DE3036413C2

DE3036413C2 - Aerobes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure

Info

Publication number: DE3036413C2
Application number: DE3036413A
Authority: DE
Inventors: Dennis Michael Gales Ferry Conn. Fenton; Donald Albert Essex Conn. Kita
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1979-09-28
Filing date: 1980-09-26
Publication date: 1982-10-21
Also published as: GB2058775A; ES8106758A1; CH645921A5; AR224028A1; IT1132791B; NO802863L; FR2466505A1; IT8024975A0; US4316960A; GB2058775B; PT71841B; ES495419A0; CA1140878A; MX6164E; NL8004677A; DK149962C; DD153131A5; DE3036413A1; LU82804A1; PT71841A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, die als Zwischenstufe zur Herstellung von Ascorbinsäure dient Eine Lösung von 2,5-Dike togluconsäure kann selektiv zu 2-Ketogulonsäure reduziert werden, die in Ascorbinsäure umgewandelt werden kann. Die Reduktion von 2,5-Diketogluconsäure kann mit einem Alkaliborhydrid erfolgen, wie in der US-PS 4159 990 offenbart oder durch eine fermentative Reduktion, wie z. B. in der US-PS 39 22 194, 39 59 076 und 39 63 574 beschrieben.

2,5-Diketogluconsäure ist auch als Zwischenstufe zur Herstellung von Comensäure (5-Hydroxy-4-pyron-2-carbonsäure) durch Erwärmen in Gegenwart einer Säure, wie in der US-PS 36 54 316 beschrieben, brauchbar.

Bislang ist 2,5-Diketogluconsäure von mehreren verschiedenen Bakterien erzeugt worden, wie von Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens und Pseudomonas sesami.

Die Verwendung dieser Mikroorganismen ist jedoch unter industriellem Gesichtspunkt aufgrund verhältnismäßig niedriger Ausbeuten an 2,5-Diketogluconsäure, relativ langer Fermentationszeiten und wegen der Bildung großer Mengen brauner oder gelbbrauner Pigmente als Nebenprodukte der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure herabgesetzt wird, nicht befriedigend.

Die US-PS 37 90 444 bezieht sich auf die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure ohne begleitendes braunes Pigment durch eine neue Art, die als Acetobacter fragum ATCC Nr. 21 409 bezeichnet wird.

Die US-PS 42 63 402 betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure in guten Ausbeuten ohne die Bildung pigmentierten Materials durch aerobe Vermehrung von Acetobacter cerinus in einem glucosehaltigen Medium. Während Glucose-Gesamtmengen von etwa 2.5 bis etwa 20% (Gewicht/Volumen) verwendet werden können, wurde gefunden, daß Glucose-Anfangskonzentrationen im Medium von mehr als 15% von den Mikroorganismen nicht verarbeitet werden können.

Demnach können Glucose-Gesamtmengen von mehj als eiwa 15% (Gewicht/Volumen) nur eingesetzt werden, indem die Fermentation mit einer Glucose-Anfangskonzentration von etwa 10 bis 15% (Gewicht/Volumen) durchgeführt und danach weitere Glucose-Teil- mengen dem Fermentationsmedium während des Fermentationsverlaufs zugesetzt werden, wobei die Glucose-Konzentration im Medium zu jeder gegebenen Zeit etwa 15% (Gewicht/Volumen) nicht überschreitet ίο Daher waren bislang die Gesamtkonzentrationen oder Produktionskapazitäten an 2,5-Diketogluconsäure durch die verhältnismäßig niedrige Glucose-Anfangskonzentration, die im Fermentationsmedium eingesetzt werden kann, beschränkt Die Produktivität von Verfahren, die andere Mikroorganismen zur Herstellung von 2,5-Diketog!uconsäure einsetzen, wie vorstehend beschrieben, ist auch durch die Notwendigkeit der Verwendung verhältnismäßig niedriger Glucose-Anfangskonzentrationen im Fermentationsmedium beschränkt

So ist leicht erkennbar, daß ein Verfahren, bei dem Glucose-Anfangskomientrationen über etwa 15% (Gewicht/Volumen), insbesondere Werte über 20% toleriert werden können und von den Mikroorganismen zur Herstellung von 2^-Diketogluconsäure verwertet werden, eine erhebliche Steigerung der Produktionskapazität ermöglicht und das Arbeiten sehr wirtschaftlich macht Ein solches Verfahren vermeidet auch die Möglichkeit einer Verunreinigung des Fermentationsmediums, die eintreten kann, wenn die Produktionska pazitäten durch Zusatz weiterer Glucosemengen während des Fermentationsverlaufs gesteigert werden. Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Glucose-Anfangskonzentratiorien über 20% und bis zu etwa 30% (Gewicht/Volumen) in einem Fermentationsmedium von dem Mikroorganismus Acetobacter cerinus zur Erzeugung von 2,5-Diketogluconsäure verwertet werden können, wenn wenigstens etwa 0,04 Gew.-% Cholin, bezogen auf die Menge an D-Glucose im Medium, dem Fermentationsmediumi zugesetzt werden. Somit betrifft die Erfindung ein aerobes, mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure aus Glucose unter Verwendung von Acetobacter cerinus, wobei man die Umsetzung in einem Fermentationsmedium durchführt, das D-Glucose in einer Anfangskonzentration von über etwa 20 bis zu etwa 30% (Gewicht/Volumen) sowie Cholin in einer Menge von wenigstens etwa 0,04 Gew.-%, bezogen auf die Anfangsmenge an D-Glucose im Medium, enthält Die Glucose-Anfangskonzentration im Fermentationsmedium ist vorzugsweise etwa 25 bis 30% (Gewicht/Volumen). Die Vermehrung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 25 bis 30° C, bevorzugt bei einem pH von etwa 5 bis 6. Bevorzugte Stämme sind Acetobacter cerinus oder Acetobacter cerinus IFO 3263 und IFO 3266.

2,5-Diketogluconsäure wird im erfindungsgemäßen Verfahren in guten Ausbeuten ohne Bitdung wesentlicher Mengen pigmentierter Materialien in verhältnismäßig kurzen Fermentationszeiten hergestellt. Eine Reihe von Stämmen von Acetobacter cerinus, einschließlich IFO 3262 (ATCC 12 303), IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265, IFO 3266, IFO 3267, IFO 3268 und IFO 3269 sind der Öffentlichkeit zugänglich und können beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Stämme sind IFO 3263 und IFO 3266. Natürlich sind auch Mutanten dieser Mikroorganismen, hergestellt nach herkömmlichen Methoden, z. B. durch

Bestrahlen mit Röntgenstrahlen oder UV-Licht, Behandeln mit Stickstofflosten, beim erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar und von der Erfindung umfaßt

Acetobacter cerinus wird in einem Medium kultiviert, dessen Haugtkohlenstoffquelle D-Glucose ist. Natürlich enthält in Übereinstimmung mit herkömmlicher Fermentationspraxis das Fermentationsmedium auch Stickstoff-. Kalium-, Phosphor- und Magnesiumquellen. Der Begriff »Fermenfationsmedium«, wie er hier verwendet wird, soll ein solche Verbindungen enthaltendes Medium definieren. Wird Acetobacter cerinus als Mikroorganismus beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, ist es nicht notwendig, kostspielige organische Stickstoffquellen, wie Pepton oder Fleischextrakt, zu verwenden. Der Stickstoff kann in wirtschaftlicher Weise durch die Verwendung von Harnstoff oder anorganischen Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat oder ähnlichen Salzen, im allgemeinen in Mengen zwischen etwa 0,1 und 2 g/I Fermentationsmedium, zur Verfügung gestellt werden, wenn auch Nicotinsäure als Wachstumsfaktor zugesetzt wird, im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,2 bis 10 mg/1 Fermentationsmedium. Kalium, Magnesium und Phosphor werden leicht durch Zusatz von Salzen, wie Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat, Magnesiumsulfat oder ähnlichen Salzen, im allgemeinen in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 1 j/l Fermentationsmedium, zur Verfügung gestellt Bei der Zusammenstellung des Fermentationsmediums ist jedoch erhebliche Variation möglich.

Andere geeignete Medien liegen für den Fachmann auf der Hand, und das erfindungsgemäße Verfahren soll nicht auf die Verwendung der vorstehend und in den Beispielen beschriebenen besonderen Medien beschränkt sein. Beim erfindungsge.näßen Verfahren enthält das Fermentationsmedium D-Glucose in Anfangskonzentrationen über den bisher möglichen ohne schädlichen Einfluß auf die bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen. Speziell liegt die D-Glucose-Anfangskonzentration in dem beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Fermentationsmedium im Bereich über etwa 20 und bis zu etwa 30% (Gewicht/Volumen), insbesondere zwischen etwa 25 und 30% (Gewicht/Volumen). Wenn gewünscht, kann D-Glucose als Cerelose (D-Glucose-Monohydrat) zügesetzt werden.

Damit die Acetobacter cerinus-Mikroorganismen so hohe Glucosekonzentrationen im Fermentationsmedium zu ertragen und zu verwerten vermögen, muß dem Fermentationsmedium Cholin in einer Menge von wenigstens 0,04 Gew.-%, bezogen auf die Anfangsmenge an D-Glucose in dem Fermentationsmedium, zugesetzt werden. Wenn gewünscht, können verhältnismäßig hohe Cholinmengen, z.B. etwa 0,5 Gew.-%, bezogen auf die D-Glucose-Anfangskonzentration im Fermentationsmedium, verwendet werden, wenngleich sich wenig Vorteil bei der Verwendung von mehr als etwa 0,1 Gew.-% Cholin ergibt und etwa 0,04 bis 0,06 Gew.-% Cholin sind im allgemeinen bevorzugt. Cholin kann entweder als freie Base oder als Salz, z. B. als Cholinchlorid, Cholinbicarbonat, Cholincitrat, Cholinglukonat oder ähnliche Salze, zugesetzt werden. Cholinchlorid ist ein bevorzugtes Salz. Die Konzentration an Cholin, wie hier definiert, ist als Cholin-Base berechnet. Ein kleiner Teil des nötigen Cholins kann, wenn gewünscht, durch Zugabe von Maisquellflüssigkeit zum Fermentationsmedium beigesteuert als Quelle für Vitamine und Mineralstoffe beigesteuert werden.

Maisquellflüssigkeit, die in Fermentationsmedien als Quelle für Vitamine und Mineralstoffe verwendet wird, enthält im allgemeinen nur etwa 0,5 bis 3 mg Cholin/g Maisquellflüssigkeit Doch werden gewöhnlich nicht mehr als etwa 5 g Maisquellflüssigkeit pro 1 Fermentationsmedium eingesetzt da Maisquellflüssigkeit Farbkörper enthält und die Zugabe von mehr als etwa 5 g Maisquellflüssigkeit pro 1 Fermentationsmedium die Gewinnung und Reinigung der 2^-Diketogluconsäure schwieriger mächt Daher kann Maisquellflüssigkeit, wenn gewünscht, nur als Quelle für einen kleinen Teil des für die Fermentation nötigen Cholins verwendet werden, und der Rest der erforderlichen Cholinmenge wird dem Fermentationsmedium als Cholinbase oder als Salz, wie vorstehend beschrieben, zugesetzt

Die Fermentation erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 35⁰C, vorzugsweise zwischen 25 und 30⁰C₁ insbesondere bevorzugt um 28°G Der Anfangs-pH eines Kulturmediums liegt im Bereich von etwa 3,5 bis 7,5, bevorzugt zwischen etwa 5 und 6. Im Verlauf der Fermentation wird der pH wunschgemäß in diesem Bereich, vorzugsweise bei etwa 5,5, z. B. durch Zugabe eines Alkalihydroxids, vorzugsweise Natronlauge, gehalten. Alternativ kann ein Alkalioder Erdalkalicarbonat vorzugsweise Calciumcarbonat, zur pH-Steuerung verwendet werden und wird für diesen Zweck in ergänzendem Medium nach der Autoklavenstufe in ausreichender Menge zugegeben, um zum gewünschten pH zu führen, im allgemeinen zwischen 20 und 30 g/100 g Glucose. Es versteht sich, daß die 2,5-Diketogluconsäure in solchen Fermentationsmedien in Form der entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze, wie der Natrium- oder Calciumsalze, anfällt und daß solche Salze von dem Begriff »2,5-Diketogluconsäure« im vorliegenden Zusammenhang umfaßt sind.

Nach dem Beimpfen wird das Fermentationsmedium gerührt z. B. mit einem mechanischen Rührer, und belüftet bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Fermentationsbrühe pro min. Wenn gewünscht, kann weitere Glucose während der Fermentation zugesetzt werden, um einen Teil der bei der Fermentation verbrauchten Glucose zu ersetzen, wodurch die Gesamtkonzentration an in der Fermentationsbrühe erhaltener 2,5-Diketogluconsäure gesteigert wird.

Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die gewünschte Ausbeute erreicht ist Beispielsweise bringt unter Verwendung von Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 eine Fermentationszeit von etwa 40 bis 50 h eine Ausbeute von etwa 90 bis 95% 2,5-Diketogluconsäure, bezogen auf D-Glucose. Eine gewisse Variation der Reaktionszeiten und Ausbeuten ist jedoch in Abhängigkeit vom besonderen Mikroorganismen-Stamm, der Glucosekonzentration im Fermentationsmedium und der Kultivierungstemperatur zu erwarten.

Ohne an den folgenden Mechanismus gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die Umwandlung von Glucose in 2,5-Diketogluconsäure auf folgendem Wege abläuft:

Glucose -♦ 2-Ketogluconsäure

-► 2,5-Diketogluconsäure Glucose -* 5-Ketogluconsäure

-► 2,5-Diketogluconsäure

. Die Zwischenstufen der 2-Ketogluconsäure und 5-Ketogluconsäure und die 2,5-Diketogluconsäure können papierchromatographisch mit einem Whatman

Bestandteil

Glucose-Monohydrat 225 g/l

Maisquellflüssigkeit 0,5 g/l

(NH₄J₂HPO₄ 0,5 g/l

KH₂PO₄ 1,5 g/l

MgSO₄ · 7 H₂O O^ g/l

Harnstoff 1,0 g/l

Cholinchlorid 100 mg/1

Nicotinsäure 10 mg/1

CuSO₄ · 5 H₂O 2,0 mg/1

Antischaummittel (P-2000) 1,0 mg/1

pH 6,0

Die Fermentation erfolgte bei 28° C unter Rühren bei 15 1700 U/min und Belüften mit einer Geschwindigkeit von 1,0 Volumen pro Volumen Brühe pro min. Durch Zusatz einer 20%igen Natronlauge nach Bedarf wurde der pH bei 5,5 gehalten. 2,5-Diketogluconsäure als Natriumsalz wurde in einer Ausbeute von S'5% nach einer

Nr. 1 und Nr. 4-Papier und einem Lösungsmittelsystem aus Methylethylketon/ Aceton/ Ameisensäure/Wasser (80 :6 :2 :12) getrennt werden. Die Säureflecke werden durch Sprühen einer 0,2%igen äthanolischen o-Phenylendiamin-Lösung mit 1% Salpetersäure und Erwärmen auf etwa 70⁰C (5-Ketogluconsäure: blau; 2-KetogIuconsäure: gelb; 23-Diketogluconsäiu-e: grün) lokalisiert Auch Hochdruckflüssigkeitschromatographie kann angewandt werden. Mit den vorstehenden Methoden kann das Fortschreiten der Fermentation verfolgt weitlea

2,5-Diketogluconsäure kann von der fertigen Fermentationsbrühe nach irgendeiner der dem Fachmann bekannten herkömmlichen Arbeitsweisen abgetrennt und gewonnen werdea Beispielsweise kann die Fermentationsbrühe filtriert, der pH des wäßrigen Filtrats durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Salzsäure, auf 2 bis 23 eingestellt, dann die Lösung eingeengt und ein niederer Alkylalkohol, vorzugsweise Äthanol oder Methanol, zugesetzt werden. Beim Stehen scheidet sich die 23-Diketogluconsäure in Form ihres Calcium- oder 20 Fermentationszeit von 48 h erhalten. Natriumsalzes als Feststoff aus der Lösung ab. Die 2,5-Diketogluconsäure kann aus dem Salz durch Behandeln mit einer verdünnten Mineralsäure und anschließend beispielsweise durch Behandeln mit einem Kationenaustauscherharz, wie einem Sulfonsäureharz, 25 z. B. Dowex 50, erhalten werden.

Wenn gewünscht, kann die Fermentationsbrühe weiter bearbeitet werden, um die gebildete 2,5-Diketogluconsäure in andere gewünschte Produkte umzuwandeln, z. B. durch fermentative Reduktion zu 2-Ketogulonsäure, wie in den US-PS 39 22 194, 39 59 076 oder 39 63 574 beschrieben. Alternativ kann die filtrierte Fermentationsbrühe als geeignete Reaktionslösung für die Reduktion von 2,5-Diketogluconsäure zu einer 2-Ketogulonsäure enthaltenden Lösung durch Umsetzen mit einem Alkaliborhydrid verwendet werden, wie in der US-PS 4159 990 beschrieben. Die bei diesen Umsetzungen erzeugte 2-Ketogulonsäure wird nach auf dem Fachgebiet bekannten Maßnahmen leicht in

Beispiel 2

Das folgende wäßrige Impfmedium	wurde I
stellt:
Bestandteil
Glucose-Monohydrat	25 g/l
Maisquellflüssigkeit	5 g/l
KH₂PO₄	0,5 g/I
K₂HPO₄	0.5 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,2 g/l
CaCO₃	7,0 g/l

herge-

Ein Schüttelkolben mit 1 1 Medium wurde 30 min bei 121°C autoklavenbehandelt Zellen von Acetobacter cerinus IFO 3263 aus einer Nähragar-Schrägkultur (5 ml einer sterilen, wäßrigen 20-ml-Suspension) wurden in

Ascorbinsäure umgewandelt, z. B. durch Erwärmen des 40 den Kolben gegeben, der dann auf einem Rotations-Methylesters in Gegenwart einer Base. schüttler bei etwa 28° C etwa 24 h geschüttelt wurde.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele Der pH des gekühlten Mediums war 5,0.

Eine Teilmenge der gewachsenen Kultur, ausreichend für ein 10 vol.-/vol.-%iges Inokulum wurde in einen gerührten 4-1-Fermentator gegeben, der 21 des folgenden Mediums enthielt:

Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel
Das folgende wäßrige Impfmedium wurde hergestellt:

Bestandteil	25 g/l
Glucose-Monohydrat	5 g/l
Maisquellflüssigkeit	0,5 g/l
KH₂PO₄	0,5 g/l
K₂HPO₄	0,2 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	7.0 g/l
CaCO₃	6,2
pH

50

55

Ein Schüttelkolben mit 1 1 Medium wurde 30 min bei 121°C im Autoklav behandelt. Zellen von Acetobacter cerinus IFO 3263 aus einer Nähragar-Schrägkultur (5 ml einer sterilen, wäßrigen 20-ml-Suspension) wurden in den Kolben gegeben, der dann auf einem Rotationsschüttler bei etwa 28° C 24 h geschüttelt wurde. Der pH des gekühlten Mediums war 5,0.

Eine Teilmenge der gewachsenen Kultur, ausreichend für ein 10 vol.-/vol.-°/oiges Inokulum, wurde in einen gerührten 4-1-Fermentator gegeben, der 2 1 des folgenden Produktionsmedium.« enthielt:

Inokulum zweiter Stufe	100 g/l
Glucose-Monohydrat	0,5 g/l
Maisquellflüssigkeit	0,5 g/l
(NH₄)₂HPO₄	1,5 g/l
KH₂PO₄	0,5 g/I
MgSO₄ · 7 H₂O	1,0 g/l
Harnstoff	10 mg
Nicotinsäure	2,0 mg
CuSO₄ ■ 5 H₂O	500 mg
Cholinchlorid	0,5 ml
Antischaummittel (P 2000)

Die zweite Stufe wurde unter Rühren bei 1700 U/min und 28°C sowie unter Belüften mit einer Geschwindigkeit von 1,0 Volumen pro Volumen pro min durchgeführt. Der pH wurde durch Zugabe einer 20%igen Natronlauge nach Bedarf bei 5,5 gehalten.

Nach 20 h wurde eine Teilmenge der gewachsenen Kultur, ausreichend für ein 10 vol.-/vol.-°/oiges Inokulum, in einen gerührten 14-1-Fermentator gebracht, der 6 1 des folgenden Produktionsmediums enthielt:

Bestandteil

Glucose-Monohydrat

Maisquellflüssigkeit

(N Ht)₂H PO«

KH₂PO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

Harnstoff

Nicotinsäure

CuSO₄ · 5 H₂O

Cholinchlorid

Antischaummittel (P 2000)

334 g/l 0,5 g/l 0,58 g/l 1,5 g/l 0,5 g/l 1.0 g/l 10,0 mg 2,0 mg

150 mg 0,5 ml

Die Fermentation wurde unter Rühren bei 750 U/min, 28⁰C und Belüften mit einer Geschwindigkeit von 1,0 Volumen pro Volumen pro min durchgeführt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe einer 20%igen Natron-

lauge nach Bedarf bei 5,5 gehalten. 2,5-Diketogluconsäure wurde als Natriumsalz in einer Ausbeute von 95% nach einer Fermentationszeit von 6570 h erhalten.

Beispiel 3

Nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 wurden jeweils Acetobacter cerinus-Stämme IFO 3262, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268 und 3269 getestet. In jedem Falle enthielt das Fermentationsprodukt 2,5-Diketogluconsäure in mehr als 50% Ausbeute, zusammen mit etwas nicht umgewandelter 2-Ketogluconsäure und 5-K.etogluconsäure als Zwischenstufen. Höhere Ausbeuten der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure können unter Anwendung längerer Fermentationszeiten erhalten werden, wenn diese Stämme von Acetobacter cerinus eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Aerobes mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 24-Oiketogluconsäure aus Glucose unter Verwendung von Acetobacter cerinus, dadurch gekennzeichnet,daß man die Umsetzung in einem Fermeiitationsmedium durchführt, das D-Glucose in einer Anfangskonzentration von über etwa 20% und bis zu etwa 30% (Gewicht/Volumen) sowie Cholin in einer Menge von wenigstens etwa 0,04 Gew.-%, bezogen auf die Anfangsmenge an D-Glucose in dem Medium, enthält

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Anfangskonzentration an D-Glucose von etwa 25 bis 30% (Gewicht/Volumen) durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man die Umsetzung in einem Medium durchführt das Cholin in einer Menge zwischen etwa 0,04 und 0,1 Gew.-% enthält