeinen Formel I bedeutet Alkyl, Acyl oder Wasserstoff Der Rest R2 bedeutet Wasserstoff oder Hydroxy Der Rest R bedeutet -NH2, Alkoxy oder Aryloxy
Alkyl wird im folgenden als eine C^-Alkylgruppe, substituiert oder unsubstituiert, definiert Geeignete Substituenten sind beispielsweise Halogen, insbesondere Fluor, Chlor und Brom, und Hydroxy Beispiele für eine unsubstituierte Cι-5-Alkylgruppe sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Tertiarbutyl, Pentyl, Isopentyl, (Isoamyl) Beispiele für eine substituierte Cι-5-Alkylgruppe sind Chlormethyl, Trifluormethyl, 2-Brompropyl und Hydroxymethyl
Acyl wird im folgenden als Acetyl, Formyl, Propionyl, Butyryl, Pentyryl, Benzoyl oder Phenylacetyl definiert
Alkoxy wird im folgenden als eine C]-5-Alkoxygruppe, substituiert oder unsubstituiert definiert Geeignete Substituenten sind beispielsweise die weiter oben für Alkyl genannten Substituenten Beispiele für eine unsubstituierte C]-5-Alkoxygruppe sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Pentoxy, Isopentoxy oder Isobutoxy Beispiele für eine substituierte C 5-Alkoxygruppe sind Trifluormethoxy, Chlormethoxy, 2-Chlorpropoxy und Hydroxymethoxy
Aryloxy wird im folgenden als Benzyloxy und Phenyloxy definiert
Als geeignete Kohlenstoffquelle können die Mikroorganismen beispielsweise Zucker, Polyole, Peptone, Carbonsauren oder Aminosäuren als Wachstumssubstrat nutzen Als Zucker können Hexosen wie Glucose oder Fructose, Pentosen wie Xylose und Disaccharide wie Maltose oder Saccharose verwendet werden Als Polyol können beispielsweise Glykole, Glycerin, Zuckeralkohole wie Mannit, Sorbit oder Inosit verwendet werden Als Carbonsäuren können Di- oder Tricarbonsauren bzw deren Salze verwendet werden wie beispielsweise Oxalsäure, Malonsaure, Succinsaure, Glutarsaure, Adipinsaure, Pimelinsaure, Azelainsaure, Sebacinsaure, Maleinsäure, Fumarsaure, Sorbinsaure, Agaricinsaure, Citronensaure, 1,2,3- Propantricarbonsaure, Citrat, Fumarat, Oxalat oder Malat Als Aminosäuren, bzw deren Salze, können alle proteinogenen Aminosäuren, bzw deren Salze, wie Asparaginsaure, Glutaminsäure, Aspartat, Glutamat, Glutamin, Asparagin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin, Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Histidin, Arginin verwendet werden Vorzugsweise wird als Kohlenstoffquelle ein Zucker oder Zuckeralkohol verwendet
Als geeignete Stickstoffquelle können die Mikroorganismen beispielsweise Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren bzw. deren Amide nützen Als Ammoniumverbindung kann bspw Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat verwendet werden Als Aminosäure kann Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin, Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin oder Histidin verwendet werden Zweckmassige Vertreter der Aminosaureamide sind Prolinamid, Alaninamid, Glycinamid, Serinamid und Valinamid Weitere geeignete Stickstoffquellen sind Peptone, Piperidincarbonsaureamide, Pyndincarbonsaureamide oder Hydroxycarbonsaureamide
Als Piperidincarbonsaureamid kann Pipecolinsaureamid, als Pyridincarbonsaureamid Nikotinsaureamid und als Hydroxycarbonsaureamid kann Milchsaureamid verwendet werden
Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen verwendet werden, wie beispielsweise das in Tabelle 1 beschriebene
Wahrend der Anzucht und Selektion werden zweckmassig die wirksamen Enzyme der Mikroorganismen induziert Als Enzyminduktor können L- und DL-Milchsaureamid bzw deren N-methylierten Derivate wie N-Methyl-L-Milchsaureamid und N,N-Dimethyl-L- Milchsaureamid verwendet werden Vorzugsweise wird das L-Enantiomere verwendet Zweckmassig liegt die Induktorkonzentration zwischen 0,05 und 10 g/1, vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 g/1
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 10 bis 40 °C, vorzugsweise von 25 bis 35 °C und bei einem pH- Wert zwischen pH 4 und pH 10, vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 8
Bevorzugte Mikroorganismen sind L-Prolinamid verwertende der Gattung Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia oder Pseudomonas Insbesondere werden Mikroorganismen der Spezies Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens oder Aureobacterium sp LS10 (DSM 10203), sowie deren funktionell aequivalente Varianten und Mutanten isoliert Die Mikroorganismen Aureobacterium sp LS10 wurden am 29 08 1995 bei der DSM- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1 b, D- 38124 Braunschweig, gemass Budapester Vertrag hinterlegt
Unter "fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen, bzw Enzyme, verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikroorganismen, bzw die aus ihnen erhaltenen Enzyme, besitzen Derartige Varianten und Mutanten können zufallig, z B durch UV-Bestrahlung, gebildet werden
Taxonomische Beschreibung von Aureobacterium sp LS10 (DSM 10203)
Gram-positive coryneforme Stabchen, strikt aerob, keine Saure- oder Gasbildung aus Glucose
Beweglichkeit +
Sporen
Katalase +
meso-Diaminopimelinsaure in der Zellwand nein
Peptidoglycan-Typ B2ß, [L-Hsr] D-Glu (Hyg) - Gly - D-Orn
16S r DNA Sequenz- Ähnlichkeit Sequenzierung des Bereichs mit der grossten Variabilität ergab 98,9 % Übereinstimmung mit Aureobacterium luteolum Aureobacterium luteolum ist jedoch unbeweglich, d h , dass es sich bei dem erfindungsgemassen Aureobacterium sp um eine neue Spezies handelt
Die erfindungsgemassen Enzyme, die L-Prolinester-Hydrolasen oder L-Prolinamid-Hydrolasen, die befähigt sind, Prolinderivate der Formel I zu hydrolysieren, können z B durch fachmannisch übliches Aufschliessen der Mikroorganismen gewonnen werden Hierzu kann beispielsweise die Ultraschall-, French-Press oder Lysozym-Methode verwendet werden In der ersten Stufe des erfindungsgemassen Verfahrens wird zweckmassig ein L-Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000008_0001
worin R die bereits genannte Bedeutung hat, zum entsprechenden Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000008_0002
. 7 worin R die genannte Bedeutung hat, racemisiert Die Racemisierung kann entweder auf bekannte Weise, beispielsweise gemass der EP-A-0 057 092 durchgeführt werden, oder die Racemisierung findet im stark alkalischen Milieu statt
Die zweite Stufe, die Veresterung, die Herstellung von Amiden oder die Alkylierung, bzw Acylierung am Stickstoffatom, des racemischen Prolinderivats zum Prolinderivat der allgemeinen Formel I erfolgt ebenfalls auf an sich bekannte Art und Weise Die Veresterung kann durch Umsetzen mit einem Alkohol gemass Organikum, 1976, S 498ff , die Herstellung der Amide z B durch Ammonolyse mit Ammoniak gemass Organikum, 1976, S 509ff , die Alkylierung am Stickstoffatom durch Umsetzen z B mit einem Alkylhalogenid gemass
Organikum, 1976, S 257 und die Acylierung am Stickstoffatom durch Umsetzung z B mit einem Carbonsaurehalogenid erfolgen
Die Umsetzung des Prolinderivats der allgemeinen Formel I zum L-Prolinderivat der allgemeinen Formel III
Figure imgf000008_0003
wird erfindungsgemass entweder mittels Mikroorganismen und/oder Enzymextrakten daraus oder mittels Enzymen mit L-Prolinesterhydrolase- oder L-Prolinamidhydrolyse- Aktivität durchgeführt Bei dieser Biotransformation fallt neben dem L-Prolinderivat der allgemeinen Formel III das D-Prolinderivat der Formel II an Beide Verbindungen werden gegebenenfalls isoliert Prinzipiell ist die Biotransformation mit allen Mikroorganismen möglich, die ein Prolinderivat der allgemeinen Formel I in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und StickstofFquelle verwerten
Für das Verfahren besonders geeignet sind die zuvor beschriebenen Mikroorganismen der Gattung Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia oder Pseudomonas Insbesondere sind die Mikroorganismen der Gattung Aureobacterium wie Aureobacterium sp LS10 (DSM 10203) bzw. dessen fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten für die Biotransformation geeignet
Die Biotransformation kann nach üblichem Anzuchten der Mikroorganismen mit ruhenden Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine Kohlenstoff- und Energiequelle mehr benotigen) oder mit wachsenden Zellen durchgeführt werden Vorzugsweise wird die Biotransformation mit ruhenden Zellen durchgeführt
Für die Biotransformation können fachmannisch übliche Medien eingesetzt werden, wie beispielsweise niedermolare Phosphatpuffer, Tris-Puffer, oder das in Tabelle 1 beschriebene Medium Vorzugsweise wird die Biotransformation in dem Medium gemass Tabelle 1 durchgeführt
Zweckmassig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Zugabe des Prolinderivats der Formel I so durchgeführt, dass die Konzentration 40 Gew %, vorzugsweise 20 Gew %, nicht übersteigt
Der pH-Wert des Mediums kann in einem Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 8, liegen Zweckmassig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C, vorzugsweise von 20 bis 40 °C, durchgeführt
Bevorzugt wird die Biotransformation bei hoher Zelldichte, insbesondere bei einer Zelldichte von OD650 = 20 bis OD650 = 60, durchgeführt
Die Biotransformation kann in Abwesenheit der bei der Prolinesterhydrolyse gebildeten Alkohole durchgeführt werden, vorzugsweise in Abwesenheit von Ethanol, Propanol, Butanol, Isopropanol, Isobutanol, Isopentylalkohol (Isoamylalkohol) und Benzylalkohol Die entsprechenden Alkohole können z B durch Adsorption entfernt werden
Die auf diese Weise gewonnenen D-Prolinderivate der Formel II oder III können durch übliche Aufarbeitungsmethoden isoliert werden
Vorzugsweise wird das Verfahren ohne Isolation des racemischen Prolinderivats der Formel V durchgeführt
Die Herstellung der Prolinderivate gemass Formel VI erfolgt durch Hydrolyse der Prolinderivate gemass Formel II Die Hydrolyse wird auf fachmannisch übliche Art und Weise, wie beispielsweise gemass Organikum S 476 und S 477, durchgeführt
Beispiele:
Beispiel 1:
Selektion von Prolinamid-verwertenden Mikroorganismen
Zunächst wurde ein Minimalmedium (s Tabelle 1) hergestellt, das die Wachstumsanspruche vieler Mikroorganismen erfüllt
Tabelle 1 Minimalmedium
Na2SO4 0, 1 g/1
Na2HPO_ι-2 H O 2,5 g/1
KH2PO4 1,0 g/1
NaCl 3,0 g/1
MgCl2-6 H2O 0,4 g/1
CaCl -2 H2O 14,5 mg/1
FeCl3-6 H2O 0,8 mg/1
Spurenelementlosung 1,0 ml/1
Vitaminlosung 1,0 ml/1 pH 7,0
Als Kohlenstoffquelle (C-Quelle) wurde Fructose (5 g/1) beigefugt Um Mikroorganismen anzureichern, die in der Lage sind, Prolinamid zu hydrolysieren, wurde diesem Grundmedium DL-Prolinamid (1 g/1) als einzige Stickstoffquelle (N-Quelle) zugesetzt Verschiedene Ansätze wurden dann mit Erdproben unterschiedlicher Standorte inokuliert und solange inkubiert (30 °C, 120 rpm), bis deutlich sichtbares Wachstum zu erkennen war Ein Aliquot dieser Kultur wurde dann in ein gleich grosses Volumen frischen Mediums uberimpft und erneut bis zu deutlicher Trübung inkubiert Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt Die angereicherten Mikroorganismen wurden anschliessend auf einem Festmedium (gleiche Zusammensetzung wie Flussigmedium, nur Zusatz von 20 g/1 Agar-Agar) vereinzelt und gereinigt Auf diese Weise wurden mehr als 20 verschiedene bakterielle Isolate erhalten, die befähigt waren, Prolinamid als einzige N-Quelle zu verwerten Beispiel 2:
Test der selektierten Mikroorganismen auf hydrolytische Aktivität und Selektivität gegenüber Prolinamid, Prolinestern oder N-Methyl-Prolinestern
Die mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt, allerdings unter Verwendung von L-Prolinamid (1 g/1) als N- Quelle und einer kleinen Menge Hefe-Extrakt (0,2 g/1) Die so hergestellten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und anschliessend in Pufferlösung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) resuspendiert und gewaschen Nach erneutem Resuspendieren in Puffer wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von L-Prolinamid getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit dem jeweiligen Substrat (4 g/l) in Pufferlösung (50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dunnschichtchromatographie auf die Freisetzung von L-Prolin bzw N- Methyl-L-Prolin hin überprüft Mehrere Isolate wiesen die jeweils gewünschte hydrolytische Aktivität gegenüber L-Prolinamid und verschiedenen Estern von L-Prolin bzw N-Methyl-L- Prolin auf Im Falle von Prolinamid und der Prolinester wurde ausserdem die Selektivität gegenüber den jeweiligen L-Enantiomeren untersucht, und einige Stamme, z B Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens und Aureobacterium sp (DSM 10203) mit einer hohen Enantioselektivitat gefunden
Beispiel 3:
Wachstum und enzymatische Aktivität von Aureobacterium sp. LS10
a) N-Quellen
Aureobacterium sp LS 10 wurde in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Glucose (10 g/1) als C-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Verschiedenste N- Quellen (2 g/1, Ausnahme Pepton 10 g/1) wurden dabei zugesetzt, wie Aminosäuren und Säureamide Kulturen, die eine gute Zelldichte (OD 50 > 0,5 in 48 h) erreichten, wurden auf ihre enzymatische Aktivität (Hydrolyse von L-Prolinbutylester) hin analysiert Die Aktivität nach Anzucht mit L-Prolinamid als N-Quelle wurde als 100 %-Wert eingesetzt Tabelle 2 Enzymatische Aktivität von Aureobacterium sp LSIO bei Anzucht mit verschiedenen N-Quellen
Figure imgf000013_0001
Zahlreiche N-Quellen konnten von Aureobacterium sp LSIO zum Wachstum genutzt werden, die enzymatische Aktivität war allerdings sowohl negativ als auch positiv stark beeinflusst (vgl Tabelle 2)
b) C-Quellen Aureobacterium sp LSIO wurde in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit L- Milchsaureamid (2 g/1) als N-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Verschiedenste C-Quellen (10 g/1) wurden dabei zugesetzt Kulturen, die eine gute Zelldichte (OD650 > 0,5 in 48 h) erreichten, wurden auf ihre enzymatische Aktivität (Hydrolyse von L- Prolinbutylester) hin analysiert Die Aktivität von Zellen nach Wachstum auf Glucose als C- Quelle wurde als 100 %-Wert eingesetzt Tabelle 3 Enzymatische Aktivität von Aureobacterium sp LSIO bei Anzucht mit verschiedenen C-Quellen
Figure imgf000014_0001
Aureobacterium sp LS10 konnte verschiedenste C-Quellen verwerten, bevorzugt allerdings Zucker und Zuckeralkohole Die enzymatische Aktivität war nur bei Verwendung von Aminosäuren als C-Quellen beeinflusst (vgl Tab 3)
Beispiel 4:
Induktoren der L-Prolinester-Hydrolase von Aureobacterium sp. LS10
a) Induktor- Wirkung verschiedener Moleküle
Aureobacterium sp LS10 wurde in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Hefe- Extrakt (2 g/1) als N-Quelle und Glucose (10 g/1) als C-Quelle angezogen Ausserdem wurde den Kulturen, die nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte auf ihre enzymatische Aktivität (Hydrolyse von L-Prolinbutylester) hin analysiert wurden, L-Milchsaureamid oder andere, strukturell mit L-Milchsaureamid verwandte, Verbindungen zugesetzt (jeweils 1 g/1), um deren Potenz als Induktor der L-Prolinester-Hydrolase zu testen Dabei zeigten neben dem Racemat von Milchsaureamid lediglich noch die N-methylierten Derivate von L- Milchsaureamid einen induzierenden Effekt (vgl Tab 4) Tabelle 4 Enzymatische Aktivität von Aureobacterium sp. LSIO bei Anzucht mit verschiedenen potentiellen Induktoren
Figure imgf000015_0001
b) Optimale Induktor-Konzentration
Aureobacterium sp LSIO wurde wie unter 4a) beschrieben angezogen Als Induktor wurde L- Milchsaureamid, DL-Milchsaureamid oder N-Methyl-L-Milchsaureamid in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt und nach Erreichen einer guten Zelldichte wurde die enzymatische Aktivität (Hydrolyse von L-Prolinbutylester) bestimmt. Die enzymatische Aktivität bei 1 g/1 L- Milchsaureamid wurde als 100 %-Wert eingesetzt
Fig 1 zeigt die enzymatische Aktivität von Aureobacterium sp LS10 bei Anzucht mit verschiedenen Induktoren in variablen Konzentrationen
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass nur das L-Enantiomere von Milchsaureamid induzierende Wirkung hat, wobei die optimale Konzentration bei 0,5 bis 1,5 g/I liegt Mit steigender Induktor-Konzentration nimmt die enzymatische Aktivität wieder ab, was wahrscheinlich auf die hemmende Wirkung des bei der Hydrolyse des Amids freiwerdenden Ammoniums zurückzuführen ist
Im Gegensatz dazu erreicht N-Methyl-L-Milchsaureamid ein Aktivitatsplateau, da wahrscheinlich die Hydrolyserate deutlich verringert ist N-Methyl-L-Milchsaureamid ist allerdings erst bei höheren Konzentrationen wirksam als L-Milchsaureamid, ermöglicht am Optimum (3,0 g/1) aber höhere enzymatische Aktivität
Beispiel 5:
Einfluss verschiedener Parameter auf Aktivität und Stereoselektivität der L-Prolinester- Hydrolase aus Aureobacterium sp. LSIO
Aureobacterium sp LSIO wurde in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Glucose (10 g/1) als C-Quelle, L-Milchsaureamid (2 g/1) als N-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte wurde die Kultur geerntet, die Zellen wurden gewaschen und resuspendiert in Kochsalz-Losung (0,9 %) Aliquots dieser Bakteriensuspension wurden unter Variation verschiedener Parameter hinsichtlich ihrer Hydrolyse-Aktivität gegenüber L- bzw D-Prolinbutylester getestet
a) Aktivität und Stereoselektivitat
Für eine optimale Racemat-Spaltung eines Prolinesters ist neben einer möglichst hohen enzymatischen Aktivität vor allem auch eine möglichst hohe Stereoselektivitat ausschlaggebend Es wurde daher untersucht, welche Parameter hierbei von Bedeutung sind Für die Festsetzung des 100 %-Wertes für die enzymatische Aktivität wurde der Versuch, bei dem für alle Parameter Mittelwerte verwendet wurden, herangezogen
Tabelle 5 Einfluss von pH, Temperatur und Zelldichte auf Aktivität und Stereoselektivitat der L-Prolinester-Hydrolase (E-Wert = Quotient aus der Aktivität gegenüber den L-Prolinestern und den entsprechenden D-Prolinestern)
Figure imgf000017_0001
Die enzymatische Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase ist weitgehend temperaturabhangig Eine Temperatur-Erhöhung um 15 °C führt etwa zu einer Vervierfachung der Aktivität Steigender pH führt ebenfalls zu einer erhöhten Aktivität, jedoch nur in relativ geringem Umfang Mit Steigerung der Zelldichte ist eine nahezu proportionale Steigerung der Aktivität zu erreichen Die Stereoselektivitat ist hingegen weitgehend temperaturunabhangig Als wichtigster Parameter ist hierbei der pH- Wert zu erkennen, der möglichst tief liegen sollte Eine hohe Zelldichte tragt ebenfalls leicht zu einer verbesserten Selektivität bei Aus diesem Versuch geht hervor, dass bei niedrigem pH, hoher Zelldichte und hoher Temperatur der beste Kompromiss aus enzymatischer Aktivität und Stereoselektivitat zu erzielen ist
b) Produkt-Hemmung
Da bei der Hydrolyse des L-Prolinbutylesters durch die L-Prolinester-Hydrolase von Aureobacterium sp. LS10 Hinweise auf eine Hemmung der Enzymaktivitat durch das bei der Reaktion freigesetzte Butanol gefunden wurden, wurden Experimente durchgeführt, um den Einfluss verschiedener Parameter auf diese Hemmung zu untersuchen Als Referenz wurde ein Versuch ohne Butanol durchgeführt und die dabei bestimmte enzymatische Aktivität als 100 %-Wert eingesetzt Tabelle 6 Einfluss von Temperatur, Zelldichte und Butanolkonzentration auf die Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase
Figure imgf000018_0001
Als wesentlichster Parameter für die Hemmung der L-Prolinester-Hydrolase durch Butanol stellt sich die Zelldichte heraus Bei geringer Zelldichte führt bereits 100 mM Butanol zur vollständigen Inaktivierung des Enzyms, wahrend bei hoher Zelldichte auch höhere Butanol- Konzentrationen weniger schädlich sind Mit steigender Butanol-Konzentration nimmt die hemmende Wirkung zu, aber nur in verhaltnismassig geringem Umfang Ebenso führt eine Temperatur-Erhöhung zu einer verstärkten Inaktivierung des Enzyms Um bei möglichst guter Aktivität einen vollständigen Umsatz bei der spezifischen Hydrolyse von L-Prolinester zu gewahrleisten, muss also der pH tief, die Zelldichte hoch und die Temperatur tief sein
Beispiel 6:
Einfluss verschiedener Alkohole auf die Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase von
Aureobacterium sp. LSIO
Da Butanol die enzymatische Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase hemmt (vgl Beispiel 5), wurde die Hemmwirkung verschiedener Alkohole untersucht Hierzu wurde Aureobacterium sp. LSIO in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Glucose (10 g/1) als C-Quelle, L-Milchsaureamid (2 g/1) als N-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte wurde die Kultur geerntet Nach Waschen und Resuspendieren der Zellen in Kochsalz-Losung (0,9 %) wurden Aliquots der
Bakteriensuspension bei Raumtemperatur mit verschiedenen Alkoholen in verschiedenen Konzentrationen für 30 Minuten inkubiert Anschliessend wurde die enzymatische Aktivität bestimmt
Fig 2 zeigt den Einfluss verschiedener Alkohole auf die Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase
Dieses Experiment zeigt, dass mit Ausnahme von Methanol alle getesteten Alkohole einen negativen Effekt auf die enzymatische Aktivität besitzen Mit zunehmender Konzentration nimmt die Enzymaktivitat immer weiter ab, im Extremfall sogar bis auf Null. Dabei ist ausserdem ein Trend feststellbar, dass dieser negative Effekt mit zunehmender Hydrophobizitat der Alkohole starker wird
Beispiel 7:
Hydrolyse verschiedener Prolinester durch L-Prolinester-Hydrolase aus Aureobacterium sp. LS10
Die Aktivität und Stereoselektivitat der L-Prolinester-Hydrolase gegenüber verschiedenen Estern von Prolin wurde in Abhängigkeit vom pH- Wert untersucht Dabei wurden Ester gewählt, deren Stabilität in Wasser ausreichend gut ist, damit der ee-Wert nicht durch unspezifische chemische Hydrolyse deutlich verschlechtert wird, und bei deren Hydrolyse Alkohole entstehen, die einen möglichst geringen negativen Einfluss auf die enzymatische Aktivität besitzen (vgl Beispiel 6) Dazu wurde Aureobacterium sp LSIO in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Glucose (10 g/1) als C-Quelle, L- Milchsaureamid (2 g/1) als N-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte wurde die Kultur geerntet, die Zellen wurden gewaschen und resuspendiert in Kochsalz-Losung (0,9 %) Anschliessend wurde die enzymatische Aktivität gegenüber verschiedenen L- bzw D-Prolinestern bestimmt Als 100 %- Wert wurde die Hydrolyse von L-Prolinbutylester bei pH 7,0 eingesetzt Die Stereoselektivitat des Enzyms wurde anhand des Quotienten aus der Aktivität gegenüber den L-Prolinestern und den entsprechenden D-Prolinestern bestimmt (E-Wert)
Fig 3 zeigt die enzymatische Aktivität der L-Prolinester-Hydrolase mit verschiedenen L- Prolinestern in Abhängigkeit vom pH- Wert
Tabelle 7 Stereoselektivitat (E-Wert) der L-Prolinester-Hydrolase mit verschiedenen Prolinestern in Abhängigkeit vom pH- Wert
Figure imgf000020_0001
Mit allen vier getesteten Prolinestern steigt die enzymatische Aktivität mit steigendem pH an Die Hydrolyse von L-Prolinbutylester ist deutlich langsamer als die Hydrolyse der drei restlichen Ester Für alle vier Ester wird das L-Enantiomere deutlich schneller hydrolysiert als das D-Enantiomere, so dass gute bis sehr gute E- Werte zu beobachten sind, wobei die Selektivität je nach verwendetem Ester sich in Abhängigkeit vom pH geringfügig verandern kann Beispiel 8:
Hydrolyse des Prolinisopropylesters bei unterschiedlicher Substratkonzentration
Mit Prolinisopropylester, der sich als gunstigstes Substrat erwiesen hatte, sollte untersucht werden, welche Produktkonzentrationen erreichbar sind Hierzu wurde Aureobacterium sp LSIO in dem in Tabelle 1 beschriebenen Minimalmedium mit Glucose (10 g/1) als C-Quelle, L- Milchsaureamid (2 g/1) als N-Quelle und etwas Hefe-Extrakt (0,2 g/1) angezogen Nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte wurde die Kultur geerntet Die Zellen wurden dann in Kochsalz-Losung (0,9 %) gewaschen und letztlich auch darin resuspendiert Der Test wurde mit DL-Prolinisopropylester als Substrat in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt, wahrend die anderen Parameter konstant gehalten wurden (25 °C, pH 6,0 , OD650 ca 15) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen, die per HPLC auf ihren Gehalt an D- bzw. L-Prolinisopropylester hin analysiert wurden
Fig 4 zeigt die Biotransformation mit Aureobacterium sp LS10 unter Variation der Substrat- Konzentration
Mit 60 oder 120 g/1 DL-Prolinisopropylester war eine sehr schnelle Hydrolyse des L-Esters zu beobachten, die in der Bildung von D-Ester mit einem ee-Wert von über 98 % resultierte Bei höheren Substrat -Konzentrationen (240 g/1 bzw 300 g/1) verlangsamte sich die
Hydrolysegeschwindigkeit deutlich Mit zunehmender Konzentration an freigesetztem Isopropanol wird die Reaktion zunehmend langsamer, so dass eine vollständige Hydrolyse des L-Prolinisopropylesters erschwert wird Hohe ee- Werte konnten nur nach längerer Inkubationszeit beobachtet werden, wobei sich allerdings die Ausbeute an D-Ester leicht verringerte Als Alternative wurde die Zelldichte im Ansatz verdoppelt (OD^0 ca 30), was mit 240 g/1 DL-Prolinisopropylester eine vollständige Umsetzung des L-Esters nach etwa 4 h sowie einen ee-Wert von über 98 % des verbleibenden D-Prolinisopropylesters zur Folge hatte
Beispiel 9:
Herstellung von D-Prolin mit Hilfe der L-Prolinester-Hydrolase aus Aureobacterium sp.
LSIO
a) Anzucht von Aureobacterium sp LSIO auf Minimalmedium
Aureobacterium sp LSIO wurde in einem Chemap-Fermenter (Arbeitsvolumen 5 1) in Minimalmedium (vgl Tab 1) mit Glucose (30 g/1) und L-Milchsaureamid (4 g/1) als C- bzw N-Quelle bei 30 °C angezogen Um das Anwachsen der Zellen zu erleichtern, enthielt das Medium ausserdem eine geringe Menge Hefe-Extrakt (0,7 g/1) Im Verlauf der Anzucht wurde entsprechend des Bedarfs der Zellen weiteres L-Milchsaureamid zugeführt, bis eine ausreichend hohe Zelldichte (OD650 ca 23) und eine gute spezifische Enzym- Aktivität (>1,2 μ Mol L-Prolinbutylester hydrolysiert/min x OD650) erreicht wurde Die Zellen wurden durch Zentrifügation abgetrennt, in Kochsalz-Losung (0,9 %) gewaschen und darin schliesslich endgültig resuspendiert 401,4 g DL-Prolinisopropylester wurden der Bakteriensuspension zugesetzt und das Volumen durch Zugabe von Wasser auf 4,5 1 eingestellt Dieser Biotransformationsansatz wurde dann für 160 Minuten bei 25 °C und pH 6,0 unter Rührung inkubiert Anschliessend wurden die Zellen durch Zentrifügation abgetrennt und der Überstand aufgearbeitet Durch wiederholte Elektrodialyse bei pH 6,3 wurde dabei zunächst der D-Proliniso- propylester von L-Prolin abgetrennt Im nächsten Schritt wurde D-Prolin durch alkalische Hydrolyse mit Natronlauge aus dem Ester freigesetzt und das gebildete Kochsalz durch
Elektrodialyse (pH 6,3) abgetrennt Die so erhaltene D-Prolin-Losung wurde bis zur Trockene eingeengt und eine Verunreinigung durch einen gelben Farbstoff wurde durch Waschen der D- Prolin-Kristalle mit Ethanol bs (30 Minuten bei 60 °C) entfernt Auf diese Weise wurden letztlich 64,0 g D-Prolin (53,7 % der Theorie) isoliert, das sowohl einen sehr guten Gehalt (> 99 % titrimetrisch) als auch eine ausgezeichnete optische Reinheit (ee > 99 % nach HPLC, [α]D — 83,7 für c = 4 in Essigsaure) aufwies
b) Anzucht von Aureobacterium sp LS 10 auf Vollmedium
Aureobacterium sp LS10 wurde in einem Chemap-Fermenter (Arbeitsvolumen 2 1) in Mineralmedium (vgl Tab 1) mit Glucose (20 g/1) als C-Quelle und Hefe-Extrakt (15 g/1) als N-Quelle bei 30 °C angezogen Ausserdem enthielt das Medium N-Methyl-L-Milchsaureamid (3 g/1) als Induktor Nach Erreichen einer ausreichenden Zelldichte (OD650 ca 30) wurden die Zellen durch Zentrifügation geerntet Die Zellen wiesen nach Waschen und Resuspendieren in Kochsalz-Losung eine gute Aktivität (ca 1, 1 μMol L-Prolinbutylester hydrolysiert/min x OD650) auf und ein Teil davon (OD65o = 21 für V = 1, 15 1) wurde für die Racemat-Spaltung von 228,2 g DL-Prolinisopropylester eingesetzt Nach 5,5 h war die Hydrolyse des L-Prolinesters vollständig und die Zellen wurden durch Zentrifügation abgetrennt 90 % des eingesetzten D-Prolinesters waren in Losung noch nachweisbar, wobei eine sehr gute optische Reinheit (ee-Wert = 99 % per HPLC) festgestellt wurde
Beispiel 10:
Chemische Synthesen
10.1 Racemisierung von L-Prolin
Um racemisches Prolin zu gewinnen, wurden 160 g (1,39 Mol) L-Prolin in 600 ml (10,49 Mol) Essigsaure gelost und 20 g (277 mMol) Butanal zugesetzt Diese Losung wurde in einem
Autoklaven auf 100 °C erhitzt und für zwei Stunden bei dieser Temperatur gehalten Nach dem Abkühlen wurde soweit als möglich eingeengt und racemisches Prolin durch Zugabe von 700 ml Aceton kristallisiert Dabei wurden nach Trocknung der Kristalle 144,4 g Prolin erhalten (90,3 % d Th ), dessen Identität anhand von NMR-Spektroskopie bestätigt wurde und das nahezu racemisch war ( [α]D24 = - 0,5° für c = 5 in 1 N HC1)
Alternativ dazu konnte Prolin auch in alkalischer wassriger Losung racemisiert werden (vgl als Teil der Ein-Topf-Reaktion in 10 3)
10.2 Veresterung von DL-Prolin Für die Herstellung von racemischem Prolinisopropylester wurden 300 g (2,61 Mol) DL-Prolin und 1000 ml (13,06 Mol) Isopropanol in einen Dreihalskolben gegeben Diese Mischung wurde auf 10 °C gekühlt und anschliessend wurden langsam unter Beibehaltung der Temperatur 380 ml (5,22 Mol) Thionylchlorid zugetropft Nach Beendigung der Zugabe wurde zun chst für 90 min bei Raumtemperatur gerührt und dann die Losung für einige Stunden zum Ruckfluss erhitzt Nach Abkühlen und Abdestillieren des verbliebenen Losungsmittels erhielt man 521,9 g eines braunen Ols, dessen HPLC-Analyse ergab, dass ein Umsatz von 95 % erreicht wurde Mit derselben Prozedur konnten auch andere Prolinester wie der Prolinmethyl-, Prolinethyl- und der Prolinbutylester sowie die entsprechenden Ester von N-Methylprolin, hergestellt werden
10.3 Ein-Topf-Reaktion zur Herstellung von DL-Prolinester
Unter Verwendung der Racemisierung von L-Prolin in wassriger alkalischer Losung kann DL- Prolinisopropylester aus L-Prolin auch in einem Ein-Topf- Verfahren hergestellt werden Dazu wurden 80 g (695 mMol) L-Prolin in 26 ml 4 N NaOH (104 mMol) und 148,5 g Wasser gelost Diese Losung wurde dann in einem Autoklaven auf 160 °C erhitzt, wobei ein Druck von etwa 5 bar erreicht wurde, und für 14 Stunden auf dieser Temperatur gehalten Anschlies- send wurde das Wasser so gut wie möglich durch Destillation entfernt, wobei man sich nach Zugabe von 250 ml Isopropanol den Effekt der azeotropen Destillation zunutze machte, um Restmengen von Wasser zu entfernen Nachdem auch Isopropanol so gut wie möglich wieder durch Destillation entfernt war, wurden 78,5 g (2,43 Mol) Isopropanol zugegeben und die Mischung auf 10 °C gekühlt Unter Beibehaltung einer Temperatur von 5 - 10 °C wurden dann 103,5 g (0,87 Mol) Thionylchlorid zugetropft Der Ansatz wurde anschliessend langsam über 2,5 Stunden bis auf 84 °C erhitzt Nach Abfiltrieren eines weissen Niederschlags (NaCl) und Abdestillieren des Losungsmittels erhielt man 138,4 g eines gelblichen Ols Nach HPLC- Analyse lag etwa 70 % des eingesetzten L-Prolins nun in Form von DL-Prolinisopropylester vor
10.4 Herstellung von N-Methyl-Prolin
Zur Herstellung von N-Methyl-Prolin wurden 115, 1 g (1,0 Mol) L-Prolin in 375,8 g 98 %
Ameisensaure (8,0 Mol) gelost und dann langsam 329, 1 g 36,5 % Formaldehyd (4,0 Mol) zugetropft
Die Umsetzung fand danach für vier Stunden bei 60 °C statt Nach destillativer Abtrennung der Losungsmittel verblieben 184,5 g eines orange-farbigen Ols Dieses wurde in 100 ml Wasser gelost und der pH mit NaOH auf 6,3 (pl) eingestellt, so dass N-Methyl-L-Prolin als Zwitter- Ion vorlag Das Wasser wurde destillativ entfernt und der Ruckstand in 180 ml Ethanol aufgenommen Durch azeotrope Destillation wurden Reste von Wasser entfernt Der
Ruckstand wurde nun in 500 ml Ethanol aufgeschlammt und für einige Stunden bei 8 °C gehalten Nicht losliche Bestandteile wurden dann abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt Nach erneutem Losen in 120 ml Ethanol wurde N-Methyl-L-Prolin durch Zugabe von 95 ml Ether auskristallisiert Nach dem Abtrennen und Trocken der Kristalle verblieben 74,6 g N- Methyl-L-Prolin, dessen Identität durch GC-Analyse bestätigt wurde
10.5 Synthese von N-Methyl-Prolinamid
Um aus N-Methyl-Prolin das entsprechende Amid herzustellen, wurden 12,9 g (100 mMol) N- Methyl-L-Prolin und 100 ml (2,47 Mol) Methanol auf 0 °C abgekühlt und unter Beibehaltung der Temperatur langsam 14,3 g (120 mMol) Thionylchlorid zugetropft Nachdem für etwa 90 min bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde der Ansatz für 2,5 Stunden bis zum Ruckfluss erhitzt Nach Abfiltrieren einer unlöslichen Verunreinigung und Einengen bis zur Trockene verblieben 15,1 g eines öligen Ruckstandes Die Hälfte davon wurde zu 20 ml 50 % K2CO3 (0 °C) gegeben und mit insgesamt 60 ml Ether wurde der unter diesen Bedingungen ungeladene N-Methyl-L-Prolinmethylester extrahiert Die nach Einengen bis zur Trockene verbliebenen 4, 1 g Ruckstand wurden in insgesamt 60 ml ammoniakalischem Methanol gelost und über sieben Tage in einem Autoklaven erhitzt (40 - 80 °C) Der nach dem Einengen bis zui Trockene erhaltene Ruckstand wurde dann in 20 ml Methanol gelost, eine unlösliche Verunreinigung wurde durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wurde schliesslich zur Trockene eingeengt Dabei fielen 3,0 g N-Methyl-L-Prolinamid an, dessen Identität durch GC- Analyse bestätigt wurde

Claims

Patentansprüche:
1. Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie befähigt sind, Prolinderivate, in Form des Racemats oder optisch aktiver Isomere, ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen Formel
1 7 " worin R Alkyl, Acyl oder Wasserstoff, R Wasserstoff oder Hydroxy und R -NH2, Aryloxy oder Alkoxy bedeutet, als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten, sowie Enzymextrakte daraus
2. Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2 der Gattung Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia oder Pseudomonas
3. Mikroorganismen nach Anspruch 3 der Gattung Aureobacterium
4. Mikroorganismen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 der Spezies Aureobacterium sp LSIO (DSM 10203) sowie dessen fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten
5. Enzym mit L-Prolinesterhydrolase- und/oder L-Prolinamidhydrolase- Aktivität, erhaltlich aus Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und befähigt, Prolinderivate, in Form des Racemats oder optisch aktiver Isomere, ausgewählt aus den Verbindungen der allgemeinen Formel
Figure imgf000026_0002
1 7 T • worin R , R und R die genannte Bedeutung haben, zu hydrolysleren, sowie fünktionell aequivalente Varianten und Mutanten davon
6. Verfahren zur Herstellung von D-Prolinderivat en der allgemeinen Formeln
Figure imgf000027_0001
und/oder
Figure imgf000027_0002
worin R , R und R' die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, umfassend die
Umsetzung eines Prolinderivats der allgemeinen Formel
Figure imgf000027_0003
worin R , R und R' die genannte Bedeutung haben, mittels eines Mikroorganismus und/oder Enzympraparats nach Anspruch 1 oder eines Enzyms nach Anspruch 5 zu einem L-Prolinderivat der allgemeinen Formel III, sowie gegebenenfalls Isolierung dieser Verbindung und/oder des bei dieser Umsetzung anfallenden D-Prolinderivats der Formel II
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000027_0004
worin R , R und R die genannte Bedeutung haben, dadurch hergestellt wird, dass man in einer ersten Stufe ein L-Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000028_0001
worin R die genannte Bedeutung hat, zu einem Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000028_0002
worin R die genannte Bedeutung hat, racemisiert und dieses in der zweiten Stufe in ein
Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000028_0003
worin R , R und R die genannte Bedeutung haben, überfuhrt
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung des Prolinderivats der allgemeinen Formel I mittels Mikroorganismen der Spezies
Aureobacterium sp LS IO (DSM 10203) oder mit dessen fünktionell aequivalenten Varianten und Mutanten durchführt
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biotransformation bei einem pH- Wert von 4 bis 10 und bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C durchführt
10. Verfahren zur Herstellung eines D-Prolinderivats der allgemeinen Formel
Figure imgf000028_0004
I 7 worin R und R die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben , dadurch gekennzeichnet, dass man in einer ersten Stufe ein L-Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000029_0001
worin R2 die genannte Bedeutung hat, zum entsprechenden Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000029_0002
7 worin R die genannte Bedeutung hat, racemisiert, dieses in einer zweiten Stufe in ein Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000029_0003
worin R1, R2 und R3 die genannte Bedeutung haben , überführt, und dieses in einer dritten Stufe mittels eines Mikroorganismus und/oder Enzympräparats nach Anspruch 1 oder eines Enzyms nach Anspruch 5 in ein L-Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000029_0004
überführt, wobei bei der Biotransformation neben dem L-Prolinderivat der allgemeinen
Formel III das D-Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000029_0005
anfällt, das in einer vierten Stufe zum Produkt der Formel VI hydrolysiert wird.
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