CZ213199A3

CZ213199A3 - Mikroorganismy, enzymy a způsob výroby derivátů D-prolinu

Info

Publication number: CZ213199A3
Application number: CZ992131A
Authority: CZ
Inventors: Martin Sauter; Daniel Venetz; Oleg Werbitzky
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 1999-11-17
Also published as: JP2001506500A; EP0944730A1; CA2274896A1; WO1998027222A1; AU5757498A

Description

Mikroorganismy, enzymy a způsob výroby derivátů D-prolinu

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat derivát prolinu ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů. Tyto mikroorganismy, popřípadě jejich bezbuněčné enzymy se použijí pro nový způsob výroby derivátů D-prolinu.

Dosavadní stav techniky

D-prolin nebo jeho deriváty jsou důležité meziprodukty pro výrobu léčiv (J.Org.Chem., 1994,59,7496-7498).

Pro výrobu D-prolinu je známo více způsobů.

JP-A-92183399 popisuje způsob výroby D-prolinu z(DL)-prolinu pomocí mikroorganismů rodu Candida nebo Trichospora. Nevýhodou tohoto způsobu je to, že reakční doba je příliš dlouhá a D-prolin se získá v malém výtěžku.

JPtA—07127354 popisuje způsob výroby D-prolinu z ornithinu pomocí mikroorganismů druhu Próteus mitajiri. Nevýhodou tohoto způsobu je to, že jednak je edukt ornithin příliš drahý a jednak se získá D-prolin ve špatném výtěžku.

Dále JP-A-07289275 popisuje způsob výroby D-prolinu z L-prolinu. Přitom - se,L-prolin racemizuje pomoci mikroorganismů rodu Escherichia, které mají racemasovou aktivitu, na (DL)-prolin. Ten se pak kultivuje s mikroorgansimy, které odbourávají L-prolin, aby se získal D-prolin. Nevýhodou tohoto způsobu je to, že se přitom získaný D-prolin musí ještě dále čistit a to je spojeno s velkými ztrátami na výtěžku.

DE-A-43 30 678 zahrnuje způsob výroby N-karbamoyl—D-prolinu—z—bicykLiekého—hydantoinu.Přitom se bicyklický hydantoin přemění pomocí mikroorganismů Agrobacterium radiobacter na N-karbamoyl-D-prolin. Nevýhodou tohoto způsobu je to, že je jednak reakční doba příliš dlouhá a jednak se odpovídající derivát D-prolinu získá jen v menším výtěžku.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je izolovat mikroorganismy, které lze použít pro jednoduchý a technicky uskutečnitelný způsob výroby derivátů D-prolinu níže uvedených vzorců II a VI. Odpovídající produkty se mají přitom získat v dobrém výtěžku při dobré enantiomerní jednotnosti.

Tento úkol se řeší pomocí mikroorganismů, jakož i pomocí enzymových extraktů z nich, podle nároku 1 s enzymy podle nároku 5 a způsobem podle nároku 6 a 10.

Vynález se týká nových mikroorganismů, které jsou schopné zužitkovat derivát prolinu ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních izomerů obecného vzorce I

(I) kde r! znamená alkyl, acyl nebo atom vodíku, R^ znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a R³ znamená skupinu -NH₂, aryloxy nebo alkoxy, jako jediný zdroj„_sdusíku,jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Tyto mikroorganismy, popř. jejich bezbuněčné enzymy se použijí pro nový způsob výroby derivátu D-prolinu obecného vzorce II a derivátu D-prolinu obecného vzorce VI

II

VI

ΊΟ Ο .

kde R , R a R^J mají uvedený význam.

V prvním stupni způsobu podle vynálezu se účelně racemizuje derivát L-prolinu obecného vzorce IV

COOH

kde R² má shora uvedený obecného vzorce V význam, na odpovídající derivát prolinu

R\ kCOOH (V) kde R² má shora uvedený. Racemizace se může provádět bud' známým způsobem, jako například podle EP-A-0 057 092, nebo se racemizace uskuteční v silně alkalickém prostředí.

Druhý stupeň, esterifikace, výroba amidů nebo alkylace, popř. acylace na dusíku racemického derivátu prolinu za vzniku derivátu prolinu obecného vzorce I se rovněž uskuteční známým způsobem. Esterifikace · se může uskutečnit reakcí s „ alkoholem podle Organikum, 1976, str. 498 a další. Výroba amidů se může uskutečnit např. amonolysou amoniakem podle Organikum, 1976, str. 509 a další. Alkylace na dusíku se může uskutečnit reakcí např. s alkylhalogenidem podle Organikum, 1976, str. 257 a acylace na dusíku reakcí např. s halogenidem karboxylové kyseliny.

Přeměna derivátu prolinu obecného vzorce I na derivát ________________L-prolinu obecnéhovzorce III___________________________________________________________________________________

se podle vynálezu provádí jejich enzymových extraktů L-prolinesterhydrolasy nebo bio.transf ormaci vzniká vedle bud' pomocí mikroorgánismů a/nebo nebo pomocí enzymů s aktivitou

L-prolinamidhydrolasy. Při této derivátu L-prolinu obecného vzorce

III derivát D-prolinu popřípadě izolují.

obecného vzorce II. Obě sloučeniny se

Mikroorganismy podle vynálezu se mohou izolovat ze vzorků půdy, kalu nebo odpadní vody pomocí obvyklých mikrobiologických technik. Podle vynálezu se izolace těchto mikroorganismů uskuteční tak, že se obvyklým způsobem pěstují v mediu, které obsahuje derivát prolinu obecného vzorce I ve formě racemátu nebo jednoho jeho opticky aktivního izomeru

- jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo

- jako jediný zdroj dusíku s vhodným zdrojem uhlíku nebo

- jako jediný zdroj uhlíku s vhodným zdrojem dusíku.

Z kultury získané pěstováním se pak účelně získají selekcí ty, které zužitkují L-prolinamid obecného vzorce I jako jediný zdroj dusíku.

Zbytek R¹ v derivátu prolinu obecného vzorce I znamená alkyl, acyl nebo atom vodíku. Zbytek R² znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu. Zbytek R³ znamená skupinu -NH₂, aryloxy nebo alkoxy.

Alkyl je v následujícím určen jako C₁_₅~alkylová skupina, substituovaná nebo nesubstituovaná. Vhodnými substituenty jsou například halogen, zejména fluor, chlor a brom, a hydroxyskupina. Příklady nesubstituované C^^-alkylové skupiny jsou methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, terciální butyl, pentyl, isopentyl, (isoamyl). Příklady substituované C^g-alkylové skupiny jsou chlormethyl, trifluormethyl, 2-brompropyl a hydroxymethyl._______________

Acyl je v následujícím určen jako acetyl, formyl, propionyl, butyryl, pentyryl, benzoyl nebo fenylacetyl.

Alkoxy je v následujícím určen jako C₁_₅~alkoxyskupina, substituovaná nebo nesubstituovaná. Vhodnými substituenty jsou například substituenty shora uvedené pro alkyl. Příklady nesubstituované C₁_₅~alkoxyskupiny jsou methoxy, ethoxy, propoxv, isopropoxv, butoxv.pentoxy, isopentoxy nebo isobutoxy. Příklady substituované C₁_₅~alkoxyskupiny jsou trifluormethoxy, chlormethoxy, chlormethoxy, 2-chlorpropoxy a hydroxymethoxy.

Aryloxy je v následujícím určen jako benzyloxy a fenyloxy.

glukosa nebo maltosa nebo

Jako vhodné zdroje uhlíku mohou mikroorganismy zužitkovat cukry, polyoly, pentony, karboxylové kyseliny nebo aminokyseliny jako růstový substrát. Jako cukry se mohou použít hexosy jako fruktosa, pentosy jako xylosa a disacharidy jako sacharosa. Jako polyoly se mohou použít například gykoly, glycerin, cukerné alkoholy jako mannit, sorbit nebo inosit. Jako karboxylové kyseliny se mohou použít di- nebo trikarboxylové kyseliny, popř. jejich soli jako například kyselina štavelová, malonová, jantarová, glutarová, adipová, pimelová, azelaová, sebaková, maleinová, fumarová, sorbová, agaricinová, citrónová, 1,2,3-propantrikarboxylová, citrát, fumarát, oxalát nebo malát. Jako aminokyseliny, popř. jejich soli se mohou použít všechny proteinogenní aminokyseliny, popř. jejich soli jako kyselina asparagová, glutamová, aspartát, glutamát, glutamin, asparagin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, ₌.....tryptofan, fenylalanin, methionin, glycin, serin, tyrosin, threonin, cystein, histidin, arginin.

Výhodně se jako zdroje uhlíku použije cukr nebo cukerný alkohol.

Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy použít například amoniové sloučeniny nebo aminokyseliny,’ popř. jejich ______________amidy. Jako amoniové sloučeniny se mů že použ ít např. amon i um«e & * chlorid, amoniumsulfát, amoniumkarbonát nebo amoniumacetát. Jako aminokyselina se může použít alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, tryptofan, fenylalanin, methionin, glycin, serin, tyrosin, threonin, cystein, asparagin, glutamin, lysin, arginin nebo histidin. Účelnými zástupci amidů aminokyselin jsou prolinamid, alaninamid, glycinamid, serinamid a valinamid. Další vhodné zdroje dusíku jsou petony, amid kyseliny piperidinkarboxylové, amid kyseliny pyridinkarboxylové nebo amid kyseliny hydroxykarboxylové.

Jako amid kyseliny piperidinkarboxylové lze použít amid kyseliny pipekolinové, jako amid kyseliny pyridinkarboxylové lze použít amid kyseliny nikotinové a jako amid kyseliny hydroxykarboxylové lze použít amid kyseliny mléčné.

Jako selekční a růstové medium lze použít media běžná v oboru, jako např. popsané v tabulce 1.

Během pěstování' a selekce se účelně účinné enzymy mikroorganismů indukují. Jako induktor enzymu se mohou použít amid kyseliny L- a DL-mléčné,popř. jejich N-methylované deriváty jako amid kyseliny N-methyl-L-mléčné a amid kyseliny N,N-dimethyl-L-mléčné. Výhodně se používá L-enantiomer. Účelně je koncentrace induktoru mezi 0,05 a 10 g/1,výhodně mezi 0,5 a 3 g/1

Obvykle probíhá pěstování a selekce při teplotě od 10 do 40 °C, výhodně od 25 do 35 °C a při hodnotě pH mezi 4 a 10, výhodně mezi pH 6 a 8.

Výhodnými mikroorganismy jsou mikroorganismy zužitkující L-prolinamid rodu Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas,Serratia nebo Pseudomonas. Zejména se izolují mikroorganismy druhu Klebsiella pneumoniae, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens nebo Aureobacterium sp. LS10 (DSM 10203), jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.

e « ·« ·· ·· ·· ses · · · · · · · ‘ ··· · · · · · · · · · • ···· · · · · · · ··· ··· • · · · · · · · • · · · ·· · · ·· · ·

Mikroorganismy Aureobacterium sp. LS10 byly uloženy 29.08.1995 u DSM-Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig, podle Budapeštské smlouvy.

Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, popř. enzymy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy, popř. z nich získané enzymy. Takové varianty a mutanty se mohou vytvořit náhodně, např. UV-ozářením.

Taxonomický popis Aureobacterium sp. LS10 (DSM 10203).

Gram-positivní koryneformní tyčinky, striktně aerobní, žádná tvorba kyseliny a plynu z glukosy pohyblivost + spory ' katalasa + kyselina meso-diaminopimelová v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: Β2β,[L-Hsr]D-Glu(Hyg)-Gly-D-Orn

Podobnost sekvence 16SrpNA:

Sekvenování oblasti s největší variabilitou ukázalo na 98,9 % shodnost s Aureobacterium luteolum. Aureobacterium luteolum je však nepohyblivý, tzn. že se u Aureobacterium sp. podle vynálezu jedná o nový druh.

Enzymy podle vynálezu, L-prolinesterhydrolasy nebo L-prolinamidhydrolasy, které jsou schopné hydrolysovat deriváty prolinu vzorce I, se mohou získat např. v oboru obvyklým otevřením mikroorganismů. K tomu se používá například ultrazvuku, metody s French-tlakovým zářízením nebo lysozymové metody.

V podstatě lze biotransformaci uskutečnit se všemi mikroorganismy, které jsou schopné zužitkovat derivát prolinu obecného vzorce I ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních izomerů jako jediný zdroj dusíku, jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku.

Pro způsob jsou obvzláště vhodné shora popsané mikroorganis my rodu Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia nebo Pseudomonas. Zejména jsou biotransformaci vhodné mikroorganismy rodu Aureobacterium jako je Aureobacterium sp. LS10 (DSM 10203), popř. jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.

Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování mikroorganismů s buňkami v klidu (nesrostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.

Pro biotransfromaci se mohou použít v oboru běžně užívaná media, jako například nízkomolární fosfátový pufr, tris-pufr nebo medium posané v tabulce 1. Výhodně se biotransformace provádí v medium podle tabulky 1.

Účelně se biotransformace provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání derivátu prolinu vzorce I tak, aby koncentrace nepřesáhla hodnotu 40 % hmotn., výhodně 20 % hmotn.

Hodnota pH media může být v rozmezí od 4 do 10 výhodně v rozmezí od 5 do 8. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 10 do 50 °C,výhodněod 20 do 40 °C. __

Výhodná je biotransformace při vysoké hustotě buněk, zejména při hustotě buněk od Ούθ₅θ=20 do 00θ^₀=60.

Biotransformace se může provádět v nepřítomnosti alkoholů vytvořených při hydrolyse esterů prolinu, zejména v nepřítomnosti ethanolu, propanolu, butanolu, isopropanolu, isobutanolu, isopentylakoholu (isoamylakoholu) a benzylalkoholu. Odpovídájící alkoholy se mohou odstranit např. adsorpcí_____________________________

Takto získané deriváty D-prolinu vzorce II nebo III se mohou isolovat běžnými metodami zpracování.

Výhodně se způsob uskuteční bez izolace racemického derivátu prolinu vzorce V.

Výroba derivátu prolinu vzorce VI se uskuteční hydrolysou derivátu prolinu vzorce II. Hydrolysa se provádí v oboru běžnou metodou jako je například uvedeno v Organikum str. 476 a str.477

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Selekce mikroorganismů -zužitku jících prolinamid

Nejdřív se připravilo minimální medium (viz. tabulka 1), které splňuje požadavky pro růst mnoha mikroorganismů:

Tabulka 1: minimální medium

Na 2^θ4	o,i g/i
Na₂HPO₄.2H₂0	2,5 g/1
kh₂po₄	1,0 g/1
NaCl	3,0 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,4 g/1
CaCl₂.2H₂0	14,5 mg/1
FeCl_o.6H_n0	0,8 mg/1
roztok stopových prvků	1,0 ml/1
roztok vitaminů	1,0 ml/1
PH	7,0

Jako zdroj uhlíku (C-zdroj) se přidala fruktosa (5 g/1). Pro obohacení mikroorganismů, které jsou schopné hydrolysovat prolinamid, se k tomuto základnímu mediu přidal DL-prolinamid (1 g/1) jako jediný zdroj dusíku (N-zdroj). Různé vzorky se pak inokulovaly za použití vzorků půdy různého původu a tak dlouho inkubovaly (30 °C, 120 otáček/min), až se dal rozeznat zřetelný růst. Alikvotní část této kultury se pak přeočkovala do stejně velkého objemu čerstvého media a znovu se inkubobalo až do zřetelného zakalení. Tento postup se třikrát opakoval. Obohacené mikroorganismy se pak jednotily a čistily na pevném mediu (stejné složení jako kapalné medium, jen přídavek 20 g/1 agar-agaru). Takto se získalo více než 20 různých bakteriálních isolátů, který byly schopné zužitkovat prolinamid jako jediný N-zdroj.

Příklad 2

Testování selektovaných mikroorganismů na hydrolytickou aktivitu a selektivitu vůči prolinamidu, prolinesterů a N-methylprolinesterů

Isoláty získané metodou popsanou v příkladu 1 se namnožily v popsaném mediu, ovšem za použití L-prolinamidu (1 g/1) jako N-zdroj a malého množství extraktu kvasnic (0,2 g/1)· Takto obdržené buňky se získaly centrifugací a následně se resuspendovaly v roztoku pufru (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0) a promyly. Po dalším resuspendování v pufru se s buňkami v klidu testovala schopnost hydrolysovat L-proliamid. K tomu se vhodné množství buněk s určitým substrátem (4 g/1) inkubovalo (30 °C) v roztoku pufru (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0). V různých časových intervalech se odebíraly alikvotní části a testovaly pomocí tenkovrstevné chromátografie na uvolnění L-prolinu, popř. N-methyl-L-prolinu. Více isolátů prokazovalo právě požadovanou hydrolytickou aktivitu vůči L-prolinamidu a vůči různým esterům L-prolinu, popř. N-methyl-L-prolinu. V případě prolinamidu a prolinesterů se ještě testovala selektivita vůči L-enantiomerům a byly nalezeny některé kmeny, např. Klebsiella pneůmoniáe, Aeromonas sobria, Serratia plymuthica, Pseudomonas fluorescens Aureobacterium sp.(DSM 10203) s velkou enantiomerní selektivitou.

Příklad 3

Růst a enzymová aktivita Aureobacterium sp. LS10 ee

a) N-zdroje

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Přitom se přidávaly různé

N-zdroje (2 g/1; výjimka u a amidy kyselin. Kultury, (°^D650^{>0,5 za 48} hod.), peptonu: 10 g/1), jako aminokyseliny které dosáhly dobrou hustotu buněk se analyzovaly na jejich enzymovou aktivitu (hydrolýza L-prolinbutylesteru), Aktivita po pěstování s L-proliamidem jako N-zdrojem se použila jako 100 % hodnota.

Tabulka 2: Enzymová aktivita Aureobacterium sp. LS10 při pěstování s různými N-zdroji

N-zdroj	Relativní specifická aktivita [%]
peton	37
ammoniumsulfát	13
L-arginin	43
L-asparagin	51
L-glutamin	28
L-prolinamid	100
L-alaninamid	38
glycinamid	101
L-serinamid	246
L-valinamid ~	25 ··
amid kyseliny nikotinové	29
amid kys.DL-pipekolinové	44
amid kyseliny L-mléčné	477

• β

Velké množství N-zdrojů bylo možné použít pro růst

Aureobacterium sp. LS10, enzymová aktivita byla ovšem silně ovlivněna jak negativně tak také positivně (srovnej tabulku 2).

b) C-zdroje

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s L-amidem kyseliny mléčné (2 g/1) jako N-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Přitom se přidávaly různé C-zdroje (10 g/1). Kultury, které dosáhly dobrou hustotu buněk (OD₆₅₀>0,5 za 48 hod.), se analyzovaly na jejich enzymovou aktivitu (hydrolýza L-prolinbutylesteru). Aktivita buněk po pěstování na glukose jako C-zdroji se použila jako 100 % hodnota.

Tabulka 3: Enzymová aktivita Aureobacterium sp. LS10 při pěstování s různými C-zdroji

C-zdroj	Relativní specifická aktivita [%]
glukosa	100
D-fruktosa	87
D-xylosa	115
maltosa	120
sacharosa	105
glycerin	103 '
D-mannit	...... · 98 - ,
fumarát	56
L-aspartát	15
L-glutamát	22
pepton	17

·· ·· ► · · ► · ···

Aureobacterium sp. LS10 mohl zužitkovat různé C-zdroje, výhodné ovšem cukry a cukerné alkoholy. Enzymová aktivita byla ovlivněna jen při použiti aminokyselin jako C-zdroje (srovnej tabulku 3).

Přiklad 4

Induktory L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10

a) induktorový účinek různých molekul

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s extraktem kvasnic (2 g/1) jako N-zdrojem a glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem. Navíc se přidával kulturám, které se po dosažení dostatečné hustoty buněk analyzovaly na jejich enzymovou aktivitu (hydrolýza L-prolinbutylesteru), amid kyseliny L-mléčné nebo jiné sloučeniny strukturně příbuzné s amidem kyseliny L-mléčné (vždy 1 g/1), aby se testovala jejich potence jako induktoru L-prolinesterhydrolasy. Vedle racemátu amidu kyseliny mléčné měly indukční účinek přitom jen ještě N-methylové deriváty amidu kyseliny L-mléčné (srovnej tabulku 4).

Tabulka 4: Enzymová aktivita Aureobacterium sp. LS10 při pěstování s různými induktory

Induktor	Relativní specifická aktivita [%]
-	4
amid kys. L-mléčné	, _1θ0 ,₌ .
amid kys. DL-méčné	113
amid kys. N-methyl-L-mléčné	74
amid kys. N,N-dimethyl-L-mléčné	27

e β* 99 99 ti

Ί /1 _1_

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9999 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9 9

b) Optimální koncentrace induktoru

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval jako je popsáno u 4a): Jako induktor se použil amid kyseliny L-mléčné, amid kyseliny DL-mléčné nebo amid kyseliny N-methyl-L-mléčné v různých koncentracích. Po dosažení dobré hustoty buněk se určila enzymová aktivita (hydrolysa L-prolinbutylesteru). Enzymová aktivita při 1 g/1 amidu kyseliny L-mléčné se použila jako 100 % hodnota.

Obr. 1 ukazuje enzymovou aktivitu Aureobacterium sp. LS10 při pěstování s různými induktory při měnících se koncentracích.

Z výsledků je zřejmé, že indukující účinek má pouze L-enantiomer amidu kyseliny mléčné, přičemž optimální koncentrace je při 0,5 až 1,5 g/1. S rostoucí koncentrací induktoru opět enzymová aktivita klesá, což je pravděpodobně možné připsat inhibičnímu účinku ammonia uvolňujícího se při hydrolyse amidu.

Oproti tomu dosahuje' amid kyseliny N-methyl-L-mléčné rovné aktivity, protože je pravděpodobně rychlost hydrolysy zřetelně snížena. Amid kyseliny N-methyl-L-mléčné je nicméně účinný až při vyšších koncentracích než amid kyseliny L-mléčné, avšak při optimu (3,0 g/1) má vyšší enzymovou aktivitu.

Příklad 5

Vliv různých parametrů na aktivitu a stereoselektivitu L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem, amidem kyseliny L-mléčné (2 g/1) jako N-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Po dosažení dostatečné hustoty buněk se kultura sklidila, buňky se promyly a resuspendovaly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %). Alikvotní části této bakteriální suspense se při proměně různých parametrů testovaly na jejich hydrolvti ckou aktivitu vůč i L- popř. D-prolinbutylesteru._____________

-i c: x ->

« c e« · e ££ £ se?

• · · · · · · · • ·····« · · ·· • · · · · ♦ ee ec s s í • £ 4 • ♦ · ·· 4

a) Aktivita a stereoselektivita

Pro optimální štěpení racemátu prolinesteru je vedle pokud možno velké enzymové aktivity rozhodující především také pokud možno co největší stereoselektivita. Proto se zjišťovalo, které parametry na to mají vliv. Pro stanovení 100 % hodnoty pro enzymovou aktivitu se to vztáhlo k pokusu, při kterém se použily střední hodnoty pro všechny parametry.

Tabulka 5: Vliv pH, teploty a hustoty buněk na aktivitu a stereospecifitu L-prolinesterhydrolasy (hodnota E = quocient z aktivity vůči L-prolinesterům a odpovídajícím D-prolinesterům).

PH	Teplota [⁵C]	Hustota buněk [od₆₅₀]	Relativní objemová aktivita s L-esterem [%]	Hodnota-E
5,5	25	15	9	' 15
5,5	25	75	39	25
5,5	40	’ 15	42	18
5,5	40	75	166	21
6,3	35	45	100	9
7,0	25	15	24	8
7,0	25	75	97	9
7,0	40	15	62	9
7,0	40	75	237	9

Enyzrnová aktivita L-prolinesterhydrolasy jě dalekosáhle závislá na teplotě. Zvýšení teploty o 15 °C vede k přibližně čtyřnásobnému zvýšení aktivity. Rostoucí hodnota pH vede rovněž ke zvýšené aktivitě, avšak jen relativně malém rozsahu. Zvyšováním hustoty buněk je možné dosáhnout téměř proporcionální zvýšení aktivity. Stereoselektivita je oproti tomu dalekosáhle nezávislá na teplotě. Jako nejdůležitější parametr je zde hodnota pH, která by měla být pokud možno co nejnižší. Vysoká hustota buněk vede rovněž mírně ke zlepšené selektivitě. Z tohoto pokusu vyplývá, že se dosáhne nejlepšího kompromisu mezi enzymovou aktivitou a stereoselektivitou při nízkém pH, vysoké buněčné hustotě a vysoké teplotě.

b) Inhibice produktem

Protože se při hydrolyse L-prolinbutylesteru pomocí L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10 zjistila možnost inhibice aktivity enzymu butanolem uvolněným při reakci, prováděly se pokusy ke zjištění vlivu různých parametrů na tuto inhibici. Pro srovnání se uskutečnil pokus bez butanolu a aktivita enzymu přitom určená se stanovila jako 100 % hodnota.

Tabulka 6: Vliv teploty, hustoty buněk a koncentrace butanolu na aktivitu L-prolinesterhydrolasy

Teplota [⁵C]	Hustota buněk t°^D6503	Koncentrace butanolu [mM]	Relativní objemová aktivita s L-esterem C%]
27	15	100	4
27	15	250	0
27	75	100	49
27	75	250	40
32	45	175	39
37	15	100	0
37	15	250	0
37	“ 75 '	100	100 *
37	75	250	79
37	45	0	100

Jako podstatný parametr pro inhibici L-prolinesterhydrolasy butanolem se ukazuje hustota buněk. Při málé hustotě buněk _____,____způsobuje již 100 mM butanolu k úplné inaktivaci enzymu, přičemž • · ··· • · · · • ···· » · • · «

• · ·· ·· ··· · při vyšší buněčné hustotě i vyšší koncentrace butanolu jsou méně škodlivé. Se zvyšující se koncentrací butanolu se zvyšuje inhibiční účinek, ale pouze v poměrně malém rozsahu. Rovněž zvýšení teploty vede k zesílené inaktivaci enzymu. Pro zajištění úplné přeměny za dobré aktivity při specifické hydrolyse

L-prolinesteru musí tedy být nízké pH, vysoká hustota buněk a nízká teplota.

Příklad 6

Vliv různých alkoholů na aktivitu L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10

Protože butanol inhibuje enzymovou aktivitu L-prolinesterhydrolasy (srovnej přiklad 5), zkoumal se inhibiční účinek různých alkoholů. K tomuto účelu se Aureobacterium sp. LS10 pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem, amidem kyseliny L-mléčné (2 g/1) jako N-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Po dosažení dostatečné hustoty buněk se kultura sklidila. Buňky se promyly a resuspendovaly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %). Alikvotní části této bakteriální suspense se inkubovaly 30 minut při teplotě místnosti s různými alkoholy v různých koncentracích. Pak se určovala enzymová aktivita.

Obr. 2 ukazuje vliv různých alkoholů na aktivitu L-prolinesterhydrolasy

Tento pokus ukazuje, že všechny testované alkoholy s výjimkou methanólu mají negativní účinek na enzymovou aktivitu.

S rostoucí koncentrací se enzymová aktivita stále snižuje, v extrémním případě až na nulu. Přitom je možné zjistit, že tento negativní účinek se zesiluje s rostoucí hydrofobní vlastností alkoholů.

e· e · · · · β « e β e * * * * ··· · ···· · · · · • ···· · · · · · · ··· ···

Příklad 7

Hydrolysa různých prolinesterů pomocí L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10

Aktivita a stereoselektivita L-prolinesterhydrolasy vůči různým esterům prolinu se zkoumaly v závislosti na hodnotě pH. Přitom se zvolily estery, jejichž stabilita ve· vodě je dostatečně dobrá, aby se ee-hodnota znatelně nezhoršovala nespecifickou chemickou hydrolysou a při jejichž hydrolyse vznikají alkoholy, které mají co nejmenší negativní vliv na enzymovou aktivitu (srovnej příklad 6). K tomuto účelu se Aureobacterium sp. LS10 pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem, amidem kyseliny

L-mléčné (2 g/1) jako N-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Po dosažení dostatečné hustoty buněk se kultura sklidila. Buňky se promyly a resuspendovaly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %). Pak se určovala enzymová aktivita vůči různým Lpopř. D-prolinesterům.'Jako 100 % hodnota se stanovila hydrolysa L-prolinbutylesteru při pH 7,0. Stereoselektivita enzymu se určila na základě quocientu z aktivity vůči L-prolinesterům a odpovídajícím D-prolinesterům (E-hodnota).

Obr. 3 ukazuje enzymovou aktivitu L-prolinesterhydrolasy s různými L-prolinestery v závislosti na hodnotě pH

Tabulka 7: Stereoselektivita (E-hodnota) L-prolinesterhydrolasy s různými L-prolinestery v závislosti na hodnotě pH

	5,4	hodnota pH 6,2	7,0
prolinetyhlester	-	41	60
prolinpropylester	31	46	⁵⁶
proliisopropylester	>100	>100	>100
prolinbutylester	81	⁶⁸	33

c e e 9

9

Se všemi čtyřmi testovanými prolinestery roste enzymová aktivita s rostoucím pH. Hydrolysa L-prolinbutylesteru je znatelně pomalejší než hydrolysa třech zbývajících esterů. U všech čtyř esterů se L-enantiomer zřetelně rychleji hydrolysuje než D-enantiomer, takže jsou pozorovatelné dobré až velmi dobré E-hodnoty, přičemž se stereoselektivita může v závislosti na pH zmenšovat podle použitého esteru.

Příklad 8

Hydrolysa prolinisopropylesteru při různých koncentracích substrátu

S proliisopropylesterem, který se prokázal jako vhodný substrát, se mělo zkoumat, jaké koncentrace produktu jsou dosažitelné. K tomuto účelu se Aureobacterium sp. LS10 pěstoval v minimálním mediu popsaném v tabulce 1 s glukosou (10 g/1) jako C-zdrojem, amidem kyseliny L-mléčné (2 g/1) jako N-zdrojem a trochou extraktu kvasnic (0,2 g/1). Po dosažení dostatečné hustoty buněk se kultura sklidila. Buňky se pak promyly a resuspendovaly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %). Test se uskutečnil s DL-prolinisopropylesterem jako substrátem při různých koncentracích, zatímco ostatní parametry se udržovaly konstatní (25 °C, pH 6,0, OD_65q ca 15). V různých časech se odebíraly alikvotní části, které se pomocí HPLC analysovaly na obsah Dpopř. L-prolinisopropylesteru.

Obr. 4 ukazuje biotransformaci s Aureobacterium sp. LS10 při různých koncentracích substrátu ₌ , .....

i

Se 60 nebo 120 g/1 DL-prolinisopropylesteru se pozorovala velmi rychlá hydrolysa L-esteru, která vedla ke tvorbě D-esteru s ee-hodnotou přes 98 %. Při vyšších koncentracích substrátu (240 popř. 300 g/1) se zřetelně zpomalovala rychlost hydrolysy.

I

S rostoucí koncentrací uvolněného isopropanolu se reakce zpomaluje, takže úplná hydrolysa L-prolinisopropylesteru je ztížená. Vysoké ee-hodnoty—mohly být—pozorovány jen po delší

- 2U s e době inkubace, přičemž se však výtěžek D-esteru lehce 'snížil. Jako alternativní způsob se zdvojnásobila hustota buněk v násadě (OD₆₅o ^ca 30), což způsobilo při 240 g/1 DL-prolinisopropylesteru úplnou přeměnu L-esteru po asi 4 hod. jakož i ee-hodnotu přes 98 % zbylého D-prolinisopropylesteru.

Příklad 9

Výroba D-prolinu pomocí L-prolinesterhydrolasy z Aureobacterium sp. LS10

a) Pěstování Aureobacterium sp. LS10 na minimálním mediu

Aureobacterium sp, LS10 se pěstoval ve fermentoru Chemap (pracovní objem 5 1) v minimálním mediu (srovnej tabulku 1) s glukosou (30 g/1) a amidem kyseliny L-mléčné (4 g/1) jako C-zdrojem popř. N-zdrojem při 30 °C. Pro usnadnění růstu buněk, obsahovalo medium navíc malé množství extraktu kvasnic (0,7 g/1). V průběhu pěstování se podle potřeby buněk přidával další amid kyseliny L-mléčné až se dosáhlo dostatečně velké hustoty buněk (00^50 ^{ca 23}) a dobré specifické aktivity enzymu (>1,2 μιηοΐ se hydrolysuje L-prolinbutylesteru/min x ^OD65o)· ^Buóky se oddělily centrifugací, promyly v roztoku kuchyňské soli (0,9 %) a v tom konečně resuspendovaly. 401,4 g DL-prolinisopropylesteru se přidalo k suspenzi bakterií a objem se upravil přidáním vody na 4,5 1. Tato biotrarisformační násada se pak inkubovala 160 minut při 25 °C a pH 6,0 za míchání. Pak se buňky oddělily centrifugací a supernatant se zpracoval. Opakovanou eíektrodialysou při pH 6,3 se přitom nejdříve oddělil D-prolinisopropylester od L-prolinu. V dalším kroku se D-prolin alkalickou hydrolysou louhem sodným uvolnil z esteru a vytvořená kuchyňská sůl se oddělila pomocí elektrodialysy (pH6,3). Takto získaný roztok D-prolinu se zahustil až do sucha a nečistota způsobená žlutým barvivém se odstranila promytím krystalů D-prolinu ethanolem_abs(30 minut při 60 °C). Takto se nakonec isolovalo 64,0 g D-prolinu (53,7 % teoretic- kých), který měl jednak velmi dobrý obsah (>99 % titrimetricky) a jednak výbornou optickou čistotu (ee >99 % podle HPLC, [a]_D ²⁰=83,7 pro c=4 v kyselině

octové).

a) Pěstování Aureobacterium sp. LS10 na plném mediu

Aureobacterium sp. LS10 se pěstoval ve fermentoru Chemap (pracovní objem 2 1) v minerálním mediu (srovnej tabulku l) s glukosou (20 g/1) jako C-zdrojem a extraktem kvasnic (15 g/1) jako N-zdrojem při 30 °C. Medium vedle toho obsahovalo amid kseliny N-methyl-L-mléčné (3 g/1) jako induktor. Po dosažení dostatečné hustoty buněk (^ODg5o ^{ca 30}) ^se buňky sklidily centrifugací. Buňky měly po promytí a resuspendování v roztoku kuchyňské soli dobrou aktivitu (ca 1,1 μιηοΐ L-prolin-butylesteru hydrolysováno/min x OD^q) a část z toho (OD₆5o=21 pro V=l,15 1) se použila pro štěpení racemátu 228,2 g DL-prolinisopropylesteru. Po 5,5 hod. byla hydrolysa L-proliesteru úplná a buňky se oddělily centrifugací. 90 % vneseného D-prolinesteru bylo v roztoku ještě zjistilných, přičemž se stanovila velmi dobrá optická čistota (ee-hodnota=99 % pomocí HPLC).

Příklad 10

Chemické synthesy

10.1 Racemizace L-prolinu

Pro získání racemického prolinu se 160 g (1,39 mol) L-prolinu rozpustilo v 600 ml (10,49 mol) kyseliny octové a přidalo 20 g (277 mmol) butanalu. Tento roztok se zahřál v autoklávu na 100 °C a udržoval ma této tepltě po dobu 2 hodin. Po ochlazení se co nejvíce zahustil a racemický prolin vykrystalizoval přidáním 700 ml acetonu. Přitom se získalo po vysušení krystalů 144,4 g. prolinu (90,3 % teorie), jehož identita se potvrdila NMR-spektroskopií a který byl téměř racemický ([a]D24=-0,5 ° pro c=5 v 1N HCl).

Alternativně se mohl prolin racemizovat také v alkalickém vodném roztoku (srovnej jako část reakce v jedné nádobě v 10.3).

10.2 Esterifikace DL-prolinu

Pro výrobu racemického prolinisopropylesteru se 300g (2,61 mol) DL-prolinu a 1000 ml (13,06 mol) isopropanolu dalo do baňky se třemi hrdly. Tato směs se ochladila na 10 °C a pak se pomalu za udržení teploty přikapalo 380 ml (5,22 mol) thionylchloridu. Po skončení přidávání se nejprve míchalo 90 min. při teplotě místnosti a pak se roztok na několik hodin zahříval na zpětný tok. Po ochlazení a oddestilování zbylého rozpouštědla se

HPLC-analysa udala, že se i jiné prolinestery jako získalo 521,9 g hnědého oleje, jehož dosáhlo 95 % přeměny.

Stejným postupem se mohly vyrobit prolinmethyl-, proliethyl- a prolinbutylester jakož i odpovídající estery N-methylprolinu.

10.3 Reakce v jedné nádobě pro výrobu DL-prolinesteru

Za použití recámizace L-prolinu ve vodném alkalickém roztoku se může vyrobit DL-prolinisopropylester z L-prolinu také postupem v jedné nádobě. K tomu se rozpustilo 80 g (695 mmol) L-prolinu v 26 ml 4 N NaOH (104 mmol) a 148,5 g vody. Tento roztok se pak zahřál v autoklávu na 160 °C, přičemž se získal tlak asi 0,5 MPa a na této teplotě se udržoval 14 hodin. Pak se destilací odstranilo co nejvíc vody. Aby se odstranila zbytková množství vody, využilo se efektu azeotropní destilace po přidání 250 ml isopropanolu. Potom co se také isopropanol odstranil pokud možné co nejvíc pomocí destilace, přidalo se 78,5 g (2,43 mol) isopropanolu a směs se ochladila na 10 °C. Při udržení teploty na 5=10 °C se pak přikapalo 103,5 g (0,87 mol) thionylchloridu. Obsah se pak pomalu po dobu přes 2,5 hod. zahříval na ' 84 °C. Po odfiltrování bílé sraženiny (NaCl) a oddestilování rozpouštědla se získalo 138,4 g žlutavého oleje. Podle HPLC analysy bylo asi 70 % vneseného L-prolinu ve formě DL-prolinisopropylesteru.

10.4 Výroba N-methylprolinu

Pro výrobu N-methylprolinu se 115,1 g (1,0 mol) L-prolinu rozpustilo v 375,8 g 98 % kyseliny mravenčí (8,0 mol) a pak se pornaÍTT^prikapáTo 3 29yl g 36^, 5~% formaldehydu (4,0 mol).Reakce ··· · · · ·· ·· · · pak probíhala čtyři hodiny při 60 °C. Po oddělení rozpouštědel destilací zůstalo 184,5 g oranžového oleje. Ten se rozpustil ve 100 ml vody a pH se upravilo na 6,3 (pí) pomocí NaOH, takže se N-methyl-L-prolin vyskytoval jako smíšený iont. Voda se odstranila destilací a zbytek se smíchal se 180 ml ethanolu. Azeotropní destilací se odstranily zbytky vody. Zbytek se suspendoval v 500 ml ethanolu a udržoval při 8 °C několik hodin. Nerozpustné složky se pak odfiltrovaly a filtrát se zahustil do sucha. Po dalším rozpuštění ve 120 ml ethanolu vykrystalizoval N-methyl-L-prolin přidáním 95 ml etheru. Po oddělení a usušení krystalů zůstalo 74,6 g N-methyl-L-prolinu, jehož idetita byla potvrzena GC-analysou.

10.5 Synthesa N-methylprolinamidu

Aby se získal odpovídající amid z N-methylprolinu, ochladilo se 12,9 g (100 mrnol) N-methyl-L-prolinu a 100 ml (2,47 mol) methanolu na 0 °C a za udržení teploty se pomalu přikapalo 14,3 g (120 mrnol) thionylchloridu. Potom co se to míchalo při teplotě místnosti asi '90 min., se obsah 2,5 hodiny zahříval až ke zpětnému toku. Po odfiltrování nerozpustné nečistoty a zahuštění až do sucha, zůstalo 15,1 g olejovítého zbytku. Polovina z toho se přidala k 20 ml 50 % K₂CO₃ (0 °C) a za těchto podmínek nenabitý N-methyl-L-prolinmethylester se extrahoval celkem 60 ml etheru. 4,1 g zbytku po zahuštění až do sucha se rozpustilo v celkem 60 ml amoniakálního methanolu a po sedm dní se zahřívalo v autoklávu (40-80 °C). Zbytek vzniklý po zahuštění do sucha se pak rozpustil ve 20 ml methanolu, nerozpustná nečistota se odstranila filtrací a filtrát se nakonec zahustil do sucha. Přitom vznikly 3,0 g N-methyl-L-prolinamidu, jehož identita se potvrdila GC-analysou.

Claims

1. Mikroorgňaismy, vyznačující se tím, že jsou schopné zužitkovat derivát prolinu ve formě racemátu nebo opticky aktivních isomerů, vybraný ze sloučenin obecného vzorce I kde R¹ znamená alkyl, acyl nebo atom vodíku, R² znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a R³ znamená skupinu -NH₂, aryloxy nebo alkoxy, jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, jakož i enzymové extrakty z toho.

2. Mikroorganismy podle nároku 1 nebo 2 rodu Aureobacterium, Klebsiella, Aeromonas, Serratia nebo Pseudomonas.

3. Mikroorganismy podle nároku 3 rodu Aureobacterium.

4. Mikroorganismy podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3 druhu Aureobacterium sp. LS10 (DSM 10203) jakož i jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.

5. Enzym s aktivitou L-prolinesterhydrolasy a/nebo L-prolinamidhydrolasy, který se získá z mikroorganismů podle jednoho z nároků 1 až 4 a který je schopný hydrolysovat derivát prolinu ve formě racemátu nebo opticky aktivních isomerů, vybraný ze sloučenin obecného vzorce I ^r2\X\^^cor3 \-N (I) kde R³,R² a R³ mají uvedený význam, jakož i funkčně ekvivalentní varianty a mutanty z toho.

6. Způsob výroby derivátů D-prolinu obecného vzorce II

N (II) a/nebo III

N

R

COOH (III) kde R^,R² a R³ mají význam uvedený v nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci derivátu prolinu obecného vzorce I ^rÍ/\^^C0R v/ (I) kde R^-jR^ a R mají uvedený význam,, pomocí mikroorganismu a/nebo enzymového preparátu podle nároku 1 nebo enzymu podle nároku 5 za vzniku derivátu L-prolinu obecného vzorce III, jakož i popřípadě isolování této sloučeniny a/nebo derivátu D-prolinu vzorce II vzniklého při této reakci.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující že derivát prolinu obecného vzorce I tím, τ-?

kde R¹,!?² a R³ mají . uvedený význam, se vyrobí tak, že se. v. prvním stupni derivát L-prolinu obecného vzorce IV

COOH (IV) kde R² má uvedený význam, racemizuje na derivát prolinu obecného vzorce V

R< .COOH (V) kde R² má uvedený význam, a ten se ve druhém stupni převede na derivát prolinu obecného vzorce I ^R\^2y^C0R (I) kde R³,R² a R³ mají uvedeny význam.

8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se reakce derivátu prolinu obecného vzorce I provádí pomocí mikroorganismů druhu Aureobacterium sp. LS10 (DSM 10203) nebo pomocí jeho funkčně ekvivalentních variant a mutantů.

9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí při hodnotě pH od 4 do 10 a při teplotě od 10 do 50. °C.

IQ. Způsob výroby derivátu D-prolinu obecného.vzorce VI

COOH (VI) kde R^a R² mají význam uvedený v nároku 1, vyznačující se tím, že se v prvním stupni derivát L-prolinu obecného vzorce IV

R< -COOH (IV)

kde R² má uvedený význam, prolinu obecného vzorce V racemizuje na odpovídající derivát R\/^^c0011 \—M A Λ H (V) kde R² má uvedený význam, ten se ve druhém stupni převede na derivát prolinu obecného vzorce I

ΊΟ O , kde R , R a R mají uvedený význam, a ten se ve třetím stupni převede pomocí mikroorganismu a/nebo enzymového preparátu podle nároku 1 nebo pomocí enzymu podle nároku 5 na derivát L-prolinu obecného vzorce III '

N

COOH (III) přičemž při biotransformaci vzniká vedle derivátu L-prolinu obecného vzorce III derivát D-prolinu obecného vzorce II

COR (II), '-N který se ve čtvrtém stupni hydrolysuje na produkt vzorce VI.