DE2163792A1 - Verfahren zur Herstellung von Amino Penicillinen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Amino Penicillinen

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Description

PATENTANWÄLTE 2 Ί 63792
DR.-ING. VON KREISLER DR.-! NG. SCH O N WALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA !CELLER DR.-ING. KLOPSCH
KÖLN 1, DEIGHMANNHAUS
Köln, den 16.12.1271 Kl/Ax
üakeda Chemical Industries, Ltd.,
27s Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Verfahren zur Herstellung von Aminopenicillinen
Die Erfindung betrifft ein neues und großtechnisch vorteilhaftes Verfahren für die Herstellung von Aminopenicillinen, insbesondere von Aminopenicillinen der Formel
- com
O" COOH
in der R für einen sechsgliedrigen cyclischen Kohlenwasserstoff rest steht, der an seinem Ring einfach oder mehrfach substituiert sein kann, aus
1) einem α-substituierten a-Aminosäurederivat der Formel
■ ■ f 2
R-CH- COA (II)
in der R. die oben genannte Bedeutung hat und A ein Alkoxyrest, Carboxyalkylthiorest, eine Aminogruppe oder Carboxyalkylaminogruppe ist, und
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2) 6-Aminopenicillansäure
unter Verwendung eines Mikroorganismus, der eine neuartige Substratspezifität hat.
Bisher wurden Aminopenicilline durch die Kondensationsreaktion zwischen α-substituierten α-Aminosäuren und 6-Aminopenicillansäure mit Hilfe chemischer Reaktionen hergestellt. Bei diesen bekannten Verfahren ist es jedoch erforderlich, entweder die Aminogruppe der Aminosäuren zu schützen, um ihre Umsetzung mit der Carboxylgruppe zu verhindern, oder die Aminogruppe vorher in einen Rest, z.B. eine Azidogruppe (InU) umzuwandeln, der wieder in die Aminogruppe umgewandelt werden kann« Es ist somit notwendig, nach der Kondensationsreaktion entweder die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen oder den oben genannten Rest wieder in die Aminogruppe umzuwandeln. Ferner müssen diese liebenstufen des Verfahrens unter milden Bedingungen durchgeführt werden, damit die an diesen Reaktionen beteiligten Komponenten nicht beeinflußt werden und damit insbesondere die Penicillinkomponente oder die Säureamidbindung in der Seitenkette an der 6-Stellung nicht gespalten wird* Durch diese milden Bedingungen wird die Ausbeute an gewünschten Aminopenicillinen zwangsläufig verringert.
Inzwischen gilt die Herstellung der Aminopenicilline durch Mikroorganismen als vorteilhafter als· die chemische Herstellung, v/eil es nicht notwendig ist, die Aminogruppe der α-Aminosäure zu schützen, so daß die gewünschten Aminopenicilline in einer einzigen Stufe hergestellt werden können« Jedoch sind alle bisher versuchten Herstellungsverfahren mit Hilfe von Mikroorganismen auf solche Verfahren beschränkt, bei denen Mikroorganismen verwendet werden, die in hohem Maße die Fähigkeit haben, Penicillin G-, das keine Aminogruppe an der α-Stellung des IJ-Acylrestes enthält, aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure zu bilden. Diese bekannten Mikroorganismen zeigen eine besonders starke Aktivität zur Bildung von Penicillin G
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und eine verhältnismäßig geringe Aktivität zur Bildung von Arainopenicillinen. Beispielsweise ist die Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin aus 6-Aminopenicillansäure und Phenylglycinmethylester unter Verwendung eines solchen "bekannten Mikroorganismus viel unvorteilhafter als die Herstellung von Penicillin G aus 6-Aminopenicillansäure und Phenylessigsäuremethylester unter den gleichen Bedingungen»
Die "bekannten mikrobiellen Verfahren sind somit vom Standpunkt der Großherstellung der Aminopenicillane nicht sehr "befriedigend.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß unter den Mikroorganismen der Gattungen Mycoplana, Protaminobacter, ' Acetobacter, Pseudomonas, Aeromonas und Xanthomonas sehr häufig Mikroorganismen vorkommen·, die eine neuartige Substratspezifität aufweisen, d.h. Aminopenicilline aus α-substituierten a-Aminosäurederivaten und 6-Aminopenicillansäure zu bilden vermögen, aber im wesentlichen unfähig sind, Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure unter den gleichen Bedingungen zu bilden, und daß unter Verwendung dieser Mikroorganismen Aminopenicilline glatt und einfach in hoher Ausbeute aus α-substituierten a-Aminosäurederivaten und 6-Aminopenicillansäure hergestellt werden können«,
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß, ein neues und großtechnisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von a-Aminopenicillinen (I) aus α-substituierten a-Aminosäurederivaten und 6-Aminopenicillansäure ο
In der vorstehenden Formel (l) steht R für einen sechsgliedrigen cyclischen Kohlenwasserstoffrest, z.B. einen Phenylrest, Cyclohexenylrest (1-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl oder 3-Cyclohexenyl), einen Cyclohexadienylrest (z.B. 1,3-Cyclohexadienyl, 1,4-Cyclohexadienyl, 1,5-Cyclohexadienyl oder 2,5-Cyclohexadienyl) oder einen Cyclohexylrest, wobei alle diese Reste an ihrem Ring einfach oder· mehrfach substituiert sein können. Als Substituenten kommen bei-
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BAD
spielsweise Hydroxylgruppen, Halogenatome (z.B. Brom und Chlor), Alkylreste (z.B. Methylreste, Äthylreste.. Isopropylreste, Allylreste und Octylreste), Alkoxyreste (z,Bc Methoxyreste, A'thoxyreste, Isopropoxyreste, Allyloxyreste und Hexoxyreste), Carboxylgruppen, Mercaptogruppen, Cyangruppen, Nitrogruppen, Sulfogruppen, Aminogruppen und SuIfaminogruppen in Frage,,
In der Formel (II) ist R einer der oben genannten cyclischen Kohlenwasserstoffreste und A ein Alkoxyrest (z.B. Methoxy, Äthoxy, Propoxy, Isopropoxy, Allyloxy und Hsxoxy), ein Carboxyalkylthiorest (z.B. ein Carboxymethylthiorest und Carboxyäthylthiorest), eine Aminogruppe oder Carboxyalkylaminogruppe (z„B. eine Carboxymethylaminogruppe)« Mit anderen Worten, die α-substituierten a-Aminosäurederivate (II) sind Alkylester der α-substituierten α-Aminosäuren der Formel
R-CH- COOH (II«)
in der R die oben genannte Bedeutung hat, Thioester oder Amide dieser Säuren oder Dipeptide zwischen diesen Säuren und anderen Aminosäuren. Die α-substituierten α-Aminosäuren der Formel (II1) sind Phenylglycin, Cyclohexenylglycin, Cyclohexadienylglycin und Cyclohexylglycin, die an ihren Ringen einen oder mehrere der oben genannten Substituenten enthalten können. Als Beispiele von α-substituierten α-Aminosäuren (II1), deren cyclische Kohlenwasserstoffreste einen solchen Substituenten aufweisen, seien genannt: Monohydroxyphenylglycin, z.B. p-Hydroxyphenylglycin, Monohalogenphenylglycin, z»B, o-Chlorphenylglycin, Monoaminophenylglycin, z.B. m-Aminophenylglycin, Mononitrophenylglycin, z.B. p-Nitrophenylglycin, Monocarboxylphenylglycin, z.B. p-Carboxylphenylglycin, Monosulfophenylglycin, z.B. m-Sulfophenylglycin, Monomethoxyphenylglycin, z.B. p-Methoxyphenylglycin, Monoalkylphenylglycin, z.B. p-Methylphenylglycin, Monocyanphenylglycin, z.B. m-Cyanphenylglycin, Monosulfoaminophenylglycin, z.B. p-Sulfaminophenylglycin0
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Monosubstituierte Cyclohexadienylglycine, monosubstituierte Cyclohexenylglycine und monosubstituierte Cyclohexylglycine ' können in der gleichen Weise wie die oben genannten monosubstituierten Phenylglycine verwendet werden. Geeignet sind ferner Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexenylglyoin und Cyclohexylglycin, die zwei oder mehr gleiche oder verschiedene Substituenten enthalten. Als Substituenten kommen in diesem Pail beliebige Kombinationen der oben genannten verschiedenen Substituenten in Frage» Diese α-substituierten «-Aminosäuren (II') sind zum Teil neu, jedoch können sie leicht beispielsweise mit Hilfe der Strecker-Reaktion aus Aldehyden, die den entsprechenden Rest R enthalten, hergestellt werden.
Es gibt optische Isomere der jeweiligen α-substituierten a-Andnosäurederivate (II). Vom Standpunkt der antibakteriellen Wirksamkeit der erhaltenen Aminopenicilline (i) ist die Verwendung der D-Formen oder DL-Formen bezüglich des α-Kohlenstoffatoms dieser Derivate (i) zu empfehlen.
Die 6-Aminopenicillansäure (III), ein weiteres geeignetes Ausgangsmaterial, kann in Form der freien Säure oder als Salz, ZoB. als Hydrochlorid, Natriumsalz oder Kaliumsalz, verwendet werden. Lösungen, die ein Gemisch von Phenylessigsäure oder Phenoxyessigsäure und 6-Aminopenicillansäure enthalten, die durch Umsetzung von bekannter Penicillinacylase mit Penicillin G oder Penicillin V herstell- ' bar ist, können ebenso gut wie reine 6-Aminopenicillansäure verwendet werden»
Für das Verfahren gemäß der Erfindung werden Mikroorganismen verwendet, die zu den Gattungen Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Pseudomonas und Xanthomonas gehören, und die die Aminopenicilline (I) aus α-substituierten a-Aminosäurederivaten (II) und 6-Aminopenicillansäure zu bilden vermögen, aber im wesentlichen unfähig sind, Penicillin G aua Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure zu bilden. Diese Mikroorganismen können aus den bekannten
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Kulturen, die bei den Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen vorrätig sind, und auch aus der Natur isoliert werden. Als Beispiel wird nachstehend die Isolierung eines solchen Mikroorganismus aus der Natur "beschriebene
Zunächst werden Mikroorganismen, die gegenüber a-Aminobenzylpenicillin und einem der Aminopenicilline (i) resistent sind, und die sich durch Assimilierung von Phenylglycinmethylester, Phenylglycinthioglykolester oder N-(Phenylglycyl)glycin, die sämtlich zu den α-substituierten oc-Aminosäurederivaten (II) gehören, als einzige Eohleristoffquelle zu vermehren vermögen, vom Boden, aus Abwasser, Seewasser, Früchten oder aus der Luft isoliert» Unter den in dieser Weise isolierten Stämmen kommen geeignete Mikroorganismen, die ein Arainopenicillin aus einem α-substituierten a-Aminosäurederivat (II) (z.Bo. Phenylglycinmethyl— ester) und 6-Aminopenicillansäure ohne Schwierigkeiten und glatt zu bilden und anzuhäufen vermögen, aber im wesentlichen unfähig sind, Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure unter den gleichen Bedingungen anzuhäufen, mit großer Häufigkeit vor. Ein solcher Mikroorganismus mit dieser Substratspezifität war bisher nicht bekannt und ist von der Anmelderin entdeckt worden.
Als typische Beispiele von Mikroorganismen, die in der oben beschriebenen Weise aus der Natur isoliert worden und für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind zu nennen:
Mycoplana dimorpha IFO 13213, Protaminobacter alboflavus IFO 13221, Acetobacter sp. IFO 13209, Acetobacter sp. IFO 13210, Acetobacter sp. IFO 13211, Aeromonas sp. IFO 13212 und Xanthomonas sp„ IFO 13215. In der vorliegenden Beschreibung wird für die Gattung Acetobacter die Nomenklatur gemäß "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7.Auflage (1957), verwendet. Die IFO-Nummern sind die Zugangsnummern der beim Institute for Fer-
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mentation, Osaka, Japan, hinterlegten Mikroorganismen.
Die Mikroorganismen, die die neuartige Substratspezifität haben, können ebenso aus bekannten Kulturen gewählt werden, die bei den Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen gehalten werden. Als typische Beispiele von in dieser Weise aus den hinterlegten Kulturen ausgewählten Mikroorganismen sind die folgenden zu nennen: Acetobacter cerinus IPO 3263, Acetobacter dioxyacetonicus Ii1O 3271, Acetobacter pasteurianum IPO 3223, Acetobacter suboxydans IFO 3172, Acetobacter turbidans IPO 3225, Acetobacter xylinum IPO 3288, Xanthomonas citri IPO 3781, Xanthomonas oryzae IPO 3995 und Xanthomonas pruni IPO 3780".
Alle Mikroorganismen, die für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind somit Bakterien, die zur Pamilie Pseudomonadaceae gehören.
Indem 1) ein α-substituiertes cc-Aminosäurederivat (II) und 2) 6-Aminopenicillansäure der enzymatischen Wirkung eines solchen Mikroorganismus mit der genannten Substratspezifität unterworfen werden, ist es möglich, diesen Mikroorganismus in einem Kulturmedium zu züchten, das ein α-substituiertes a-Aminosäurederivat (II) und 6-Aminopenicillansäure enthält, jedoch ist es allgemein zu empfehlen, einen solchen Mikroorganismus vorher in einem gewöhnlichen Kulturmedium zu züchten und die erhaltene Kulturbrühe oder ihr verarbeitetes Material zu verwenden.
Die Kultivierung der Mikroorganismen kann unter Belüftung und unter Rühren, Schütteln oder unter statischen Bedingungen durchgeführt werden» Im allgemeinen ist die Kultivierung unter aeroben Bedingungen vorteilhaft.
Geeignet sind Kulturmedien, die Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser und andere natürliche Substanzen, die im allgemeinen für die Kultivierung verwendet werden, einzeln oder in Kombinationen enthalten. Diese Medien können wahlweise durch Kohlenstoff-.
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quellen wie Zucker, organische Säuren, η-Paraffine, anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, die Stickstoff in Arninoform und/oder Nitratform enthalten, Phosphate, Mangansalze, Natriumchlorid, andere ionische Metalle und/ oder Vitamine ergänzt werden» Die Medien werden vorzugsweise auf Ptt 6 bis 8 eingestellt. Bevorzugt werden Kultivierungstemperaturen von 20 bis 40°C, insbesondere von 28 bis 370C Die Kultivierungsdauer ist verschieden in Abhängigkeit von der Kultivierungsvorrichtung, der Zusammensetzung des Mediums, der Kultivierungstemperatur u.dgl., jedoch ist es zu empfehlen, die Kultivierung zu dem Zeit- ψ punkt abzubrechen, zu dem die Aktivität zur Synthetisierung von Aminopenicillin das Maximum von dem spaten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase zum frühen Stadium der stationären Phase erreicht. Im allgemeinen werden mit einer Kultivierungsdauer von 16 bis 40 Stunden gute Ergebnisse erhaltene
Die in dieser Weise erhaltenen Kulturbrühen oder ihre verarbeiteten Bestandteile eignen sich für die enzymatisehe Synthese von Aminopenicillinen (I) beim Verfahren gemäß . der Erfindung ο Der hier gebrauchte Ausdruck "verarbeitete Materialien oder Bestandteile der Kulturbrüheη" bezeichnet alle Materialien, die durch eine geeignete Behandlung oder ψ geeignete Behandlungen der Kulturbrühe zur Steigerung der Aktivität für die Synthetisierung von Aminopenicillinen gebildet und in eine für die enzymatische Reaktion vorteilhafte Form gebracht werden. Wenn beispielsweise diese Aktivität in den Bakterienz'ellen vorliegt, sind die verarbeiteten Materialien beispielsweise 1) Zells'Jispensionen, die durch Suspendieren der aus den Kulturbrühen isolierten und dann gewaschenen Zellen in Pufferlösungen verschiedener Konzentrationen herstellbar sind, 2) Zellextrakte, die mit Hilfe bekannter Extraktionsverfahren aus den Zellen erhältlich sind, und 3) gereinigte Enzympräparate, die die Aktivität zur Synthetisierung von Aminopenicillinen aufweisen und nach bekannten Verfahren aus den Zellextrakten herstellbar sind. In Fällen, in denen die Aktivität außerhalb.
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— Q —
der Bakterienzellen vorliegt, kommen als verarbeitete Materialien beispielsweise 1) die durch Entfernung der Zellen aus den Kulturbrühen erhältlichen Kulturflüssigkeiten und 2) gereinigte Enzympräparate in Präge, die die Aktivität für die Synthetisierung von Aminopenicillinen aufweisen und durch Reinigung der Kulturflüssigkeiten nach den für Enzyme allgemein b ekannten Verfahren herstellbar sind. ·
Die Kondensationsreaktion zwischen 1) einem α-substituierten a-Aminosäurederivat (II) und 2) 6-Aminopenicillansäure zur Bildung eines entsprechenden Aminopenicillins (I) verläuft glatt, wenn die beiden Verbindungen mit der oben genannten Kulturbrühe oder ihrem verarbeiteten Material in einem wässrigen Medium zusammengeführt werden. Unter einem "wässrigen Medium" ist im Rahmen dieser Beschreibung ein Medium zu verstehen, das hauptsächlich aus Wasser besteht. Beispielsweise kann das wässrige Medium ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, z.B. einen niederen Alkohol (z.B. Methanol, Äthanol oder Isopropanol), oder Aceton enthalten. Die Konzentration dieses organischen Lösungsmittels beträgt vorzugsweise weniger als etwa 40 Vol.-$, insbesondere weniger als etwa 20 Vol.-fo, bezogen auf das Gesamtvolumen des fertigen Mediums. Im allgemeinen ist es zu empfehlen, das wässrige Medium auf pH 4 bis 8, insbesondere auf einen pH-Wert von etwa 5 bis 7 einzustellen. Die Reaktionszeit variiert mit der Konzentration des Substrats, dem Grad der Aktivität der Kulturbrühe oder des verv/endeten verarbeiteten Materials zur Synthetisierung von Aminopenicillinen, der Reaktionstemperatur u.dgl„, jedoch liegt sie im'allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis 5 Stunden» Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft im Bereich von etwa 10 bis 500C. Besonders vorteilhaft ist eine Temperatur von etwa 20 bis 40'0Oo Die Substratkonzentration wird hauptsächlich in Abhängigkeit vom Grad der · Aktivität zur Synthetisierung von Aminopenicillinen gewählt,
8AD ORIGINAL
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- ίο -
Im allgemeinen wird die auf das gesamte wässrige Medium bezogene Konzentration der 6-Aminopenicillansäure aus einem Bereich von etwa 0,1 bis 5^ (Gewicht/Volumen) und die Konzentration des α-substituierten oc-Aminosäurederivats (II) aus einem Bereich von etwa 0,1 bis 10$ (Gewicht/Volumen) gewählt» Vorteilhaft wird das α-substituierte a-Aminosäurederivat (II) in wenigstens äquimolarer Konzentration, insbesondere in einer Menge von wenigstens 2 Mol pro Mol der eingesetzten 6-Aminopenicillansäure verwendet.
Das in dieser Weise hergestellte Aminopenicillin (I) läßt sich leicht aus dem Reaktionsgemiseh isolieren und nach bekannten Verfahren, z.B„ durch Chromatographie, unter milden Bedingungen reinigen»
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat insbesondere die folgenden Vorteile:
1) Es ist möglich, die Aminopenicilline (I) in hoher Ausbeute aus den α-substituierten a-Aminosäurederivaten (II) und der 6-Aminopenicillansäure ohne Spaltung des ß-Lactamringes der Penicilline herzustellen.
2) Es ist möglich, die Lösungen, die ein Gemisch von Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure enthalten, die durch Behandlung von billigem Penicillin G mit der bekannten Penicillinacylase erhältlich ist, direkt zu verwenden, da Penicillin G nicht in wesentlichem Maße gebildet wird, auch wenn Phenylessigsäure gleichzeitig in dem Reaktionssystem für die Herstellung von Aminopenicillin vorhanden ist.
3) Die Kultivierung der zu verwendenden Mikroorganismen ist sehr leicht«
4) Die gebildeten Aminopenicilline lassen sich sehr leicht aus den Reaktionsgemischen isolieren»
Das Verfahren gernäß der Erfindung ist somit für die G-roß-
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herstellung der Aminopenicilline (I) sehr vorteilhaft»
Die von der Anmelderin untersuchten Stämme von Pseudomonas haben jedoch eine verhältnismäßig hohe Aktivität für ß-Lactamase«
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen "beschrieben»
Der Versuch 1 veranschaulicht ein typisches Auswahlverfahren für die für die Zwecke der Erfindung geeigneten Mikroorganismenο Der Versuch 2 veranschaulicht die Charakteristiken des aus Flußwasser isolierten Stammes Aeromonas sp. IS1O 13212, einen der im Versuch 1 ausgewählten Mikroorganismen, und der Versuch 3 veranschaulicht das typische Verfahren zur "Herstellung von 1-Cyclohexenylglycinmethylester, einer neuen Verbindung, die als eines der α-substituierten oc-Aminosäurederivate (II) bei den in den Beispielen beschriebenen Versuchen verwendet wird.
Bei den nachstehend beschriebenen Versuchen und in den Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile und Rauniteile verhalten sich wie G-ramia zu Kubikzentimeter.
Versuch 1
Auswahl von Mikroorganismen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind»
Die Mikroorganismen, die sich sowohl auf dem Medium A '
2)
und dem Medium B , die nachstehend beschrieben werden, vermehren können, wurden aus dem Boden, aus Abwasser, Seewasser, Flußwasser, Früchten und aus der Luft isolierte Aus diesen isolierten Mikroorganismen wurden solche, die a-Aminobenzylpenicillin aus Phenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure leicht und glatt anzuhäufen vermögen, jedoch nicht fähig sind, eine wesentliche Menge Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure unter den gleichen Bedingungen zu bilden, nach dem
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folgenden Verfahren ausgewählt:
Jeder der isolierten Mikroorganismen wurde 2 Tage im Medium B ' kultiviert» Die erhaltene Kulturbrühe wurde in 300 ml des Mediums Q ' oder D ' in einem Erlenmeyerkolben geimpft und 40 Stunden bei 28°C unter Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus jeder erhaltenen Brühe isoliert, mit einer 0,1-molaren Citrat-Phosphat-Pufferlö'sung, die einen p^-Wert von 5,5 hatte, gewaschen und dann in 60 ml dieser Pufferlösung suspendiert, die pro ml 5 mg 6-Aminopenicillansäure und 20 mg D-PhenyIgIycinmethylester oder Phenylessigsäure enthielt. IUe Suspensionen wurden 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln bebrütet» Die Analyse der gebildeten Verbindung' wurde nach der für •Penicilline üblichen Methode, doh. durch den Biotest sowie durch Bioautographie unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Testmikroorganismus vorgenommen, wie in "Antibiotics & Chemotherapy", 3.» 50-54 (1953) beschrieben.
Beispiele von Mikroorganismen, die in dieser Weise ausgewählt wurden, sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Tabelle 1
Mikroorganismus ' Menge der angehäuften Verbin-
dung, mg/ml
a-Aminobenzyl- Penicillin G-penicillin
Mycoplana dimorpha
IFO 13213		 5,2 NB
Acetobacter spo
IFO 13211		 . 4,6 NB
Acetobaoter spo
IFO 13209		 4,8 NB
Acetobacter sp0
IFO 13210		 4,5 NB
Aeromonas sp.IFO 13212 ;.4,6 NB
Xanthomonas sp. IFO 13215 4,2 NB
Protaminobacter alboflavus
IFO 13211		 4,5 HB
BAD ORfGINAL
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"NB" bedeutet, daß das Produkt nicht nachgewiesen werden
konnte und daher seine Menge geringer war als etwa . 0,01 mg/ml.
1): Medium A ·
Bacto-Nutrient Broth, dehydratisiert 0,8$ (im Handel erhältlich, Hersteller Difco laboratories, U0S.A.)
Eurocidin 10 üg/ml
a-Aminobenzylpenicillin 1 «g/ml
Agar 2$
2): Medium B
D-Phenylglycinmethylester
(oder D-Phenylglycylglycin) 0,1$
• Hefeextrakt · . 0,01$
? H2O 0,01$
·. 0,004$
K2HPO4 . 0,01$
Harnstoff 0,002$
Eurocidin 10 ug/ml
Agar . 2$
3): Medium 0
Fleischextrakt . 1,0$
Hefeextrakt 0,5$
Pepton 1,0$
NaCl 0,5$
D-Phenylglycinmethylester 0,05$
PH7,2
4): Medium D
Fleischextrakt · 1,0$
Hefeextrakt 0,5$
^Pepton 1,0$
NaCl ' < 0,5$
Phenylessigsäure 0,05$
PH7,2
209830/1183
5): Medium E .
. Fleischextrakt · 1
Hefeextrakt 0
Pepton 1»0$
NaCl 0,5$
PH7,2
Versuch 2
Charakteristiken von Aeromonas sp. IFO 15212 Kurze Stäbchen, 0,6 χ 1 bis 2 ju. Beweglich mit Hilfe von fc polaren Geißelnο Granmegativ,
Agarkolonien: kreisförmig, stumpfgelb, gewölbt, halbtrans^
parent.
Agar-Schrägkultur: fadenförmig, stumpfgelb, glatt. Brühe: trübe, mit Pellikula
Lackmusmilch: sauer, koaguliert. Kartoffel: gelblichbraun
Indole gebildet.
Nitrite aus Nitraten gebildete
Schwefelwasserstoffbildung
Katalase: positiv
Säure und Gas aus vielen Kohlenhydrateη ^ Stärke hydrolysiert.
Die Zellen binden keinen freien Stickstoff aus der Atmo-■ Sphäre.
Yersuch 3
A) Herstellung von DL-1-Cyclohexenylglycin Eine Lösung von 4,4 Gew.-Teilen 1-Cyclohexen-i-aldehyd in 8 Raumteilen Methanol wird zu einer Lösung von 2 Gew,-Teilen Hatriumcyanid und 2,36 Gew„-Teilen Ammoniumchlorid in 8 Raurateilen Wasser gegeben* Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 20 Raumteile Wasser zugesetzt werden. Die erhaltene Aminonitrilverbindung wird mit 20 Raumteilen Benzol extrahiert. Die Benzolschicht wird dreimal mit je 10 Raumteilen 6n-Saizsäure extrahiert., Die wäsarige Schicht wird 2 Stunden ani Rückflusskühler
ΛΛ „,«-,«., BADOStGtNAL
erhitzt. Die harzartige Substanz wird mit Aktivkohle entfernt und das Filtrat auf etwa 15 Raumteile eingeengt und mit konzentriertem wässrigem Ammoniak (28$ig) auf einen PjT-Wert von etwa 5,0 eingestellt, wobei sich rohe Kristalle von DL-1-Cyclohexenylglycin abscheiden. Die Kristalle werden abfiltriert und in einer wässrigen 1n-Natriumhydroxydlösung gelöst. Nach Zusatz von Aktivkohle zur Lösung wird das Gemisch filtriert. Zum Filtrat wird Äthanol (halbes Volumen des Filtrats) gegeben. Das Gemisch wird gekocht, worauf sein p^-Wert mit Salzsäure auf etwa 5,0 eingestellt wird. Hierbei werden 1,1 Gew„-Teile DL-I-Cyclohexenylglycin in Form von farblosen Flocken vom Schmelzpunkt 242-243°C erhalten»
IR (KBr, cm"1): ·
3160, 2960, 1605, 1490, 1400, 1345, 1274, 1145, 720.
NMR (Lösungsmittel: In-NaOD):
1,5 - 2,4 (Multiplett, 8H)
3,81 (Singlett, 1H, -CH - COOH)
5,84 (Multiplett, 1H, -CH = C - )
B) Herstellung von DL-I-Cyclohexenylglycinmethylester
10 Gew.-Teile DL-I-Cyclohexenylglycin werden in 100 Raumteilen Methanol suspendiert. Während die erhaltene Suspension auf etwa -15 0 gekühlt wird, werden 80 Gew,-Teile Thionylchlorid zugetropft» Nach erfolgtem Zusatz wird das Gemisch 3 Tage bei 4°C stehen gelassen. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengte Der Rückstand wird aus 20 Raumteilen eines Gemisches von Methanol und Diäthyläther (Volumenverhältrnis 1:1) kristallisiert, wobei etwa 10 Gew.-Teile DL-I-Cyclohexenylglycinniethylester erhalten werden.
BMR (in D0O), S (ppm): 1,7B (4 Protonen an den C-4- und
B C-5-Kohlenstoffatomen des Ringes), 2,05 (4 Protonen an den C-2-und C-6-Kohlenstoffatomen des Ringes), 3,92S (3 Protonen des Methylrestes), 4,64 (1 Proton am α-Kohlenstoffatom), 6,21 (1 Proton am olefinischen Kohlenstoff des
";v 209830/1 183 Bad
Rings).
S = Singlett B = "breit
O) Herstellung von D-1-Cyclohexenylglycinmethylester
Zu einer mit 2n-Natriumhydroxyd auf pH 7,2 eingestellten. Lösung von 10 Gewo-Ieilen DL-l-Cyclohexenylglycinmethylesterhydrochlorid in 1000 Raumteilen Wasser wird 1 Gew.-Teil eines im Handel erhältlichen Chymotrypsin ("a-Chyinotrypsin", Hersteller Sigma Chemical Company, Missouri, UoSoA.; Chymotrypsinaktivität 50 Einheiten/mg) gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 23°C bebrütet, wobei der PjT-Wert durch Zusatz von In-latriumhydroxyd bei 7,2 gehalten w.irdo
Das Reaktionsgemisch wird mit 5n-Natriumhydroxyd auf PH 8,0 eingestellt und dann fünfmal mit je 1500 Raumteilen Diäthyläther extrahiert. Die erhaltene Diäthylätherschicht wird bei 250C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein brauner öliger Rückstand erhalten wird. Nach Zugabe von 100 Raumteilen Methanol, das mit HCl gesättigt ist, wird das.Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Dem erhaltenen Rückstand werden 30 Raumteile Diäthyläther zugetropft. Das Gemisch v/ird eingedampft, wobei 3,5 Gew„-Teile D-l-Cyclohexenylglycinmethylester erhalten werden0 Spezifische Rotation: /α_7·η = -115 (C=O,5, Ο,Ιη-HCl)ο Das MiR-Sρektrum dieses Esters ist mit dem des DL-l-Cyclohexenylglycinmethylesters identische
Beispiel 1
Die Kondensationsreaktionen zwischen DL-1-Cyclohexenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure, zwischen DL-Cyclohexylelycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure und zwischen D-Phenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure wurden unter Verwendung der Mikroorganismen durchgeführt, die auf die im Versuch 1 beschriebene Weise ausgewählt wurden« Die Reaktionen wurden unter den gleichen·
2098 30/1163
Bedingungen wie der Versuch 1 durchgeführt mit dem Unterschied, daß das Medium E an Stelle des Mediums C oder D für die Kultivierung der Mikroorganismen verwendet wurde« Die Mengen der angehäuften Aminopenicilline sind nachstehend in Tabelle 2 genannt.
Tabelle 2
Mikroorganismus
cc-Aminobenzylpenicillin mg/ml
6~(a-Araino- 6-(a-Amino-
1'-cyclo- cyclohexyl-
hexenyl- acetamido) -
acetamido)- penicillan-
penicillan- säure ääure,mg/ml mg/ml .
Micoplana dimorpha IFO 13213
Acetobacter sp„
IPO 13211
Acetobacter sp".
IPO 13209
Acstobacter sp„
IPO 13210
Aeromonas sp„
IPO 13212
Xanthomonas sp«,
IPO 13215
4,4 3,5 4,5 .4,7 4,2
3,5
2,8
0,5
3,4
0,5
0,8
1,5
0,6 0,4 3,2 1,8 0,5 1,8
Beispiel 2
Die durch Schräg-KUltivierung für 2 Tage erhaltenen Kulturbrühen von Acetobacter cerinus IPO 3263, Acetobacter dioxyacetonicus IPO 3271, Aeetobacter pasteurianum IPO 3223, Acetobacter suboxydans IPO 3172, Acetobacter turbidans IPO 3225, Acetobacter xylinum IPO 3288 und Xanthomonas citri IPO 3781 wurden in 3 Raumteile des Mediums E geimpft und 2 Tage bei 280G unter Schütteln bebrütet. Jede der erhaltenen Kulturbrühen wurde in 300 Raumteile des Mediums C geimpft und 40 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet ο Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus den Kulturbrühen abgetrennt, mit einer 0,1-molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung von Ρττ 5,5 gewaschen, in 60 Raumteilen der Pufferlösung suspendiert, die pro ml 5 mg 6-Amino-
209830/1163
penicillansäure und 20 mg D-Phenylglycinmethylester enthielt, und 1 Stunde unter Schütteln bei 37°C bebrüteto Die Mengen des angehäuften oc-Aminobenzylpenicillins sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Mikroorganismus ce-Aminobenzylpenicillin
- mg/ml
Acetobacter cerinus IFO 3260 3»5
Acetobacter dioxyacetonicus
IFO 3271 4,2
Acetobacter pasteurianum
IPO 3223 3,2
Acetobacter suboxydans IFO 3172 3,8
Acetobacter turbidans IFO 3225 2,5
Acetobaeter xylinum IFO 3288 3,6
Xanthomonas citri IFO 3781 3,8
Beispiel 3
3 Raumteile der Zweitagekultur von Esche.richia coli IFO 32.10 wurden in 300 Raumteile des Mediums D geimpft und 48 Stunden unter Schütteln bei 37°C bebrütet. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit 3,3 GeWo-Teilen Kaliumpenicillin & versetzt, das in einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung von ρΗ 6,0 gelöst war, und 16 Stunden der Reaktion überlassen, wobei das Penicillin G vollständig , zu 6-Aminopenicillansäure und Phenylessigsäure zersetzt wurde.
Nach der Abtrennung der Zellen des Mikroorganismus wurden zum Reaktionsgemisch 8 Gew.-Teile D-Phenylglyeinmethylester und 6 Gew„-Teile gewaschene Zellen von Micoplana spo IFO 13213 gegeben. Dieser Mikroorganismus war durch Kultivierung im Medium C auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Schütteln bei 37°C bebrütet, wobei 4,5'mg/ml α-Aminobenzylpenicillin darin angehäuft wurden.
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Beispiel 4
30 Raumteile einer Viertagekultur von Pusarium solani IPO 8509 wurden in 1000 Raumteile eines Kulturmediums geimpft, das 3$ Saccharose, 0,2$ Natriumnitrat, 0,1$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05$ Kaliumchlorid, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,001$ Eisen(ll)-sulfat und 0,05$ Phenoxyessigsäure enthielt (p^ 6). Dann wurde 4 Tej-ge unter Schütteln "bei 280C "bebrütet. Zur erhaltenen Kulturbrühe wurden 10 Gew.-Teile Kaliumpenicillin V gegeben, das in 100 Raumteilen einer 0,25-molaren Phosphatpufferlösung von p„· 7 gelöst war. Das Gemisch wurde 16 Stunden unter Schütteln bei 280C bebrüteto Die Zellen des Mikroorganismus wurden vom Gemisch abfiltriert, wobei eine Lösung erhalten wurde, die 5,3 mg 6-Aminopenicillansäure pro ml (gemessen mit Hilfe der Ninhydrinreaktion) und eine ungefähr äquimolare Menge Phenoxyessigsäure enthielt.
Getrennt hiervon wurde Acetobacter sp. IE1O 13209 in 5000 Raumteile des Mediums E geimpft und 20 Stunden bei 370C bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 1000 Raumteilen einer 0,9$igen Kochsalzlösung gewaschen.
Zu der oben genannten Lösung, die 6-Aminopenicillansäure enthielt, wurden 75 Gew.-Teile der in der vorstehend beschriebenen ¥eise erhaltenen nassen Zellen von Acetobacter sp. IPO 13209 und 20 Gew.-Teile D-Phenylglycinmethylester gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Schütteln bei 37 C bebrütet, wobei 4,8 mg a-Aminobenzylpenicillin pro ml darin angehäuft wurden.
Beispiel 5
0,5 Raumteile der Zweitagekultur von Protaminobacter alboflavus IPO 13221 wurden in 30 Räumteile eines Kulturmediums geimpft, das 1,0$ fleischextrakt, 1,0$ Pepton und 0,5$ Natriumchlorid enthielt (pH 7,2), worauf 48 Stunden unter Schütteln bei 280C bebrütet wurde.
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Der erhaltenen Kulturbrühe wurden D-Phenylglycinmethylester, DL-4-Hydroxyphenylglycinmeth3rlester oder DL-4-Hydroxy-3,5-dichlorphenylglycinmethylester als Lösung in 15 Raumteilen einer 0,25-molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung, die einen Pjr-Wert von 4,5 hatte, und 6-Aminopenicillansäure in solchen Mengen zugesetzt, daß die endgültigen Konzentrationen jeweils 1 mg/ml "betrugen. Die Gemische wurden 1 stunde unter Schütteln bei 370C bebrütet, wobei pro ml 0,7 mg a-Aminobenzylpenicillin aus 6-Aminopenicillansäure und ■ D-Phenylglycinmethylester, 0,3 mg 6-/ä-Amino-α-(4-hydroxy-
phenyl)acetamid£7penicillansäure aus 6-Aminopenicillansäure fc und DL-4-Hydroxyphenylglycinmethylester und 0,4 mg 6-/ä-Amino-a-(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyl)acetamid£7penicillansäure aus 6-Aminopenicillansäure und DL-4-Hydroxy-3,5-dichlorphenylglycinraethylester gebildet wurden.
Beispiel 6
Je 1 Raumteil der Zweitagekultur von Mycoplana dimorpha IFO 13213, Acetobacter xylinum IFO 3144 und Acetobacter pasteurianum IFO 3323 wurde in 30 Raumteile eines Kulturmediums geimpft, das 1^ Fleischextrakt, 1$ Pepton und 0,5$ Natriumchlorid enthielt (pH 7,2), worauf 48 Stunden unter Schütteln bei 280O bebrütet wurde. Jeder erhaltenen Kulturbrühe wurden Dl-4-Hydroxyphenylglycinmethyle3ter oder P DL-4-Hydroxy-3,5-dichlorphenylglycinmethyle3ter als Lösung in 15 Raumteilen einer 0,25-niolaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung, die einen p^-Wert von 4,5 hatte, und 6-Aminopenicillansäure in solchen Mengen zugesetzt, daß die JBndkonzentrationen jeweils 1 mg/ml betrugen. Die Gemische wurden 1 Stunde bei 370C bebrütet. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.
2 0 9 8 3 0/1163
Ί -
Tatelle 4
Mikroorganismus Angehäufte Angehäufte
Menge
6-/a-Amino-		 Menge 6-/a-
Amino-a-T3,5-
a-T4-hydro- dichlor-4-
xyphenyl)- hydroxyphe nyl)
acetamid£7- a c e t ami d£7p e ßi
penicillan- cillansäure,
- säure, mg/ml mg/ml
Mycoplana dimorpha IFO 13213 0,3 0,4
Acetobacter xylinum
IPO 3144 0,3 0,2
Acetobacter pasteurianum
IFO 3223 0,4 0,1
Hierbei ist zu bemerken, daß die 6-/a-Amino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamid£7penicillansäure aus 6-Aminopenicillansäure und DL-4-Hydroxyphenylglycinmethylester' und die 6-/ä-Amino-a(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyl)acfitamid£7penicillansäure aus 6-Aminopenicillansäure und DI-3,5-Dichlor-4-hydroxyphenylglycinmethylester gebildet wurde.
Beispiel 7
Zu je 30 Raumteilen der 48-Stunden-Kulturen von Xanthomonas sp„ IFO 13215 und Xanthomonas citri IFO 3781, die auf die in Beispiel 5 beschriebenen Weise erhalten wurden, wurden D-Phenylglycinmethylester oder I>I-4-Hydrox3?-phenylglycinmethylester als Lösung in 15 Raumteilen einer 0,25-molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung, die einen ρττ-Wert von 4,5 hatte, und 6-Aminopenicillansäure in einer solchen Menge gegeben, daß die Endkonzentrationen jeweils 1 mg/ml betrugen. Die Gemische wurden 1 Stunde unter Schütteln bei 37°C bebrütet«
Im Falle der Kultur von Xanthomonas sp. IFO 13215 wurden pro ml 0,5 mg a-Aminobenzylpenicillin aus D-Phenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure-und 0,2 mg 6-/a-Araino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamid£7-penicillansäure aua DL-Hyclroxyphenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure gebildete
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Im Falle der Kultur von Xanthomonas citri IEO 3781 wurden pro ml 0,4 mg oc-Aminobenzylpenicillin und 0,6 mg 6-/a-Amino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamidjD7penicillansäure aus den entsprechenden Vorprodukten gebildet.
Beispiel 8
Xanthomonas oryzae IFO 3995 wurde in 5 Raurateile eines Kulturmediums geimpft, das 2,0$ Saccharose, 0,2$ Mononatriumglutamat, 0,2$ Hefeextrakt, 0,5$ Pepton, 0,2$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1$ Magnesiumchlorid und P 0,01$ Eisen(Il)-sulfat enthielt (Pg 7,2) (nachstehend wird dieses Medium als "Medium F'1 bezeichnet) und 1 Tag unter Schütteln bei 280C bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in 100 Raurateile des Mediums F geimpft und 1 Tag unter Schütteln bei "280C bebrütet.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe abgetrennt und mit 100 Raumteilen einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung von ρΗ 6,0 gewaschen. Die Zellen wurden in 1Ö0 Raumteilen der Pufferlösung suspendiert, die durch 2 Gew.-Teile D-Phenylglycinmethylester und 1 Gew,-Teil 6-Aminopenicillansäure ergänzt worden war. Das Gemisch wurde 2 Stunden unter Rühren bei 37 C bebrütet, wobei der " Po-Wert durch Zusatz von 1n-Natriumhydroxyä bei 6,0 gehalten wurde. Hierbei wurden 11,5 mg a-Aminobsnzylpenicillin pro ml gebildet.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Der erhaltene Überstand wurde durch eine Kolonne.geleitet, die mit 160 Raumteilen eines im Handel erhältlichen Polystyrolharzes als Adsorptionsmittel gefüllt war ("Amberlite XAD-2", Hersteller Rohm & Haas Co., USA)« Die Säule wurde zuerst mit 400 Raumteilen destilliertem Wasser und anschließend mit 500 Räumteilen eines Gemisches von Wasser und Methanol (Volunienverhaltnis 4s 1 ) gewaschen und dann mit einem Gemisch von Wasser und Methanol (VoIu-. menverhältnis 1:1) eluiert, wobei die gewünschte Verbindung gewonnen wurde. Das ISluat wurde unter vermindertem
Druck eingedampft, wobei 0,83 G-ew.-Teile ct-Aminobenzylpenicillin in Form von Kristallen vom Schmelzpunkt 200 bis 2020C (Zerso) erhalten wurden« Das Infrarotspektrura dieser Verbindung ist identisch mit dem eines authentischen a-Aminobenzylpenicillinmononydrats.
Beispiel 9
30 Raumteile der 24-Stunden-Kultur von Acetobacter sp„ IPO 13209 wurden in 2000 Raumteile eines Kulturmediums geimpft, das 1^& Glucose, 1$ Fleischextrakt, Λ$ Pepton und 0,5$ Natriumchlorid enthielt (ρ™ 7,0), worauf 24 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 28 C bebrütet wurde.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren von der Kulturbrühe abgetrennt, in 200 Raumteilen einer 0,005-molaren Phosphatpufferlösung, die einen pH-Wert von 6,0 hatte, suspendiert und dann 20 Minuten bei 10 kHz beschallt. Die erhaltenen Sonikate wurden der Einwirkung von Desoxyribonuclease unterworfen, zur Entfernung von Proteinen mit Calciumphosphatgel und dann mit einer gesättigten 60$igen Ammoniumsulfatlösung behandelt, wobei eine Fällung gebildet wurde« Die Fällung wurde in 0,01-molarer Phosphatpufferlösung, die einen p^-Vert von 6,8 hatte, gelöst, über Nacht dialy_ siert und dann zur Entfernung unreiner Proteine mit Diäthylaminoäthyleellulose behandelt» Die hierbei erhaltene Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 0,3 Gew.-Teile rohes pulverförmiges Enzym erhalten wurden«
Zu einer Lösung von 0,08 Gev;»-Teilen des rohen pulverförmigen Enzyms in 100 Raumteilen einer 0,01-molaren Phosphatpufferlösung wurden 1,1 Gew.-Teile ICalium-6-aminopenicillanat und 3 Gew.-Teile D-Phenylglycinmethylester gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C bebrütet. Während dieser Zeit wurde das Gemisch durch Zusatz von 0,1n-Natriumhydroxyd bei p™ 6,0 gehalten ο Durch Behandlung des Reaktionsgemisches auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden 0,42 Gew«-Teile α-Aminobcnzylpenicillin in Form von Kristallen isoliert,,
2 0 9 8 3 0/1163 **D ORiOtNAL
Beispiel 10
Xanthomonas pruni IFO 3780-wurde in 50 Raumteile des in
Beispiel 8 beschriebenen Mediums F geimpft und unter
Schütteln 24 Stunden bei 280C kultiviert. Die erhaltene
Brühe wurde in 500 Raumteile des Mediums F geimpft und
unter Schütteln 24 Stunden bei 280C bebrütet.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe abgetrennt und mit 100 Raumteilen einer 0,05-molaren Phosphatpufferlösung, die einen p^-Wert von 6,0 hatte, ge-
^ waschen. Die Zellen wurden in 200 Raumteile dieser Puffer-™ lösung suspendiert, die durch 2 Gew.-Teile D-1-Cyclohexenylglycinmethylester und 1 Gewo-Teil 6-Aminopenicillansäure ergänzt worden war. Das Gemisch wurde unter Bewegung 1 Stunde· bei 370C bebrütet. Hierbei wurde der pH-Wert durch Zusatz von In-iiatriumhydrcxyd bei 6,0 gehalten»
Durch weitere Behandlung des Reaktionsgemisches auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden 0,42 Gew.-Teile
6-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetamido)penicxilansäure in Form von weißen Kristallen isoliert.
Schmelzpunkt 182-184°0 (Zefs.)
Spezifische Drehung: /äJ7^°° = 225° (C=O,5, 0,In-HCl) I.. UMR (in D2O) C^ppm: 1,79s (2-CH5), 1,92s (2-CH3),
4,50s (3-H), 4,82° (Wasserstoff am a-Kohlenstoffatom an der Seitenkette), 5,80B (6-H+7-H), 6,22 (olefinischer Wasserstoff am Cyclohexenring)
Die antibiotische Wirkung dieses Produkts auf verschiedene Mikroorganismen ist nachstehend in Tabelle 5 genannt.
209830/1 163
Tabelle
Mikroorganismus
Hemmende Mindestkonzentration, ug/ml
Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus Hr087 Bacillus subtilis PCI Sartina lutea PCI 1001 Escherichia coil NIHJ iflebsiella pneumoniae KbI Proteus vulgaris Eb51 Proteus morganii Eb53 Proteus morganii Eh54 Proteus mirabilis Eb59 Pseudomonas aeruginosa PdI Pseudomonas aeruginosa 10490
0,05 50
0,02 <0,01
0,5 >100
10' >100
100
100
Beispiel
Me in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen wurden in 50 .Raumteile des in Beispiel 8 beschriebenen Mediums P oder des Mediums G- ' geimpft und unter Schütteln 18 Stunden bei 280C bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren von den Kulturbrühen abgetrennt und in 5 Raumteile einer 0,2-ciolaren Phosphatpufferlösung-suspendiert, die einen Pjj-Wert von 6,0 hatte. Den Lösungen wurden je 0,1 Gew„-Teile 6-Aminopenicillansäure und je 5 Raumteile einer 0,1-molaren JLjHPO.-LÖsung zugesetzt, die 0,3 Gewo-Teile eines der in Tabelle 6 genannten D-Phenylglycinderivate enthielte Die Gemische wurden unter Schütteln 30 Minuten bei 37°C bebrütet, wobei in allen Geniischen a-Aminobenzylpenicillin angehäuft wurde. Die Mengen des angehäuften a-Aminobenzylpenicillins in mg/ml sind in Tabelle 6 genannt.
209830/1163
Mikroorganismus
Tabelle
Verwendete D-Phenylglycinderivate
Medi tun i
EuIti Methyl- Äthyl- n-Propyl- Iso- tert„- Thio- D-Phenyl- D-Ιϊ-(Ph enylvierune esi:er ester ester propyl-Butyl- glylcol- glycin- glycyl)-e ester ester ester araid glycin
Xanthomonas citri
IPO 3781 P 5,0
Xanuhomonas ,oryzae
IPO 3995 .' P 5,5
Acetobacter Sp0
IPO 13209 G 5,5
Acetobacter pasteu-
rianum IPO 3223 G 5,1
Acetobacter turbi-
dans IPO 3225 G 5,5
Acetobacter xylinum
IPO 3288 G 3,0
Hycoulana di'morpha
IPO 13213 * G 5,5
Protaminobacter
alboflavus
IPO 13211 G 1,6
5,0 5,0 4,2
4,9
5,0 2,0 5,5
5,0 5,0 4,2 5,0
5,2 2,5 5,0
1,6 1,9
3.2 1,9 2,9 3,8
3,0 1,5 3,1 4,0
3,5 1,9 2,5 3,2
2.3 1,5 2,8 3,5
2,5 1,7 3,1 3,8
1,5 1,3 2,0 1,5
3,5 1,9 3,5 4,0
1,8 1,1 1,8 1,5
6): Medium G
Bacto-Nutrient Broth, dehydratisiert
Glucose
NaCl
0,8$
1,0$
0,5*
5,0 4,8 5,2
4,5
4,8
3,5 5,0
1,8
PH 7,0
21637S2
Beispiel 12
Xanthomonas oryzae IPO 3998 wurde in dem in Beispiel 8 beschriebenen Medium I1 auf die in Beispiel 8 beschriebene V/eise kultiviert. Die aus 1500 Raumteilen der ICulturbrühe erhaltenen gewaschenen Zellen wurden'in 150 Raumteilen einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung suspendiert, die einen p^-Wert von 6,0 hatte» Die Suspension wurde in 3 Teile geteilt. Jedem Teil wurde 1 Gew.-Teil 6-Aminopenicillansäure, 2 Gew„-Teile D-Phenylglycinmethylestei1 und 20 Raumteile eines der in Tabelle 7 genannten organischen Lösungsmittel zugesetzt. Die Gemische wurden mit der oben genannten Pufferlösung auf ein Endvolumen von 100 Raumteilen aufgefüllt. Die erhaltenen Gemische (als Reaktionssystem 1, 2 bzw«3 bezeichnet) wurden unter Schütteln 30 Minuten bei 280C bebrütet» Die angehäuften Mengen des oc-Aminobenzylpenicillins sind nachstehend in Tabelle 7 genannt.
Tabelle 7
Reaktionssystem Angehäufte Menge
a-Aminobenzylpenicillin, Organisches lösungsmittel mg /nil
1 Methanol 8,5
2 Äthanol 8,8
3 Aceton 7,8
Beispiel 13
Die Kulturbrühen von Pseudomonas'sp. Ii1O 13214, erhalten durch Isolierung vom Boden auf die unter "Versuch 1" beschriebene V/eise, Pseudomonas aeruginosa IFO 3755 und Pseudomonas poly'color TFQ 3918, erhalten durch Züchtung auf einer Schrägkultur für 2 Tage, wurden in 5 Ra umteile des "in Versuch 1" beschriebenen Mediums E geimpft und unter Schütteln 2 Tage bei 280C bebrütet„ Die erhaltenen Kulturbrühen wurden in 300 Raumteile des Mediums E geimpft und unter Schütteln 40 stunden bei 280C bebrütet *
209830/11 S3 BADORiGlNAL
Die Zellen wurden aus den Kulturbrühen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit einer 0,1-molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung gewaschen und dann in 5 Teile geteilt. Jeder Teil der Zellen wurde in 12 Raumteilen der oben genannten Pufferlösung suspendiert, die pro ml 10 mg 6-Aminopenicillansäure und 20 mg D-Phenylglycinmethylester (a), DL-1-Cyclohexenylglycinmethylester (b), DL-Cyclohexylglycinmethylester (c), DL-4-Hydroxyphenylglycinmethylester (d) oder DL-4-Hydroxy-3,5-dichlorphenylglycinmethylestar (e) enthielt.
Die Gemische wurden unter Schütteln 1 Stunde bei 370C bebrütet. Die Mengen der angehäuften Aminopenicilline sind nachstehend in Tabelle 8 genannt.
Tabelle 8
Mikroorganismus sp. Mengen der
penicilline		 8 angehäuften
, mg/ml		 5 2 d1 Ami no-
Pseudomonas
IPO 13214		 aeruginosa a! b 8 C 8 2 >5 e'
Pseudomonas
IPO 3755		 polycölor 0,9 0, 5 o, 5 2 ,8 . 2 ,3
Pseudomonas
IPO 3918		 0,8 0, 0, Amino ,9 3 ,1
af. b!. c'. 0,6 0, 0, t)end 3 ,2
d1 und e' eeben wie fol et die Lei! line
an, die aus 6-Aminopenicillansäure und den jeweiligen α-substituierten oc-Aminosäurederivaten (a), (b), (c), (d) und (e) gebildet wurden:
a1: Gc-Aminobenzylpenicillin
b1: 6-(a-Amino-1'-cyclohexenylacetamido)penicillansäure c1: 6-(a-Amino-cyclohexylacetamido)peniciHan3äure d': 6-/a-Amino-a-(4-hydroxyphenyl)acetamid£7penicillansäure
e': 6-/ä-Amino-a-(3,5-dichlor-4-"hydroxyphenyl)-acetamid£7-penicillansäure
209830/1 16.3

Claims (18)

  1. Pa te ntansprüche
    Verfahren zur Herstellung von Aminopenicillinen der Formel
    I 2 Q ΓΉ"
    rw ^ COHH-T—-/^ X
    ^CH^ (I)
    <y xcooh
    in der R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoffrest ist, der an seinem Ring einfach oder mehrfach substituiert sein kann, dadurch gekennzeichnet, daß man 1) ein α-substituiertes a-Arainosäurederivat der Formel
    NH0-
    R-CH- COA (II)
    in der R die oben genannte Bedeutung hat und A ein Alkoxyrest, Carboxyalkylthiorest, eine Aminogruppe oder Carboxyalkylaminogruppe ist, und 2) 6-Aminopenicillansäure der enzymatischen Einwirkung eines Mikroorganismus unterwirft, der zu der Gattung Micoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Pseudomonas, Aeromonas oder Xanthomonas gehört und ein Aminopenicillin der Formel (I) aus einem a-suhstituierten a-Aminosäurederivat der Formel (II) und 6-Aminopenicillansäure zu "bilden vermag, jedoch im wesentlichen unfähig ist, Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure zu bilden.
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das α-substituierte a-Aminosäurederivat und die 6-Aminopenicillansäure mit einer Kulturbrühe des Mikroorganismus oder ihrem verarbeiteten Material in einem wässrigen Medium zusammengeführt werden.
  3. 3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt bei einer Temperatur von etwa 10 bis 50 und bei einem Pjr-Wert von etwa 4 bis 8 vorgenommen wird«,
    BAD 209830/1163
  4. 4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, , ' daß mit einer Konzentration der 6-Aminopenicillansäure im Bereich von etwa 0,1 bis 5f=> (Gewicht /Volumen) und einer Konzentration des α-substituierten oc-Aminosäurederivats im Bereich von etwa 0,1 bis 10$ (Gewicht/Volumen, jeweils bezogen auf das wässrige Medium, gearbeitet wird.
  5. 5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micoplana dimorpha verwendet wird.
  6. 6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Protaminobaeter alboflavus verwendet wird.
  7. 7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Acetobacter cerinus verwendet wird.
  8. 8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Acetobacter dioxyacetonicus verwendet wird.
  9. 9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4f dadurch gekennzeichnet, W daß als Mikroorganismus Acetobacter pasteurianum verwendet wird.
  10. 10) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus acetobacter turbidans verwendet wird c
  11. 11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Acetobacter xylinum verwendet wird ο
  12. 12) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Xanthomonas citri verwendet wird.
    209830/1163
  13. 13) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Xanthomonas oryzae verwendet wird.
  14. 14) Verfahren nach Anspruch 1 "bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Xanthomonas pruni verwendet wird.
  15. 15) Verfahren nach Anspruch 1 "bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß α-substituierte α-Aminosäurederivate der .Formel
    HH0
    ! 2
    R-CH- COA verwendet werden, in der A ein Alkoxyrest ist.
  16. 16) Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß α-substituierte α-Aminosäurederivate der Formel
    0 t ^
    R - CH - COA
    verwendet werden, in der der Rest R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoff ist, der an seinem Ring einfach oder mehrfach substituiert ist, wobei die Substituenten Hydroxylgruppen und/oder Halogenatome sind.
  17. 17) Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß α-substituierte α-Aminosäurederivate der Formel
    NH0 R-CH- COA
    verwendet werden, in der der Rest R ein 4-Hydroxyphenyl- oder 4-Hydroxy-3,5-dichlorphenylrest ist.
  18. 18) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß α-substituierte α-Aminosäurederivate der Formel
    NH0 R-CH- COA ■ 0RlQWAi. INSPECTED
    209830/1163
    2763792
    verwendet werden, in der der Rest R ein Phenyl-, Cyclohexyl- oder Cyclohexenylrest ist.
    209830/1163
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