DE3039132A1

DE3039132A1 - Verfahren zur herstellung von carbamylderivaten von (alpha)-hydroxysaeuren

Info

Publication number: DE3039132A1
Application number: DE19803039132
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Eletti Bianchi; Eugenio Roma Fascetti; Roberto Mentana Roma Olivieri
Original assignee: Eni SpA
Current assignee: Eni SpA
Priority date: 1979-10-17
Filing date: 1980-10-16
Publication date: 1981-04-30
Also published as: NO155698B; FI71167C; IT7926547A0; ES496505A0; US4332905A; ATA498280A; ES8205017A1; IE801948L; DK394580A; FR2467843B1; NL8005738A; FR2467843A1; IE50297B1; ES508579A0; FI803116A; JPS5685288A; NO803080L; IT1125486B; GB2061269A; DK161718B

Description

E.N.I.

Beschreibung

Verfahren zur Herstellung von Carbamylderivaten von QT-Hydroxysäuren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von O^-Hydroxysäuren durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen Formel (i):

(D 0 = C*L «3 2 C = O

in der R eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder aliphatische Gruppe ist.

Bei dem erfindungs gemäß en Verfahren können die Verbindungen der allgemeinen Formel I d.h. die in 5-Stellung substituierte 2,4-ttcazolidindione eine Hydrolyse-Reaktion eingehen, durch die der Ring entsprechend der folgenden Formel geöffnet wird:

R . R

HC 0 HC- OC— NH₂

I I +H₂O
0 = C_ „ ^C = 0 ^

H
(D (H)

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Die Verbindung der allgemeinen Formel II, die durch Hydrolyse erhalten wird, ist das Carbamylderivat einerof-Hydroxysäure aus dem dieo\-Hydroxysäure erhalten werden kann, indem man die Verbindung II der weiteren Hydrolyse unterwirft, gemäß dem folgenden Schemas

HOOC - CH - OCONH₀ + H₀O ^ R-CH- COOH + C0_o +

2 2 ι 2

OH

(III)

Das Endprodukt(ill)ist die c£ -Hydroxysäure. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur direkten Herstellung von D-Carbamyl-o^-Hydroxysäuren durch stereoselektive enzymatische Hydrolyse von racemischen Gemischen der Verbindungen der allgemeinen Formel I.

In diesem Zusammenhang hat es sich überraschender Weise als möglich erwiesen, in 5-Stellung substituierte DL-2,4- -Oxazolidindiole so enzymatisch zu hydrolisieren, daß man nur die D-Carbamyl-cK-Hydroxysäure erhält, d.h. nur eines der beiden möglichen optischen Isomeren. Die freie d-Hydroxysäure der D-Konfiguration kann aus dem optisch aktiven Carbamyl-Derivat durch einfache Hydrolyse erhalten werden. Verbindungen der allgemeinen Formel CO können leicht aus den entsprechenden Hydroxysäuren durch Umsetzung mit Harnstoff erhalten werden. (Helge Aspelund in Acta Acad. -—. Aboensins Math, and Phys. 22 (7) 12 (1961)).

Die Auftrennung des racemischen Gemisches wird erreicht durch selektive Hydrolyse des Oxazolidin-Ringes- mit Hilfe von Enzymen die leicht zugänglich sind von Kulturen verschiedener Mikroorganismen oder von Extrakten tierischer Organe wie Kälberleber.

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Ein besonders wichtiger Fall_/ auf den die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist ist die Herstellung von D(-Mandelsäure der Formel

die ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von halbsynthetischen Antibiotika ist.

Dieses Zwischenprodukt wird im allgemeinen hergestellt durch Auftrennung des racemischen Gemisches mittels Bildung der diastereo-isomeren Salze mit optisch aktiven natürlichen Basen, wie Brucin. Dieses Verfahren ergibt im günstigsten Falle eine theoretische Ausbeute von 50 %, da das L-Enantiomer racemisiert werden muß, bevor es zurückgeführt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Carbamylderivat von D(-Mandelsäure vorteilhaft hergestellt werden durch stereoselektive enzymatische Hydrolyse des entsprechenden 5-Phenyl-2,4-oxazolidindions. Ein weiterer bedeutender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß das Substrat der enzymatischen Reaktion spontan unter Hydrolysebedingungen racemisiert, so daß am Ende der Reaktion das Carbamat der D-Mandelsäure in stöchiometrischer Menge, bezogen auf das Ausgangssubstraii erhalten wird.

Die Reaktion verläuft nach dem folgenden Schema H

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Die D(-)Mandelsäure wird dann aus dem D-Mandelsäurecarbamat durch Hydrolyse in saurer Umgebung erhalten.

Die Enzymaktivität, die zur Bildung des D(-)Mandelsäurecarbamats erforderlich ist, ist sowohl in homogenisierter Kälberleber als auch in den folgenden Mikroorganismen vorhanden: Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Mirococcus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Cairtfda, Rhodotorula, Pichia und Paecilomyces.

Als besonders günstig haben sich die folgenden Mikroorganismen erwiesen:

Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291 Bacillus Brevis NRRL B 11080
Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079 Pseudomonas sp CBS 145.75
Pseudomonas sp CBS 146.75
Pseudomonas sp ATCC 11299
Pseudomonas desmolytica NCIB8859
Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 und Pseudomonas putida ATCC 12633

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die oben angegebenen Mikroorganismen unter aeroben Bediigingen in Kulturmedien gezüchtet, die Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor und Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 20 und 8(
zwischen 6,0 und 8,0.

tür zwischen 20 und 80°C, 10 bis 72 Stunden bei einem pH-Wert

Glucose, Lactat, Acetat, Maiswasser und Lactose können als Kohlenstoffquellen angewandt werden.

Fleisch-Hydrolysate, . Casein oder Sojabohnen, Ammoniumsalze, Harnstoff, Hydantoin usw. können als Stickstoffquelle angewandt werden.

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/5

-X-

5	g
5	g.
VJl	g
1000	ml
7,0	us 7,2

Ein geeignetes Kulturmedium besitzt z.B. die folgende Zusammensetzung:

Fleischpepton Fleis chextrakt Glucose

destilliertes Wasser

pH-Wert

Das D(-)Carbamat der Mandelsäure kann direkt in den Fermentationsmedien, die das entsprechende DL-2,4-0xazolidindion enthalten, hergestellt werden oder es kann direkt hergestellt werden mit Hilfe einer mikrobiellen Paste in Form von ruhenden Zellen oder unter Verwendung von Extrakten. Die Enzymkomplexe die erfindungsgemäß angewandt werden, werden aus der bakteriellen Paste durch übliche Verfahren, wie sie in der Enzymologie angewandt werden extrahiert.

Zu diesem Zweck werden die Zellen mit Hilfe geeigneter Vorrichtungen wie French Pressure-Cell Press, Manton Gaulin Homogenizer, Rotationsdisintegretoren usw. oder mit Hilfe von Ultraschall aufgebro chen.

Die Hydrolyse des in 5-Stellung substituierten DL-2,4-0xazolidindions kann durchgeführt werden durch Zugabe des Enzyms in einer der folgenden Formen zu dem Reaktionsgemisch: Frische Zellen, lyphilisierte Zellen, mit Toluol behandelte Zellen, acetonhaltiges Pulver oder rohe oder gereinigte Extrakte.

Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden durch !mobilisieren der Enzyme, durch Zusammenbringen mit makromolekularen Verbindungen unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder ionischer Bindungen oder durch physikalische innDbilisierung.

Die Erfindung wird durch die d&lgenden Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1

(j

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Fleischpepton 5 g

Fleischextrakt 3 g

Glucose 5 g

destilliertes

Wasser 1000 ml

Der pH-Wert wurde mit Hilfe von Soda auf 7,2 eingestellt und das Medium in Mengen von jeweils 100 ml in 500-ml-Kolben gegeben. Nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 110⁰C wurden die Kolben mit einer Kultur von Pseudomonas CBS 145.75 von einer Schräge enthaltend das gleiche Medium mit 2 % Agar (DIFCO) beimpft und 24 Stunden bei 30°C unter kreisförmigem Bewegen (220 UpM) inkubiert.

1 ml dieser Vorkultur (optische Dichte bei 550 nm = 0,250· Verdünnung 1:10) wurde jeweils in 5 500-ml-Kolben enthaltend 100 ml des gleichen Mediums_/gegeben und die Kultur wurde unter kreisförmigem Bewegen (220 UpM) 24 Stunden bei 30⁰C inkubiert, (optische Dichte bei 550 nm = 0,450«Verdünnung 1:10).

Die Zellen wurden dann gewonnen,in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und schließlich in 100 ml 0,1 m Pyrophosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,7. enthaltend 2 g DL-5-Phenyl-2,4-oxazolidindion^bei einer Temperatur von 50⁰C suspendiert.

Nach 70 stündiger Inkubation unter diesen Bedingungen war die Hydrolyse zu dem D-Mandelsäurecarbamat vollständig, wie durch polarimetrische Analyse des Reaktionsgemisches nachgewiesen werden konnte.

Das Carbamat wurde nach Entfernung der Zellpaste durch Abzentrifugieren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen, dann abgekühlt und der pH-Wert mit konz. HCl auf 2,5 eingestellt. Der so erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert_f mit kaltem Wasser gewaschen und

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-y-

unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 1,8 g Carbamat, das durch das IR- und NMR-Spektrum sowie die Elementaranalyse identifiziert wurde.

Die spezifische optische Drehung der alkoholischen Lösung des wie oben erhaltenen Carbamate betrug j_ Qt J-ς -141. Der Schmelzpunkt betrug 169⁰C unter Zersetzung.

/Wasser 1,4 g des Carbamats wurden in 100 ml/suspendiert und dann 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde angesäuert und mit Äthyläther extrahiert und die organische Phase unter Vakuum zu Trockne eingedampft. Man erhielt 1,10 g der rohen Mandelsäure /~öf_7p -¹²⁰ (optische Reinheit 76 %).

Nach dem Umkristallisieren aus Wasser zeigte das rohe Produkt die folgenden Werte; Fp 130⁰C und /~0c 7^ -154,5 in Wasser, gegenüber Fp 133 C und 1"θί_7γ{ -158, wie sie in der Literatur für D(-)Mandelsäure angegeben sind.

Beispiel 2

1 g Aceton haltiges Pulver von homogenisierter Kälberleber wurde zu einer Lösung gegeben enthaltend 500 mg Dl-5-Phenyl-2,4-oxazolidindion in 50 ml 0,1 m Pyrphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,5.

Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde 40 Stunden bei 30⁰C inkubiert.Das D-Mandelsäurecarbamat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen.

/spezifischen Man erhielt 380 mg rohes Carbamat mit einer'optischen Drehung

^ -136 in Äthanol.

Dann wurde das rohe Carbamat der sauren Hydrolyse unterwörden und die Mandelsäure wie in Beispiel 1 extrahiert. Man erhielt 300 ng rohe D-Mandelsäure C^aJ^Q~ ¹¹⁶ (optische Reinheit 73,5 %)

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Claims

DR.-ING. FRANZ TUESTHOFF

PATENTANWÄLTE , _Λ

DR. PHIL. FREDA TUESTHOFP (lQ17-10<6)

WUESTHOFF -ν. PECHMANN -BEHRENS -GOETZ _DIfWM._{CHEAni PULS} (,,_f2-_wo

DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS

MANDATAIRES AGREES PRES l'oFFICE EUROPiEN DES BREVETS DIPL.-ING.; DIFL.-TIRTSCH.-ING. RUPERT G0ET2

1A-54 064 3039132 D-8000 MÜNCHEN

SCHWEIGERSTRASSE

telefon: (089)662051 telegramm: protectpatent telex: j 24070

Patentansprüche

J Verfahren zur Herstellung von Carbamylderivaten von OC-Hydroxysäuren, dadurch gekennzeichnet , daß man ein in 5-Stellung substituiertes 2,4-Oxazolidindion der allgemeinen Formel

(D

in der R eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder aliphatische Gruppe bedeutet, hydrolysiert.
2. Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von D-Carbamylderivaten von OC-Hydroxysäuren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das in 5-Stellung substituierte DL-2,4-0xazolidindion der allgemeinen Formel I der enzymatischen Hydrolyse unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als enzymatisch wirksames Präparat ein solches aus homogenisierter Kälberleber verwendet.

/2

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4. Verfahren nach 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als enzymatisches Präparat ein solches verwendet, das erhaltenen worden ist von Mikroorganismen der Gattung: Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsieila, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia oder Paecilomyces.
5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als enzymatisches Präparat ein solches verwendet das erhalten worden ist von einem der folgenden Mikroorganismusstämme: Agrobacterium radiobacter NRRL 11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo thermophilus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 oder Pseudomonas putida ATCC 12633.
6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man die Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 80⁰C züchtet.
7. Verfahren nach 2 bis 6, dadurch gekennzeich net, daß man die Mikroorganismen 10 bis 72 Stunden lang züchtet.
8. Verfahren nach 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert der Mikroorganismuskultur im Bereich von 6 bis 8 arbeitet.
9. Verfahren nach 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von D(-)Mandelsäurecarbamat ausgeht von DL-5-Phenyl-2,4-oxazolidindion.
10. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 8 erhaltenen VerSirensprodukte zur Herstellung der entsprechenden Säuren durch saure Hydrolyse des Carbamats.

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11. Verwendung des nach Anspruch 10 erhaltenen Produktes zur Herstellung von D(-)Mandelsäure durch saure Hydrolyse in wäßriger Umgebung bei einer Temperatur von 40 bis 100⁰C und einem pH-Wert von 1 bis 3,5.

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