DE2600589A1 - Verfahren zur herstellung von weinsaeure - Google Patents
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- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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- C07F3/003—Compounds containing elements of Groups 2 or 12 of the Periodic Table without C-Metal linkages
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler f 1973
D.-.-lng. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln
AvK/Ax 5 KÖLN 1
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure durch Hydrolyse von Epoxybernsteinsäure
mit Hilfe von Mikroorganismen, wobei man Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial dem Kulturmedium
zusetzt, den Mikroorganismus bebrütet und hierdurch Calcium-L(+)-tartrat bildet.
Bekannt ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von meso-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von trans-Epoxybernsteinsäure
(Journal of Bacteriology jO (1955) 405). Von der Anmelderin wurde ferner ein Verfahren zur
Herstellung von L(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von cis-Epoxybernsteinsäure entwickelt (Patentanmeldung
entsprechend der japanischen Patentanmeldung 8149/1975 vom 17.1.1975).
Bei eingehenden Untersuchungen mit dem Ziel, das vorstehend genannte Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung
von L(+)-Weinsäure aus cis-Epoxybernsteinsäure zu verbessern, wurde gefunden, daß eine als Ausgangsmaterial verwendete
Lösung von cis-Epoxysuccinat das Wachstum von
609832/0931
Telefon: (0221) 234541-4 · Telex: 6L32307 dopa d · Telegramm: Dompatent Köln
Mikroorganismen hemmt i-nd, wenn ihre Konzentration höher
ist als 3 bis 5%, das Wachstum beachtlich verzögert oder gelegentlich vollständig zum Stillstand bringt. Es ist |
daher schwierig, dem Kulturmedium eine große Menge der leicht wasserlöslichen Salze, z.B. der Natrium-, Kalium- !
oder Ammoniumsalze oder ähnlicher Salze, auf einmal ι zuzusetzen.
Im Gegensatz hierzu hat Calcium-cis-epoxysuccinat eine .
sehr geringe Wasserlöslichkeit von nur etwa 1% bei Raum- i temperatur, so daß auch dann, wenn eine große Menge
Calcium-cis-epoxysuccinat auf einmal zugesetzt wird, keine Verzögerung oder Hemmung im Wachstum der Mikrobien in der
Kultur noch eine Verzögerung oder Hemmung der Hydrolyse S festzustellen ist.
Wenn ferner Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial zur Herstellung von L(+)-Tartrat verwendet wird, ist die
Löslichkeit von Calcium-L(+)-tartrat in Wasser so gering, daß das Reaktionsprodukt leicht ausgefällt wird und sehr
leicht aus dem Reaktionssystem entfernt werden kann. Eine Hemmung der Hydrolyse durch das Reaktionsprodukt findet
nicht mehr statt, noch wird die L(+)-Weinsäure durch den | Mikroorganismus weiter abgebaut, so daß die Hydrolysen- '
reaktion in kürzerer Zeit abläuft und daher bessere Aus- ' beuten erzielt werden. ;
VJas andererseits das Materialproblem anbelangt, so ist
festzustellen, daß cis-Epoxybernsteinsäure, das Ausgangsmaterial,
im allgemeinen nach einem üblichen Verfahren j hergestellt wird, bei dem Maleinsäure in wäßriger Lösung .
mit Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Katalysatoren wie
i Wolframsäure, Molybdänsäure,Molybdän- oder Wolfram-hetero-
polysäure oder Salzen dieser Säuren oxydiert wird. Bei >
einem anderen möglichen Verfahren wird Maleinsäure der
Epoxydation in Form von Natrium-, Kalium- oder Calcium- ;.
salzen oder ähnlichen Salzen mit anschließendem Ionen- |
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austausch oder Zusatz anderer Metallsalze unterworfen, ■ wodurch die Maleinsäure wirksam in die gewünschte eis- !
Epoxybernsteinsäure oder das cis-Epoxysuccinat umgewan- ; delt wird. Wie bereits erwähnt, sind verschiedene Verfah-;
ren zur Herstellung von cis-Epoxybernsteinsäure verfügbar. Für das Verfahren zur Umwandlung von cis-Epoxybernstein- .
säure in L(+)-Weinsäure unter Verwendung von Mikroorganismen ist es jedoch zweckmäßig, daß das Ausgangsmaterial |
keine aus der Epoxydation stammenden Verunreinigungen, ;
i z.B. Maleinsäure, DL-Weinsäure, Epoxydationskatalysator
u.dgl., enthält, weil die Anwesenheit dieser Verunreini- i gungen das Wachstum von Mikroorganismen oder die Enzymaktivität
hemmt. Schließlich wird hierdurch die Reinigung· der erhaltenen L(+)-Weinsäure übermäßig kompliziert. ·
cis-Epoxybernsteinsäure und ihre Natrium- und Kaliumsalze und ähnlichen Salze haben eine so hohe Wasserlöslichkeit,
daß die Isolierung dieser Verbindungen aus wäßriger Lösung schwierig wird, während Calcium-cis-epoxysuccinat sowohl
als normales Salz als auch als saures Salz eine genügend geringe Löslichkeit hat, um leicht von der wäßrigen Lösung
isoliert werden zu können. Das nach diesem Verfahren her-; gestellte Calcium-cis-epoxysuccinat hat daher den Vorteil j
daß es in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten wird j und demzufolge keine Verunreinigungen, die das Wachstum
des Mikroorganismus oder die Enzymaktivität hemmen würden, und keine Verunreinigungen enthält, die die Reinigung '
komplizieren.
Dieses Calcium-cis-epoxysuccinat kann nach einem der beiden folgenden Verfahren hergestellt werden: Bei einem
dieser Verfahren kann Calciummaleat als Ausgangsmaterial '■. verwendet werden, wie oben beschrieben, und beim zweiten .
Verfahren werden Maleinsäure oder ihre Natrium- oder Kaliumsalze oder ähnlichen Salze der Epoxydationsreaktion ;
unterworfen, worauf das gebildete Produkt isoliert oder ohne Isolierung durch Zusatz von Calciumsalz, Calciumhydroxyd,
Calciumoxyd o.dgl. in Calcium-cis-epoxysuccinat
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umgewandelt wird. Bei Verwendung von Calciummaleat als
Ausgangsmaterial ist es zweckmäßig, zuerst die Epoxydationsreaktion unter Verwendung einer wäßrigen Lösung oder Aufschlämmung, die 0,2 bis 1 g-Atom Calcium pro Mol Malein säure enthält, durchzuführen und nach der Reaktion die
Calciumverbindung zuzusetzen. Anstatt die Calciumverbin- ' dung zuzusetzen, ist es auch möglich, das gebildete Produkt in Form von Verbindungen wie Calciumhydrogen-cisepoxysuccinat oder Calcium-cis-epoxysuccinat oder auch j als Gemisch dieser Verbindungen zu isolieren. Insbesonde-i
Ausgangsmaterial ist es zweckmäßig, zuerst die Epoxydationsreaktion unter Verwendung einer wäßrigen Lösung oder Aufschlämmung, die 0,2 bis 1 g-Atom Calcium pro Mol Malein säure enthält, durchzuführen und nach der Reaktion die
Calciumverbindung zuzusetzen. Anstatt die Calciumverbin- ' dung zuzusetzen, ist es auch möglich, das gebildete Produkt in Form von Verbindungen wie Calciumhydrogen-cisepoxysuccinat oder Calcium-cis-epoxysuccinat oder auch j als Gemisch dieser Verbindungen zu isolieren. Insbesonde-i
re bei Durchführung der Epoxydationsreaktion unter Verwendung
einer wäßrigen Lösung oder Suspension, die 0,4 bis !
— - Calcium
0,8 g-Atom/pro Mol Maleinsäure enthält, kann Calcium-cisepoxysuccinat
von hoher Reinheit in guter Ausbeute erhalten werden, ohne daß eine besondere Reinigung erforderlich
ist. Wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, ermöglicht j das unter Verwendung von Calcium-cis-epoxysuccinat als ;
Ausgangsmaterial durchgeführte Verfahren die Umwandlung
des kristallinen Rohmaterials in kristallines Calcium- :
L(+)-tartrat, das gewünschte Produkt, in hoher Konzentra-j
tion und mit verbesserter Ausbeute sowie bei schnellem :
Verfahrensablauf. Ferner läßt sich das gebildete Produkt |
leicht isolieren. Alle diese Vorteile lassen erkennen, |
daß das Verfahren sich zur Großherstellung von ·
L(+)-Weinsäure eignet. ■
ι Als zweite Verbesserung des Verfahrens zur Herstellung von
L( + )-Weinsäure wurde gefunden, daß bei. Verwendung von
Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial durch
Im Kulturmedium
Anwesenheit eines nichtionogenen Tensids/die Fermentationsdauer
erheblich verkürzt und Calcium-cis-epoxysuccinat von hoher Konzentration in Calcium-L(+)-tartrat mit
hohem Wirkungsgrad umgewandelt werden kann.
hohem Wirkungsgrad umgewandelt werden kann.
Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zugrunde.
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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von
L(+)-Weinsäure nach einem verbesserten Verfahren, bei dem1
die Kultivierung der Mikroorganismen und die Hydrolyse ! von Calcium-cis-epoxysuccinat zu Calcium-L(+)-weinsäure ί
gleichzeitig vonstatten gehen, wobei die Hydrolyse des
Calcium-cis-epoxysuccinats zu Calcium-L(+)-tartrat bei ; hoher Konzentration des Materials, mit besserer Ausbeute
und in kürzerer Zeit durchgeführt werden kann. ,
Calcium-cis-epoxysuccinats zu Calcium-L(+)-tartrat bei ; hoher Konzentration des Materials, mit besserer Ausbeute
und in kürzerer Zeit durchgeführt werden kann. ,
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von j
L(+)-Weinsäure ist dadurch gekennzeichnet, daß man
Calcium-cis-epoxysuccinat als Ausgangsmaterial dem Nähr- i
medium zusetzt und einen Mikroorganismus, der cis-Epoxy- j succinat zu L(+)-Weinsäure zu hydrolysieren vermag,
bebrütet und hierdurch das Calcium-cis-epoxysuccinat in !
Calcium-L(+)-tartrat umwandelt. I
Gemäß einer verbesserten Ausführungsform des Verfahrens
gibt man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung
in Kombination mit Calcium-cis-epoxysuccinat zum Nährmedium, bebrütet den Mikroorganismus und wandelt hierdurch das Calcium-cis-epoxysuccinat in Calcium-L(+)-tartrat um.
gibt man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung
in Kombination mit Calcium-cis-epoxysuccinat zum Nährmedium, bebrütet den Mikroorganismus und wandelt hierdurch das Calcium-cis-epoxysuccinat in Calcium-L(+)-tartrat um.
Für die Zwecke der Erfindung können alle Arten von Mikroorganismen
verwendet werden, die cis-Epoxybernsteinsäure
zu hydrolysieren und L(+)-Weinsäure zu bilden vermögen.
Geeignet sind beispielsweise Acinetobacter tartarogenes
KB-82 (IFO 13644; FERM 2854; ATCC 31105); die gleiche
Spezies KB-99 (IFO 13650; FERM 2860; ATCC 31111); die
gleiche Spezies KB-111 (IFO 13656; PERM 2866; ATCC 31117); die gleiche Spezies KB-112 (IFO 13657; FERM 2867;
zu hydrolysieren und L(+)-Weinsäure zu bilden vermögen.
Geeignet sind beispielsweise Acinetobacter tartarogenes
KB-82 (IFO 13644; FERM 2854; ATCC 31105); die gleiche
Spezies KB-99 (IFO 13650; FERM 2860; ATCC 31111); die
gleiche Spezies KB-111 (IFO 13656; PERM 2866; ATCC 31117); die gleiche Spezies KB-112 (IFO 13657; FERM 2867;
aureum
ATCC 31118); Agrobacterium/KB-91 (IFO 13647; FERM 2857; \ ATCC 31108); Agrobacterium viscosum KB-105 (IFO 13652;
FERM 2862; ATCC 31113); Rhizobium validum KB-97 (IFO
13648; FERM 2858; ATCC 31109); die gleiche Spezies KB-106. (IFO 13653; FERM 2863; ATCC 31114); und Pseudomonas
species KB-86 (IFO 13645; FERM 2855; ATCC 31106).
ATCC 31118); Agrobacterium/KB-91 (IFO 13647; FERM 2857; \ ATCC 31108); Agrobacterium viscosum KB-105 (IFO 13652;
FERM 2862; ATCC 31113); Rhizobium validum KB-97 (IFO
13648; FERM 2858; ATCC 31109); die gleiche Spezies KB-106. (IFO 13653; FERM 2863; ATCC 31114); und Pseudomonas
species KB-86 (IFO 13645; FERM 2855; ATCC 31106).
Nachstehend werden die einzelnen bakteriologischen ! Charakteristiken dieser Mikroorganismen genannt.
i 1. Taxonomische Eigenschaften der Stämme KB-82, KB-99, :
KB-111 und KB-112.
!
a) Zellmorpholoqie ·
1) Kugelförmig bis stäbchenförmig, 0,8-1,0 χ 1,0-1,3 um
2) In jungen Kulturen sind kurze stäbchenförmige Zellen und große unregelmäßige Zellen zu finden. In älteren
Kulturen sind die Zellen nahezu kugelförmig.
3) Unbeweglich
4) Keine Sporenbildung
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest
b) Kulturmerkmale
1) Nähragarplatte: kreisrund, ausgefüllt (entire),
konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig,
glänzend.
konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig,
glänzend.
2) Schrägagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, glatt,
gräulich weiß, glänzend.
gräulich weiß, glänzend.
3) Brühe: leicht trübe; kein Oberflächenwachstum;
Sediment.
Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: alkalisch; keine Peptonisierung.
c) Physiologische Eigenschaften
1) Nitratreduktion: Im Nitratmedium sind KB-111 und
KB-112 positiv, jedoch KB-82 und KB-99 negativ.
KB-112 positiv, jedoch KB-82 und KB-99 negativ.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrottest: negativ.
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
8) Citrat wird verwertet. '
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoff- ι quellen verwertet. j
10) Keine Farbstoffbildung.
11) Urease wird gebildet. . '
12) Oxidase: positiv.
13) Katalase: positiv
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 8,6. Optimaler pH-Wert j etwa 7. Kein Wachstum bei 8°C und 4O°C. Optimale ,
Temperatur etwa 3O°C.
15) Aerob.
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ. !
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose und i
D-Fructose. Geringe Säurebildung, aber kein Gas aus
D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Glycerin.
Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Lactose,
Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Stärke.
D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Glycerin.
Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Lactose,
Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
1) Resistent gegen 5 Penicillineinheiten.
2) Vom Boden isoliert. j
2. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-86 !
a) ZeIlmorphologie '■■
1) Stäbchen 0,6-0,8 χ 1,5 χ 3,0 .um ,
2) Nicht pleomorph
3) Beweglich mit polarer monotricher Geißel i
4) Keine Sporenbildung
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest i
b) Kulturmerkmale '
1) Nähragarplatte: kreisrund, ausgefüllt (entire), konvex, glatt, durchscheinend, cremeweiß, glänzend. ]
2) Schrägagar: Mäßiges Wachstum, fadenförmig, glatt,
cremeweiß, glänzend. [
cremeweiß, glänzend. [
©!03 % 3 2.Il %% 311
3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum; Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: unverändert.
c) Physiologische Eigenschaften
1) Nitrate werden in Nitratmedium nicht reduziert.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrot-Test ist negativ.
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
8) Citrat wird verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoff- I quellen verwertet. '
10) Wasserlösliche Pigmente werden nicht gebildet. :
11) Urease wird gebildet. ,
12) Oxidase: positiv
'13) Katalase: positiv
14) Bei pH 6,0 und 10,5 kein Wachstum. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum
bei 100C. Optimale Temperatur zwischen 25 und 300C.
15) Aerob
16) Hugh-und-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose,
D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit
und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Lactose, Inosit und Stärke. i
d) Andere taxonomische Eigenschaften
1) Stickstoffbindung findet nicht statt.
2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht benötigt.
3} Vom Boden isoliert.
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3. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-91
a) Zellmorphologie
1) Stäbchen 0,5-0,7 χ 1,0-3,0 um
2) nicht pleomorph '
3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln
4) keine Sporenbildung
5) gramnegativ -^.
6) nicht säurefest i
b) Kulturmerkmale i
1) Nähragarplatte: kreisrund, sich ausbreitend, konvexj, transparent, gelb, glänzend.
2) Schrägagar: Wachstum mäßi,g, sich ausbreitend !
(spreading), glatt, gelb, glänzend. j
3) Brühe: trübe, kein Oberflächenwachstum, Sediment.
4) Gelatine-Stichkultur: schichtweise Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: neutral bis leicht alkalisch ohne
Serumzone. Keine Peptonisierung. Gräulichbraune
Serumzone. Keine Peptonisierung. Gräulichbraune
Farbe nach 2 Wochen.
c) Physiologische Eigenschaften
1) Nitrate werden in Nitratmedium nicht reduziert.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrot-Test negativ ,
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
8) Citrat wird verwertet.
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoff- ,
quellen verwertet.
10) Chromogen '
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
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14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler
pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 4O°C. Wachstum ; bei 100C. Optimale Temperatur etwa 3O0C. ;
pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 4O°C. Wachstum ; bei 100C. Optimale Temperatur etwa 3O0C. ;
15) aerob
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein'Gas aus L-Arabinose, D-Glucose, ·,
D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Lactose, ;
Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit. Keine Säure! und kein Gas aus D-Xylose, Maltose, Saccharose, j
Glycerin und Stärke. :
.d) Andere taxonomische Eigenschaften
1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv.
2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht i benötigt. ;
3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird! nicht absorbiert. ·
4) Cellulose wird nicht abgebaut. S
5) Vom Boden isoliert. j
6) Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen. !
h. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-105 j
a) Zellmorphologie :
1) Stäbchen, 0,5-0,7 χ 1,0-3,0 ,um
2) nicht pleomorph · '
3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln .
4) keine Sporenbildung
5) gramnegativ !
6) nicht säurefest
b) Kulturmerkmale ;
1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (entire),
konvex, glatt, undurchsichtig, gelblich weiß, !
glänzend.
IB (09832^10)9311
" αι " 260Ό589
2) Schrä'gagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, gelblich
weiß, glänzend. j
weiß, glänzend. j
3) Brühe: Sediment, Pellucula.
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung. ■
5) Lackmusmilch: alkalisch mit Serumzone. ι
c) Physiologische Eigenschaften !
1) Nitrate werden in Nitratnährmedium nicht reduziert.j
2) Denitrifikation findet nicht statt.
3) Methylrottest: negativ [
4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet. j
5) Indol wird nicht gebildet.
6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet. \
7) Stärke wird nicht hydrolysiert. j
8) Citrat wird in Christensen-Medium, aber nicht !
in Koser-Medium verwertet. '
9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
10) Kein Farbstoffbildner
11) Urease wird gebildet.
12) Oxidase: positiv ,
13) Katalase: positiv ;
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler pH-Werjt etwa 7. Kein Wachstum bei 400C. Wachstum bei 10°C. j
Optimale Temperatur etwa 3O°C.
15) aerob
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ :
17) Säure, aber kein'Gas aus L-Arabinose, D-Xylose,
D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, ; Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit ι und Glycerin. Keine Säure und -kein Gas aus Lactose,
D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, ; Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit ι und Glycerin. Keine Säure und -kein Gas aus Lactose,
i Inosit und Stärke. '
d) Andere taxonomische Eigenschaften
1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv !
2) Vitamin zum Wachstum benötigt.
609832/0331
3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird j
nicht absorfciert. ΐ
4); Auf" Zucrkermedien werden viskose Kolonien gebildet. >
5) Cellulose wird nicht abgebaut« ι
6). Vom Boden: isoliert.
77 Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.
77 Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.
5« Taxonomisehe Eig;err.schaf ten der Stamme. KB-97 und KB—ΙΟβ
a)· Zellmorphalog-ie ι
U= Kurze Stäbchen: Q-tB-lrO κ IxQ-1IfS um. [
2Ϊ In jungen Kulturen: werdteni große unregelmäßige I
ZeIlern gefunden* In alteren Kulturen werden die
Zellen zu kokfceKförtnigert Stäbchen«
3) Unbeweglich i
4) Keine Sporenbildung j
5) Gramnegativ
6) Nicht säurefest j
b) ·Kulturmerkmale " I
1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (entire), :
konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig, j glänzend. !
2) Schrägagar: mäßiges Wachstum, fadenförmig, glatt, gräulich weiß, glänzend. i
3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum;
Sediment. !
4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung. !
5) Lackmusmilch: leicht alkalisch, nicht peptonisiert; ;
keine Serumzone. ■
c) Physiologische Eigenschaften I
1) Reduktion von Nitrat: KB-1O6 positiv, jedoch KB-97
negativ in Nitratbrühe.
2) Denitrifikation findet nicht statt.
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33 ^ethylrot-Test: negativ
,Acetylimethylcarbinol wird nicht gebildet. ;
Imdol wird nicht gebildet, '
63 Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
8) Citrat wird nicht verwertet. I Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoff- ;
quellen verwertet.
10) Achromogen "~~~ :
11) Urease wird gebildet. .
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv '
14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 8,6. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 100C.
Optimale Temperatur etwa 30°C.
Optimale Temperatur etwa 30°C.
15) Aerob >■
16) Hugh-Leifson-Test: oxydativ
17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose und D-Fructosel.
Etwas Säure, aber kein Gas aus D-Xylose, D-Glucose,
D-Mannose, D-Galactose und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Saccharose, Lactose, j Trehälose, D-Sorbit, D_Mannit, Inosit und Stärke.
D-Mannose, D-Galactose und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Saccharose, Lactose, j Trehälose, D-Sorbit, D_Mannit, Inosit und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
1) 3-Ketolactose wird nicht gebildet.
2) Wachstum auf Hefeextrakt-Medien innerhalb von '
3 Tagen.
3) Von Wurzelknoten von Klee isoliert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem Calcium-cis-epoxysuccinat dem Kulturmedium im Verlauf der1
Bebrütung des Mikroorganismus zugesetzt wird, wodurch es j möglich ist, die Vorgänge der Bebrütung der Mikrobien und;
der chemischen Reaktion gleichzeitig durchzuführen.
Für die Kultivierung der Mikroorganismen kann ein flüssi-
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ges oder festes Nährmedium verwendet werden. Gebräuchlicher und zweckmäßiger ist jedoch die Schüttelkultur oder '
das unter Belüften und Rühren durchgeführte Kulturverfall-, ren. Bei beiden Verfahren wird ein flüssiges Nährmedium
verwendet.
Die Wahl der Art oder des Zustandes des Nährmediums bzw. Kulturmediums unterliegt keiner besonderen Begrenzung ι
oder Bedingung, d.h. beliebige Arten von Nährmedien können verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie an die Mikrobien!
so angepaßt sind, daß sie normal und zuverlässig zu wach-j sen vermögen, und daß das Enzymsystem, das das Calcium- !
cis-epoxysuccinat in Calcium-L(+)-tartrat umzuwandeln
vermag, in ausreichendem Maße darin gebildet werden kann.i
Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise <
Calcium-cis-epoxysuccinat, Glucose, Lactose, Glycerin, Saccharose, Melasse, organische Säuren und Kohlenwasserstoffe.
Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Proteinhydrolysate, z.B.Pepton, Casaminosäure ^Hersteller.
Difco) und N-Z-Amin (Hersteller Schefield) sowie Stoffe wie Hefeextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, '
Aminosäuren, verschiedene Ammoniumsalze, verschiedene Arten von Nitraten und andere organische oder anorganische
Stickstoffverbindungen. Ferner können als anorgani- I
sehe Salze verschiedene Arten von Phosphaten, Magnesium-_
sulfat, Natriumchlorid u.dgl. als geeignete Zusätze züge-'
geben werden. Zur Begünstigung des Wachstums von Bakte- | rien können ferner verschiedene Vitamine, Verbindungen,
an die Nucleinsäuren gebunden sind,u.dgl. zugesetzt werden. Unabhängig davon, welches Kulturverfahren in der i
Praxis angewandt wird, ist es zweckmäßig, zu Beginn der Bebrütung oder Kultivierung cis-Epoxysuccinat wenn auch
nur in geringer Menge dem Nährmedium zuzusetzen, da [
hierdurch bessere Ergebnisse erzielt werden. ,
Zur Einleitung der Kultivierung wird außerdem das Nähr—
medium vorzugsweise mit einer geeigneten Menge eines j Kulturmediums geimpft, das durch'eine vorher im kleineren!
Maßstab durchgeführte Vorkultur erhalten worden ist.
Die Kultivierungsbedingungen einschließlich Kultivierungsund -dauer
temperatur/und Acidität-Alkalinität der Flüssigkeit im
Kulturmedium und andere Faktoren sind verschieden in ■ Abhängigkeit von der Art der verwendeten Mikroorganismen j
oder von der Zusammensetzung oder den Elementen des Nährmediums. Es genügt jedoch, die Wahl und Einstellung so ■
vorzunehmen, daß das Ziel, d.h. maximale Bildung des j Enzymsystems, erreicht wird. In vielen Fällen der Praxis '.
werden gute Ergebnisse erzielt, wenn die Kultivierung ί 1 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis ;
400C durchgeführt wird, während der pH-Wert des Kulturmediums
bei etwa 5 bis 9 gehalten wird. I
Das als Ausgangsmaterial verwendete Calcium-cis-epoxy- ' succinat kann in beliebiger Form als normales Salz, saures
Salz oder Gemisch dieser Salze verwendet werden. Bei
Verwendung eines Ausgangsmaterials, das ein saures Salz ;
enthält, ist es jedoch im allgemeinen vorteilhaft, das j
Medium vorher mit Calciumchlorid, Calciumcarbonat u.dgl. '
zu neutralisieren* Es ist jedoch auch möglich, das Um- !
wandlungsverfahren so durchzuführen, daß Natrium-cis- {
epoxysuccinat, Kalium-cis-epoxysuccinat u.dgl. dem Reak— :
K ■ ' werden
tlonsgemisch .'zugesetzt/, das Calciumchlorid oder andere '
Calciumsalze in äquimolaren Mengen gegenüber den Succi- I naten enthält, wodurch die Succinate in die entsprechenden
Calciumsalze umgewandelt werden.
Wenn das als Ausgangsmaterial dienende Calcium-cis-epoxy— succinat dem Kulturmedium im Verlauf des Kultivierungsprozesses zugesetzt wird, erfolgt die Zugabe entweder
vor Beginn der Bebrütung oder zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Bebrütung. In diesem Fall wird das j
Ausgangsmaterial beispielsweise in Form von kristallinem ' Calciumsalz oder auch in Form einer Suspension in einem !
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geeigneten Lösungsmittel, z.B. Wasser, verwendet» Die j
Kristalle oder die Suspension werden entweder auf einmal j oder kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum oder :
intermittierend in regelmäßigen Abständen während der :
Kultivierungszeit des Mikroorganismus zugesetzt. j
Die Gesamtmenge des Calcium—eis—epaxysuccinats, die
während der Kultivierung des Mikroorganismus verwendet ;
wird, liegt bei nicht weniger als 5% (Gewv/Vol.) und
kann bis zu 50% (als freie Säure) betragen.
Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung I wird ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in das
Kulturmedium gegeben, um die Inkubationszeit zu verkürzen ; und das Calcium-cis-epoxysuccinat besonders wirkungsvoll j
in das Calcium-L(+)-tartrat umzuwandeln. |
Die verschiedensten nichtionogenen oberflächenaktiven
Verbindungen können für das Verfahren gemäß der Erfindung1
verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise Sorbitan— j
fettsäureester (z.B. Sorbitanmonooleat,und Sorbitantrioleat),
Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester (z.B. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat und Polyoxyäthylensor— ·
bitanmonooleat), Polyoxyäthylensorbitfettsäureester (z.B.Polyoxyäthylensorbitmonolaurat) , Polyoxyäthylen- ''
fettsäureester (z.B. Polyoxyäthylenstearat und Polyoxyäthylenlaurat),
Polyoxyäthylenalkoholäther (mit höheren Alkoholen) (z.B. Polyoxyäthylenlaurylalkoholäther und '-.
Polyoxyäthylenoleylalkoholäther), Polyoxyäthylenalkyl- ,
aryläther (z.B. Polyoxyäthylen-nonylphenoläther und ; Polyoxyäthylenoctylphenoläther), Glycerylfettsäureester ί ,_
(z.B. Glycerylmonostearat), Alkylenglykolfettsäureester 0^
(z.B. Propylenglykolmonostearat), Polyoxypropylen-poly- ;
oxyäthylenalkyläther (z.B. Polyoxypropylenpolyoxyäthylencetylalkoholäther), Kondensationsprodukte von Polyoxyäthylenalkylphenol
und Formaldehyd (z.B. Polyoxyäthylennonylphenol-Formaldehyd-Harze
und Polyoxyäthylenoctylphenol-Formaldehyd-Harze),
Polyoxyäthylenalkylamin oder -amid (z.B..Polyoxyäthylenoleylamin und Polyoxyäthylenoleylamid),
Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivate, Polyoxyäthylen-LanolinalkohoIderivate,
Polyoxyäthylensorbit—
Bienenwachs-Derivate, Polyoxyäthyleh-Rizinusöl-Derivate,
Polyoxyäthylenpolyole, Polyoxypropylenpolyole, Polyoxy—
cn ο co
athylenoxypropylenpolyole (z-B. Xthylendiamin-oxypropylenoxyäthylentetraol),
Polyoxyäthylentetrahydrofurfuryl- ;
alkohol und Polyoxypropylenfettsaureester. ;
Im allgemeinen werden die oberflächenaktiven Verbindungen
in einer Menge von 0,O5 bis 5,0% (Gewi/Vol.), vorzugsweise
0,05 bis 2,O% verwendet. Die oberflächenaktiven Verbindungen können auf einmal vor Beginn der Kultivierung
oder portionsweise im Verlauf der Kultivierung züge-: setzt werden.
Wie bereits erwähnt, kann dgs im Kulturmedium oder im
Reaktionsgemisch gebildete Calcium-L(+)-tartrat leicht durch Filtration oder Zentrifugieren isoliert werden.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der
Erfindung werden in den folgenden.Beispielen beschrieben.
Stamme von Spezies wie Acinetobacter tartarogenes KB-82, Pseudomonas species KB-86, Agrobacterium aureum KB-91 und
Rhizobium validum KB-106 werden in 30 ml Nährmedium ge- ,
impft, das in 200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und
0,05% Casaminosäure, 0,5% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat,
0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen-(Il)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat.
Gleichzeitig wird kristallines Calcium-, Dinatrium- und Dikalium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß die Endkonzentration
jeweils 5%, gerechnet als freie Säure, beträgt. Das Gemisch wird dann 2 Tage bei 30°C in rotierender
Schüttelkultur bebrütet. Bei Herstellung des Nährmediums unter Zusatz von Calcium-cis-epoxysuccinat wird das Endprodukt
durch Zentrifugieren abgetrennt, nachdem das Calciumsalz vorher mit Schwefelsäure löslich gemacht
worden, ist. Bei Verwendung des Dikaliumsalzes oder Dinatriumsalzes
beim Ansetzen des Nährmediums wird das Kulturmedium ohne jede Vorbehandlung zentrifugiert. Die
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Menge der L(+)-Weinsäure wurde an Hand des Wertes der
optischen Drehung bei 436 rau bestimmt, während die nicht ; umgesetzte cis-Epoxybernsteinsäure nach der Methode von
Payne und Williams bestimmt wurde (G.B.Payne und P.H.
Williams, Journal of Organic Chemistry 24 (1959) 54). Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.
cis-Epoxybernsteinsäure
Mikroorganismus
Calciumsalz
Natriumsalz
Kaliumsalz
(A) (B) * (A) (B) (A) (B) 00 00 00 00 (%) (<*)
Acinetobacter
tartarogenes Kß-82
Pseudomonas species
KB-86
Affrobacterium
aureum
KB-91
Ehizobium
90
10 85
87
4-2
95
92
75
22
92
92
validum
11
KB-106
Mol ;
* (A): Ausbeute an L( + )-Weinsäure. Hierbei gelten 100%
für den Fall, in dem die (gesamte eis—Epoxybernsteinsäure
vollständig in L(+)-Weinsäure umgewandelt worden ist. \
**(B): Restliche cis-Epoxybernsteinsäure, bezogen auf die zugesetzte Menge-, Hierbei gelten 100% für den :
Fall, in dem 1,5 g cis-Epoxybernsteinsäure als , freie Säure zurückbleibt.
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Beispiel 2 j
Mit einem Stamm von Acinetebacter tartarogenes KB-111 j
werden 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das ' in einem 2 1-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6% j
Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat ent- ■
hält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Das Gemisch wird i 24 Stunden bei 30°C in hin- und hergehender Schüttel- (
kultur bebrütet, wobei 500 ml Kulturmedium erhalten werden. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 1-Tank über- |
führt, der 30 1 eines flüssigen Nährmediums enthält, das ■ 0,1% Polypepton, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumphos- :
phat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und ■ 0,2% Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat.
Gleichzeitig werden 180 g Calcium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Das erhaltene Produkt wird unter Belüften und ;
Rühren bei 300C kultiviert, wobei etwa 20 g des Schaumverhütungsmittels
"Actocol 31-56" (hergestellt von der Anmelderin) zugesetzt werden. 24 Stunden nach Beginn der ■
Kultivierung werden 3 kg (gerechnet als freie Säure) ; Calcium-cis—epoxysuccinat zugesetzt, worauf weitere !
48 Stunden kultiviert wird. Etwa 30 1 des erhaltenen 1
Kulturmediums werden mit einer Filterpresse filtriert.
Der erhaltene feste Anteil wird mit Wasser gewaschen. !
Das Zentrifugieren und Waschen werden wiederholt, worauf '. die erhaltenen festen Anteile gut verrieben und getrocknet
werden. Nach Abschluß aller vorstehend beschriebenen Arbeitsgänge wird kristallines Calcium-L(+)-tartrat in
einer Menge von 4,2 kg (gerechnet als Anhydrid; Reinheit 99%) erhalten. (Bei Berechnung nach der in Beispiel 1 (A)
beschriebenen Methode beträgt die Ausbeute 93%.)
Als Vergleich zu dem vorstehenden Beispiel wird ein weiterer Versuch durchgeführt, bei dem der Stamm KB-111
verwendet wird. Bei diesem Versuch wird die Kultivierung
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unter den gleichen Bedingungen wie im vorstehenden Beispiel mit Ausnahme des verwendeten Materials durchgeführt.
An Stelle von Calcium-cis-epoxysuccinat wird die
gleiche molare Menge Dinatrium-cis-epoxysuccinat verwen-
gleiche molare Menge Dinatrium-cis-epoxysuccinat verwen-
det- Etwa 30 1 des erhaltenen Kulturmediums werden mit
einer Filterpresse filtriert. Unter gutem Rühren werden ! 3,5 kg kristallines Calciumchlorid (Dihydrat) portions- j weise zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird mit . : der Filterpresse abfiltriert, wobei 5,8 kg feste Substanz: erhalten wird. Am Dünnschichtchromatogramm dieser festen ' Substanz ist die restliche cis-Epoxybernsteinsäure fest- :- zustellen. (Dünnschicht: feine kristalline Cellulosefolie^ Hersteller Tokyo Kasei Chemical Ind. Co.; Lösungsmittel:
Isopropyläther-Tetrahydrofuran-Ameisensäure-Wasser
(10:10:5:4); entwickelt mit Bromkresolgrün.) Auf der I Grundlage dieser Bestimmungen wird der Gehalt an L(+)-Weinsäure nach der in Beispiel. 1 beschriebenen Methode,
d.h. nach der Methode der optischen Drehung, bestimmt. ! Hierbei wird festgestellt, daß die Menge der gebildeten
L ('+)-Weinsäure 1,3 kg als wasserfreies Calciumsalz beträgt. (Bei Berechnung nach der in Beispiel 1 (A) be- j
einer Filterpresse filtriert. Unter gutem Rühren werden ! 3,5 kg kristallines Calciumchlorid (Dihydrat) portions- j weise zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird mit . : der Filterpresse abfiltriert, wobei 5,8 kg feste Substanz: erhalten wird. Am Dünnschichtchromatogramm dieser festen ' Substanz ist die restliche cis-Epoxybernsteinsäure fest- :- zustellen. (Dünnschicht: feine kristalline Cellulosefolie^ Hersteller Tokyo Kasei Chemical Ind. Co.; Lösungsmittel:
Isopropyläther-Tetrahydrofuran-Ameisensäure-Wasser
(10:10:5:4); entwickelt mit Bromkresolgrün.) Auf der I Grundlage dieser Bestimmungen wird der Gehalt an L(+)-Weinsäure nach der in Beispiel. 1 beschriebenen Methode,
d.h. nach der Methode der optischen Drehung, bestimmt. ! Hierbei wird festgestellt, daß die Menge der gebildeten
L ('+)-Weinsäure 1,3 kg als wasserfreies Calciumsalz beträgt. (Bei Berechnung nach der in Beispiel 1 (A) be- j
schriebenen Methode beträgt die Ausbeute 30%.) '
Mit einem Stamm von Acinetobacter tartarogenes Kß-112 j
werden je 500 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das, in zwei 2 1-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6%
Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,2% Casaminosäure, 0,5% ; Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05%
Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat.
Dieses Gemisch wird 30 Stunden in hin- und hergehender ; Schüttelkultur bei 300C bebrütet, wobei 1 1 Kulturmedium
erhalten wird. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 1- ' Tank überführt, de'r 30 1 eines flüssigen Nährmediums ent-; hält, das 0,1% Casaminosäure, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1%
Dikaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält und
Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,2% Casaminosäure, 0,5% ; Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,05%
Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat.
Dieses Gemisch wird 30 Stunden in hin- und hergehender ; Schüttelkultur bei 300C bebrütet, wobei 1 1 Kulturmedium
erhalten wird. Dieses Kulturmedium wird in einen 50 1- ' Tank überführt, de'r 30 1 eines flüssigen Nährmediums ent-; hält, das 0,1% Casaminosäure, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1%
Dikaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält und
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einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calciumcis-epoxysuccinat
in einer als freie Säure gerechneten Menge von 9 kg zugesetzt. Nach der Zugabe des Succinats
wird die Kultivierung unter Belüftung und Rühren 3 Tage bei 3O0C durchgeführt. Während der gesamten Kultivierungsdauer werden etwa 20 g des Schaumverhütungsmittels
"Actocol 31-56" portionsweise zugesetzt. Etwa 38 1 des erhaltenen Kulturmediums werden mit der Filterpresse
filtriert. Der feste Anteil wird gewaschen, in 40 1 ! Wasser suspendiert und gut gerührt.. Das Gemisch wird
stehen gelassen, wobei der feste Anteil sich absetzt. Nachdem etwa 25 1 Überstand verworfen worden sind, werden
erneut 25 1 Wasser zugesetzt, worauf gerührt wird. Das Gemisch wird mit der Filterpresse filtriert. Die
hierbei erhaltene feste Substanz wird zerkleinert, verrieben und getrocknet. Hierbei werden 11,9 kg kristallines
Calcium-L(+)-tartrat erhalten (gerechnet als Anhydrid; Reinheit 98%).
Mit einem Stamm von Rhizobium validum KB 97 werden 500 ml
eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem 2 1— Sakaguchikolben enthalten ist und 0,5% Hefeextrakt und
0,5% Glucose enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Das Kulturmedium wird in hin- und hergehender Schüttelkultur
24 Stunden bei 30°C bebrütet. Das erhaltene Kulturmedium wird in einen 50 1-Tank überführt, der- 30 1 eines flüssigen
Nährmediums enthält, das 0,2% Maisquellwasser, 0,6% Calcium-cis-epoxysuccinat, 0,6% Ammoniumsulfat,
0,1% Dikalxumhydrogenphosphat und 0,03% Magnesiumsulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Der Inhalt des
Tanks wird 40 Stunden bei 30°C unter Belüftung und Rühren kultiviert, wobei etwa 30 1 Kulturmedium erhalten werden.
Eine Menge von 15 1 dieses Kulturmediums wird in einen 200 1-Tank überführt, der 100 1 eines flüssigen Kulturmediums
enthält, das 0,05% Maisquellwasser, 1,0% Ammo-
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niumsulfat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magne- !
siumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält und einen ,
pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium-cisepoxysuccinat in einer Menge, die 10 kg der freien Säure i
entspricht, zugesetzt. Nach der Zugabe des Succinats
wird der Inhalt des Tanks unter Belüften und Rühren bei ' 300C bebrütet, während etwa 50 g des Schaumverhütungsmittels "Actocol 31-56" zugesetzt werden. Die Kultivierung unter Belüften und Rühren wird 5 Tage durchgeführt. ] Am I.Tag und am 3.Tag werden je 20 kg (gerechnet als ,
wird der Inhalt des Tanks unter Belüften und Rühren bei ' 300C bebrütet, während etwa 50 g des Schaumverhütungsmittels "Actocol 31-56" zugesetzt werden. Die Kultivierung unter Belüften und Rühren wird 5 Tage durchgeführt. ] Am I.Tag und am 3.Tag werden je 20 kg (gerechnet als ,
freie Säure) Calcium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Etwa
150 1 des hierbei erhaltenen Kulturmediums werden mit j der Filterpresse filtriert. Der feste Anteil wird gewaschen und in 150 1 Wasser suspendiert. Nach gutem j Rühren läßt man den festen Anteil absitzen. Etwa 70 1 ! des Überstandes über dem Sediment werden verworfen, worauf erneut 70 1 Wasser zugesetzt werden, worauf gut
gerührt und mit der Filterpresse filtriert wird. Die
Endausbeute an kristallinem Calcium-L(+)-tartrat beträgt
64,8 kg,(gerechnet als Anhydrid.; 'Reinheit 99%).
150 1 des hierbei erhaltenen Kulturmediums werden mit j der Filterpresse filtriert. Der feste Anteil wird gewaschen und in 150 1 Wasser suspendiert. Nach gutem j Rühren läßt man den festen Anteil absitzen. Etwa 70 1 ! des Überstandes über dem Sediment werden verworfen, worauf erneut 70 1 Wasser zugesetzt werden, worauf gut
gerührt und mit der Filterpresse filtriert wird. Die
Endausbeute an kristallinem Calcium-L(+)-tartrat beträgt
64,8 kg,(gerechnet als Anhydrid.; 'Reinheit 99%).
Ein Stamm von Acinetobacter tartarogenes KB-99 wird in
30 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem
200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und 0,5% Hefeex- < trakt, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 1,8% Calciumchlorid (Dihydrat) : enthält und einen pH-Wert von 7,2 hat. In jedem Fall wird; eine Impfnadelmenge des Stamms zugesetzt. Gleichzeitig : wird das Natriumsalz (A) bzw. das Kaliumsalz (B) von
eis—Epoxybernsteinsaure in einer Menge zugesetzt, die j jeweils 1,5 g der freien Säure entspricht. Das Gemisch
wird 2 Tage der rotierenden Schüttelkultur bei 30°C ! unterworfen. Mit einem Teil dieses Kulturmediums wird ,' eine andere Kultivierung unter den gleichen Bedingungen
durchgeführt, wobei jedoch 1) ein modifiziertes Nährme-
30 ml eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in einem
200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und 0,5% Hefeex- < trakt, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 1,8% Calciumchlorid (Dihydrat) : enthält und einen pH-Wert von 7,2 hat. In jedem Fall wird; eine Impfnadelmenge des Stamms zugesetzt. Gleichzeitig : wird das Natriumsalz (A) bzw. das Kaliumsalz (B) von
eis—Epoxybernsteinsaure in einer Menge zugesetzt, die j jeweils 1,5 g der freien Säure entspricht. Das Gemisch
wird 2 Tage der rotierenden Schüttelkultur bei 30°C ! unterworfen. Mit einem Teil dieses Kulturmediums wird ,' eine andere Kultivierung unter den gleichen Bedingungen
durchgeführt, wobei jedoch 1) ein modifiziertes Nährme-
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dium verwendet wird, das die gleiche Zusammensetzung
wie das oben genannte Nährmedium hat, jedoch kein Calciumchlorid enthält, und 2) nach dem Impfen mit dem
Stamm KB-99 in einer Impfnadelmenge das Calciumsalz (C) von cis-Epoxybernsteinsäure in einer Menge, die 1,5 g
der freien Säure entspricht, zugesetzt wird. Das hierbei erhaltene Kulturmedium wird auf dem Glasfilter filtriert
und dann mit Wasser gespült. Hierbei wird kristallines L(+)-Tartrat erhalten. Die aus den Kulturmedien A, B und
C erhaltene, als Anhydrid gerechnete Menge von Calcium-L(+)-tartrat beträgt 1,7, 1,8g bzw. 1,9 g. Die Reinheit \
beträgt in allen Fällen 97-99%. Dieses Ergebnis zeigt j eindeutig, daß auch das Natriumsalz oder Kaliumsalz von |
Epoxybernsteinsäure als Ausgangsmaterial verwendet wer- ! den kann, vorausgesetzt, daß im Kulturmedium das Calcium^
ion in einer der cis-Epoxybernsteinsäure äquivalenten Menge vorhanden ist, und daß dieses Ausgangsmaterial ι
leicht mit dem Ion unter Bildung des Calciumsalzes von
cis-Epoxybernsteinsäure reagiert. Hierbei wird somit fast das gleiche Ergebnis erzielt, als wenn das Calcium- '
salz von vornherein zugesetzt wird. ;
Ein Stamm vonAcinetobacter tartarogenes KB-112 wird in
30 ml eines Nährmediums geimpft, das in einem 200 ml- ;
Erlenmeyerkolben enthalten ist. Diesem Grundnährmedium,
das 0,05% Casaminosäure, 0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat,
0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% \
Eisen(II)-sulfat enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat,
werden verschiedene nichtionogene oberflächenaktive Ver- ' binduhgen in einer Konzentration von 0,1% zugesetzt. ;
Gleichzeitig wird kristallines Calcium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß seine als freie Säure gerechnete End- !
konzentration 40% beträgt. Das Gemisch wird 2 Tage der rotierenden Schüttelkultur bei 300C unterworfen und dann
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der Reaktion überlassen. Nach Beendigung der Reaktion wird die Flüssigkeit filtriert. Die vom Filtrat erhaltenen
Kristalle werden in Schwefelsäure gelöst. Die gelösten ! Kristalle werden dann zur Entfernung der festen Substanzen
zentrifugiert. Anschließend wird die L (+■)-Weinsäure auf [
der Grundlage der optischen Drehung bei 436 mu und die ' restliche cis-Epoxybernsteinsäure nach der Methode von ;
ι Payne und Williams (Journal of Organic Chemistry
(1959) 54) quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Oberflächenaktive Verbindung*
Ausbeute an
L(+)-Wein-
L(+)-Wein-
Restliche cis-f Epoxybern-
säure, Mol-% steinsäure, %.
Sorbitanmonooleat
"NIKKOL SR-IO" 45
Polyoxyäthylensorbitan-
monooleat "NIKKOL TO-IO" 72
Polyoxyäthylensorbithexastearat
"NIKKOL GS-6"" 50
PoIyoxyäthylenstearat
"NIKKOL MYS 10" 47
Polyoxyäthylen-cetylalkohol-
äther "NIKKOL BC-7" 52
Polyoxyäthylen-nonylphenoläther
"NIKKOL NP-18TX" 55
Glycerylmonostearat
"NIKKOL MGS-C" 48
Propylenalykolmonostearat
"NIKKOL PMS-SE" 46
Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivat
"NIKKOL TW-20" 75
Polyoxyäthylen-Lanolin-Alkoh'ol-Derivat
" NIKKOL BWA-2o" 74
Derivat von Polyoxyäthylen und gehärtetem Rizinusöl "NIKKOL HCO-5O"73
PoIyoxyäthylen-wonylphenol-Formaldehydharz
"NIKKOL R-1020" 73
Polyoxyäthy1en-tetrahydrofurfury1-alkohol
"NIKKOL TF-4" 54
52
25
48
50
43
47
50
21
21
23
21
42
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Tabelle 1 (Forts.)
Oberflächenaktive Verbindung Ausbeute an Restliche cis-
* L(+)-Wein- Epoxybern-
säure, Mol-% steinsäure, %
Polyoxyäthylenoxypropylen-
stearat "NIKKOL TPMS-30" 70 26
Äthylendiamin-polyoxypropylen-
oxyäthylentetraol :
"TETRONIC T-702" 52 45
Kein Zusatz 34 64 ;
* Hersteller der Verbindungen "NIKKOL": Nikko Chemicals Co., Ltd.
Hersteller von TETRONIC T-702": Asahi Denka Kogyo Co.
*♦ Ein Wert von 100% stellt den Fall dar, in dem die cis-Epoxybernsteinsäure vollständig zu L(+)-Weinsäure
umgesetzt worden ist.
*** Rest der zugesetzten cis-Epoxybernsteinsäure in den
Kristallen. Hierbei stellt 100% den Wert in dem Fall dar, in dem 12 g als freie Säure zurückbleiben.
Stämme von Acinetobacter tartarogenes KB-82, Pseudomonas .
species KB-86, Agrobacterium aureum KB-9i? Acinetobacter
tartarogenes KB-99? Agrobacterium viscosum KB-105 und
Rhizobium validum KB-IO6 werden jeweils in 50 ml eines
flüssigen Nährmediums geimpft, das in 200 ml-Erlenmeyerkolben
enthalten ist und 0,2% Maisquellwasser, 0,1% Glucose, 0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat,
0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(Il)-sulfat
enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calcium-cis-epoxysuccinat so zugesetzt, daß seine Endkonzentration
30% als freie Säure beträgt. Auf diese Weise wird die Kultivierung eingeleitet. Die in Tabelle 2 genannten
oberflächenaktiven Verbindungen werden zu geeigneten Zeitpunkten zugesetzt. Das Gemisch wird 42 Stunden der
Schüttelkultur bei 30°C unterworfen. Die Ergebnisse der Kultivierung zeigen, daß bei allen Stämmen die Ausbeuten
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an L(+)«Weinsäure höher sind als bei den Versuchen, bei
denen die Kultivierung ohne Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung durchgeführt wurde.
denen die Kultivierung ohne Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung durchgeführt wurde.
Mikroorganismus Tensid und Konzentration, % *
Zeit- Ausbeute ■
punkt an L(+)- ,
der Weinsäure,
Zugabe % *·
| Acinetobacter tartarogenes KB-82 |
Polyoxyäthylensorbitan- monolaurat "NONION LT-221" (0,2) ohne Zusatz |
0 | 83 59 |
| Pseudomonas species KB-86 |
PοIyoxyäthylenoley1- äther "NONION E-215" (0,05) ohne Zusatz |
0 | 47 ' 31 |
| Agrobacterium aureum KB-91 |
Polyäthylenglykolmono- laurat "NONION L-4" (0,1) ohne Zusatz |
12 | I 65 ; 50 |
| Acinetobacter tartarogenes KB-99 |
Polyoxyäthylen-Octyl- phenolformaldehydharz "NIKKOL R-2O3O" (0,1) ohne Zusatz |
18 | 89 77 |
| Agrobacterium viscosum KB-105*** |
Polyoxyäthylen-Rizi- nusöl-Derivat "NIKKOL C0-60TX" (0,05) ohne Zusatz |
0 | ι I 59 ; 48 ί |
| Rhizobium validum KB-106 |
Polyoxyäthylenoxy- propylenpolyol "PLURONIC L-61" (0,15) ohne Zusatz |
0 | 92 85 : |
#Hersteller der Tenside NONION Nippon Jushi Co. j
(Japan Fats & Oils Mfg.Co.,Ltd.), PLURONIC Asahi Denka!
Kggyo Co. !
**Die Ausbeute an L(+)-Weinsäure in Mol.-% wurde nach
der in Beispiel 1 beschriebenen Methode bestimmt. I
♦**Bei der Kultivierung dieses Stammes wurden 100 .ug/ml j
Pyridoxalhydrochlorid dem Kulturmedium zugesetzt.
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Beispiel 8 ί
Ein Stamm von Rhizobium validum KB-9 7 wird zusammen mit J
einem Stamm von Acinetobacter tartarogen^es ΚΒ-1Ί1 in ·
jeweils 500 ml eines Nährmediums geimpft, das aus dem
in Beispiel 1 genannten Grundnährmedium und einem züge- !
setzten Tensid besteht. Gleichzeitig wird Calcium—cisepoxysuccinat
dem Kulturmedium so zugesetzt, daß seine
als freie Säure gerechnete Endkonzentration 50% beträgt. I
Anschließend wird das Gemisch in hin- und hergehender
bei 2 8°C j
Schüttelkultur/bebrütet. Die als Rückstand im Kultur- !
medium verbleibende Menge der cis-Epoxybernsteinsäure j
wird durch Dünnschichtchromatographie verfolgt (Dünn- ;
schicht: feinkristalline Cellulosefolie (fine-crystal
cellulose spot film) (Hersteller Tokyo Kasei Co.); |
Lösungsmittel: Isopropyläther-Tetrahydrofuran-Ameisen- !
säure-Wasser (10:10:5:4); Farbentwicklung: Bromkresol— ]
grün). Anschließend wird die Kultivierung fortgesetzt, ι bis die cis-Epoxybernsteinsäure verschwunden ist. Die
während der Umwandlungsreaktion bis zum Endpunkt der ; verstrichene Zeit sowie die Ausbeute an L(+)-Weinsäure
(in Mol.-%, ermittelt nach der in Beispiel 1 beschrie- '.
'benen Methode) sind in Tabelle 3 genannt, aus der die ;
Verkürzung der Reaktionsdauer und die Steigerung der ί
Ausbeute ersichtlich sind. '
das in 2 1-Sakaquchikclben enthalten war
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ο ca co
| Mikroorganis mus |
NONlON (0. (Std.) |
OT-221* 15 %) Ausbeute (S) |
EIPONOX NCG* (0.1 %) . Zeit Ausoeute (Std.) (%) , |
NIKKCL HCO-80* (ü.? %) zeit AUBöeute (Std.) (%) |
Kein Ei | 85 |
| Ehizobium | 96 89 | 78 9? | ||||
| validum | 84- | 89 | 108 85 | ioa | ||
| KB-97 | 90 87 | 8J | ||||
| Acinetobacter | ||||||
| tartarogen.es KB-I11 |
84 | 90 | 1^0 | |||
00 I
*NONION OT-221: Polypxyäthylensorbitanmonooleat
. (Hersteller Nippon Yushi Co. - Japan Fats & Oils Mfg.Co.)
RIPONOX NCG: Polyoxyäthylenalkylphenoläther
(Hersteller Lion Fats & Oils Mfg. Co.)
NIKKOL HCO-80: Derivat von Polyoxyathylen und gehärtetem
(Hersteller Nikko Chemicals Co,)
CD CD
cn co co
Ein Stamm von Rhizobium validum KB-97 wird in 500 ml j
eines flüssigen Nährmediums geimpft, das in zwei 2 1- ; Sakaguchikolben enthalten ist und 0,5% Glucose und 1,0%
Maisquellwasser enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. ; Der Inhalt der beiden Kolben wird 24 Stunden bei 28°C , in hin- und hergehender Schüttelkultur bebrütet, wobei
etwa 1 1 Kulturmedium erhalten wird. Dieses Kulturmedium : wird in einen 50 1-Tank überführt, der 30 1 eines flüs- ι sigen Nährmediums enthält, das 0,2% Maisquellwasser,
0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, ; 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und 0,1% , Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivat ("NIKKOL TW-20") enthält
und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calciumcis-epoxysuccinat in einer als freie Säure gerechneten
Menge von 6 kg zugesetzt. Das Gemisch wird bei 300C bebrütet. Nach 19 Stunden vom Beginn der Kultivierung wer- ·" den weitere 6 kg Calcium-cis-epoxysuccinat (gerechnet als j freie Säure) zugesetzt und weiter bebrütet, bis insgesamt 48 Stunden vom Beginn der Kultivierung vergangen
sind. Das erhaltene Kulturmedium wird wie folgt aufge- ; arbeitet: 40 1 Kulturmedium werden mit der Filterpresse ; filtriert. Der feste Anteil wird mit Wasser gespült und : in 30 Uasser suspendiert. Die Suspension wird gut gerührt und dann zum Absitzen der festen.Bestandteile \ stehen gelassen. 20 1 Überstand werden verworfen. Nach
Zusatz von 20 1 Wasser wird die Suspension gut gerührt | und dann mit der Filterpresse filtriert, wobei 15,9 kg
kristallines Calcium-L(+)-tartrat (gerechnet als Anhydrid) mit einer Reinheit von 98% erhalten werden. !
Maisquellwasser enthält und einen pH-Wert von 7,0 hat. ; Der Inhalt der beiden Kolben wird 24 Stunden bei 28°C , in hin- und hergehender Schüttelkultur bebrütet, wobei
etwa 1 1 Kulturmedium erhalten wird. Dieses Kulturmedium : wird in einen 50 1-Tank überführt, der 30 1 eines flüs- ι sigen Nährmediums enthält, das 0,2% Maisquellwasser,
0,1% Ammoniumnitrat, 0,2% Dikaliumhydrogenphosphat, ; 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und 0,1% , Polyoxyäthylen-Lanolin-Derivat ("NIKKOL TW-20") enthält
und einen pH-Wert von 7,0 hat. Gleichzeitig wird Calciumcis-epoxysuccinat in einer als freie Säure gerechneten
Menge von 6 kg zugesetzt. Das Gemisch wird bei 300C bebrütet. Nach 19 Stunden vom Beginn der Kultivierung wer- ·" den weitere 6 kg Calcium-cis-epoxysuccinat (gerechnet als j freie Säure) zugesetzt und weiter bebrütet, bis insgesamt 48 Stunden vom Beginn der Kultivierung vergangen
sind. Das erhaltene Kulturmedium wird wie folgt aufge- ; arbeitet: 40 1 Kulturmedium werden mit der Filterpresse ; filtriert. Der feste Anteil wird mit Wasser gespült und : in 30 Uasser suspendiert. Die Suspension wird gut gerührt und dann zum Absitzen der festen.Bestandteile \ stehen gelassen. 20 1 Überstand werden verworfen. Nach
Zusatz von 20 1 Wasser wird die Suspension gut gerührt | und dann mit der Filterpresse filtriert, wobei 15,9 kg
kristallines Calcium-L(+)-tartrat (gerechnet als Anhydrid) mit einer Reinheit von 98% erhalten werden. !
In einem Vergleichsversuch wird der gleiche Stamm KB-97 : verwendet. Die Kultivierung und Reaktion werden unter j
den gleichen, vorstehend beschriebenen Bedingungen durch-
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geführt mit dem einzigen Unterschied, daß kein oberflächenaktives
Mittel dem Nährmedium zugesetzt wird.
Etwa 40/des erhaltenen Kulturmediums werden in der oben i
beschriebenen Weise gereinigt. Die Prüfung durch Dünn- ' schichtchromatographie (durchgeführt auf die in Beispiele
beschriebene Weise) bestätigt, daß restliches Calcium- ;
cis-epoxysuccinat im Kulturmedium vorhanden ist. Die '
quantitative Bestimmung der L(+)-Weinsäure auf die in \
Beispiel 6 beschriebene Weise ergibt, daß die Ausbeute ι
an Calcium-L(+)-tartrat 12,3 kg (als Anhydrid) beträgt. :
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Claims (5)
- Patentansprüche ;[ 1)/Verfahren zur Herstellung von Weinsäure durch mikro- j — biologische Hydrolyse von Epoxybernsteinsäure,, dadurch gekennzeichnet, daß man Calcium—eis—epoxysticci— '■ nat als Ausgangsmaterial dem Nährmedium zusetzt, einen
Mikroorganismus, der cis-Epoxybernsteinsäure zu ' L(+)—Weinsäure zu hydrolysieren vermag, bebrötet und J hierdurch das Calcium_cis-epoxysuccinat in Calcium- , L(+)-tartrat umwandelt. . · - 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ; man das Calcium-cis-epoxysuccinat im Medium in einer ! Menge von nicht weniger als 5% (Gew./Vol.), Vorzugs- | weise von nicht weniger als 30% (Gew./Vol.) des Mediums verwendet. '
- 3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich- ; net, daß man dem Kulturmedium eine nichtionogene ober-; flächenaktive Verbindung zusetzt.
- 4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- , net, daß man als oberflächenaktive Verbindung einen · Sorbitanfettsäureester, einen Polyoxyäthylensorbitan- ! fettsäureester, einen Polyoxyäthylenfettsäureester, ; einen Polyoxyäthylen—(höher)-alkoholäther, einen Poly- ; oxyäthylenalkylaryläther, einen Glyeerinfettsäureester,1 einen Alkylenglykolfettsäureester,~7ein Kondensationsprodukt von Polyoxyäthylen, Alkylphenol und Formalde- ; hyd, ein Polyoxyäthylenalkylamin oder -amid, ein j Polyoxyäthylen—Lanolin-Derivat, ein Polyoxyäthylen-Lanolin-Alkoholderivat, ein Polyoxyäthylen-Sorbit-Bienenwachs-Derivat, ein Polyoxyäthylen-Rizinusöl- \ Derivat, ein Polyoxyäthylenpolyol, Polyoxypropylenpolyol, Polyoxyäthylenoxypropylenpolyol, Polyoxyäthylen-_tetrahydrofurfurylaikohol und/oder einen Polyoxypropy- ' ein Polyoxypropylenpolyoxyäthylenalkyläther, !609832/Q931lenfettsäureester verwendet.
- 5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die nichtionogene oberflächenaktive Verbindung in einer Menge von 0,05 bis 5,0% (Gew./ · Vol.) verwendet.609832/0931
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| JP5495775A JPS51130590A (en) | 1975-05-07 | 1975-05-07 | Process for preparing l-(+)-tartaric acid |
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