DE2445581B2

DE2445581B2 - Verfahren zur herstellung von d-gluconsaeure-delta-lactam

Info

Publication number: DE2445581B2
Application number: DE19742445581
Authority: DE
Inventors: Tomizo Yokohama Tsuruoka Takashi Kawasaki Shomura Takashi Inouye Shigeharu Yokohama Saito Kazuo Fujisawa Nnda Taro Yokohama Kanagawa Niwa (Japan)
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1973-09-25
Filing date: 1974-09-24
Publication date: 1977-08-25
Also published as: FR2244762A1; GB1482127A; DE2445581C3; US3956337A; FR2244762B1; DE2445581A1; CA1027888A; JPS5058287A; JPS5317677B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-d-lactam. D-Gluconsäure-d-lactam wird durch Oxydation von Nojirimycin mit reinen oder rohen Enzymen, die Glucose oxydieren, oder durch Einwirkung von Mikroorganismen, die fähig sind, Glucose oxydierende Enzyme zu bilden, hergestellt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-o-lactam der Formel CoH 11NO5

	CH₂OH	-NH \
H I/		h/
K HO	\0H	OH
	I H

35

aus Nojirimycin. Nojirimycin ist eine antibiotische Verbindung, die aus einem Kulturmedium von bestimmten Species von Streptomyces (vgl. T. N i i d a et al, J. Antibiotics, Ser. A 20, 62 [1967]) erhalten wird; die chemische Struktur wurde als 5-Amino-5-deoxy-D-glucopyranose bestimmt (vgl. S. I η ο u y e et al., Tetrahedron, 24, 2125 [1968]). D-Gluconsäure-o-lactam dient nicht nur als konkurrenzfähiger Inhibitor für 0-Glucosidase (vgl. Agricultural and Biological Chemistry, 34,966 [1970]), sondern auch als Zwischenprodukt, das für die Synthese von verschiedenen Arten biologisch und physiologisch aktiver Substanzen wertvoll ist (vgl. japanische Patentanmeldungen 78 378/1973 und 76 577/ 1973).

Die chemische Oxydation von Nojirimycin zu D-Gluconsäure-o-lactam wurde bislang nach einem Verfahren durchgeführt, bei dem als Oxydationsmittel Hypojodsäure (vgl. Tetrahedron, 24, 2125 [1968]) und Hypobromsäure verwendet wurden. Wird dieses Verfahren jedoch in industriellem Maßstab für die Herstellung von D-Gluconsäure-o-lactam durchgeführt, so ist es erforderlich, große Mengen an Jod oder Brom zu handhaben, was für den Menschen gefährlich ist, außerdem verursacht dieses Handhaben ernste Umweltverschmutzungsprobleme.

Die Anmelderin hat nun überraschenderweise gefunden, daß das D-Gluconsäure-o-lactam leicht durch enzymatische Umsetzung von Nojirimycin mit Glucose oxydierenden Enzymen oder Mikroorganismen, die Glucose oxydierende Enzyme bilden, erhalten wird.

Obgleich man angenommen hat, daß Nojirimycin als Inhibitor für Glucoseoxydase wirkt, da eine enge Ähnlichkeit zwischen Nojirimycin und Glucose in der Molekülstruktur besteht, wird Nojirimycin im Gegensatz zu den Erwartungen als Substrat von Glucoseoxydase zu D-Gluconsäure-o-lactam oxydiert.

Als Glucose oxydierende Enzyme sind Glucoseoxydase und Glucosedehydrogenase bekannt. Die erstere findet sich beispielsweise in einer im Handel erhältlichen rohen Enzympräparation (hergestellt von Nagase Sangyo Co, Japan), die aus einer Kulturbrühe aus Penicillium amagasakiensis extrahiert wird; in einer Glucoseoxydasepräparation (hergestellt von Miles Laboratory), die aus Aspergillus niger extrahiert wird; in einem rohen Enzym, welches durch Extraktion von Penicillium notatuin erhalten wird. Nojirimycin kann überraschenderweise durch enzymatische Reaktion von allen diesen Glucose oxydierenden Enzymen oxydiert werden, wobei D-Gluconsäure-o-lactam erhalten wird.

Überraschenderweise wurde außerdem gefunden, daß Nojirimycin durch Verwendung von Mikroorganismenzellen oxydiert werden kann, die eine Fähigkeit besitzen, Glucose oxydierende Enzyme zu bilden, wobei D-Gluconsäure-ö-lactam in hoher Ausbeute erhalten wird. Typische Mikroorganismen, die fähig sind, ein Glucose oxydierendes Enzym zu bilden, sind solche, die bei der Gluconsäurefermentation verwendet werden. In diesem Fall ist das Enzym, welches an der Oxydationsreaktion teilnimmt, Glucosedehydrogenase. Es ist gut bekannt, daß Mikroorganismen, die Gluconsäure fermentieren, in,Fungi und Bakterien vielfach vorkommen, wobei die ersteren beispielsweise Pilzfungi wie Aspergillus, Penicillium und Rhizopus und die letzteren Acetobacter, Gluconobacter und Pseudornonas sein können.

Um Nojirimycin durch die Verwendung solcher Mikroorganismen zu oxydieren, ist es erforderlich, die Mikroorganismen in üblicherweise verwendetem Kulturmedium zu kultivieren, welches Zucker, Proteine, Aminosäuren und organische Salze enthält. Bevorzugte Kulturmedien sind solche, die Glucose-Bouillon, Natriumglutamat und anorganische Salze enthalten. Die Kulturtemperatur sollte im Bereich von 20 bis 37° C liegen und die Kulturzeit sollte, obgleich sie abhängig von dem Kulturverfahren einschließlich der Belüftung, des Schütteins und der Oberflächenkulturen variiert, bevorzugt im Bereich von 20 bis 70 Stunden liegen.

Die geernteten Mikroorganismen werden von der Kulturbrühe abgetrennt und anschließend bevorzugt mit einer anorganischen oder organischen Pufferlösung gewaschen. Nojirimycin wird bevorzugt bei der praktischen Anwendung in einer geeigneten Pufferlösung, die neutral oder schwach alkalisch ist, in einer Konzentration von 2 bis 20% gelöst. Die Zellenmenge, die zu der Nojirimycinlösung zugegeben wird, ist üblicherweise eine Menge, ausgedrückt durch das feuchte Gewicht von V2 bis 1, bezogen auf das Gewicht des Nojirimycins, damit die Oxydationsreaktion mit relativ hoher Geschwindigkeit abläuft. Die Oxydationsreaktion wird bevorzugt bei einer Temperatur von 20 bis 40° C unter Schütteln oder Rühren durchgeführt. Die Umsetzung kann in einer Zeit von 1 bis 24 Stunden beendigt sein. Die geernteten Zellen können entweder in feuchter Form oder in gewaschener Form oder in trockener oder gefrorener und getrockneter Form verwendet werden. Die Zellen können auch wieder verwendet werden, indem man sie aus dem Reaktionssystem nach Beendigung der Umsetzung abtrennt.

Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dein die Bakterien oder Fungizellen für die Umwandlung von

Nojirimycin in D-Gluconsäure-o-lactam verwendet werden, kann genau so allgemein durchgeführt werden, wie das Verfahren, bei dem Glucose oxydierende Enzyme oder rohe Enzympräparationen, die Glucose oxydierende Enzyme enthalten, für die Oxydation von Nojirimycin zu D-Gluconsäure-o-lactam verwendet werden. Das heißt, eine wäßrige Lösung aus Nojirimycin wird zu einem Glucose oxydierenden Enzym oder einer rohen Präparation davon gegeben, während man bei einem pH-Wert von 5 bis 8 unter Luft-Strömungsbedingungen rührt. Die Reaktionstemperatur liegt allgemein im Bereich von Zimmertemperatur bis ungefähr 60⁰C, bevorzugt bei 30 bis 40⁰C. Obgleich die Reaktionszeit mit den verwendeten Reaktionstemperaturen variieren kann, ist die Umsetzung im allgemeinen in einer Zeit von 10 bis 80 Stunden beendigt.

In jedem Fall wird die Reaktionslösung dann der Zentrifugentrennung unterworfen, um Zellen und Mycelia daraus abzutrennen, und das Filtrat wird dann durch eine Säule geleitet, die mit einem stark sauren Ionenaustauschharz gefüllt ist, um nichtumgesetztes Nojirimycin zu entfernen. Anschließend wird die durchgelaufene Lösung mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert.

Wenn die Oxydationsreaktion mit hoher Leistung bzw. Ausbeute abläuft, wird die neutralisierte Lösung, so wie sie ist, einer Konzentrationsbehandlung unterworfen, um D-Gluconsäure-o-lactam in Form von Kristallen zu erhalten. Wenn die neutralisierte Lösung jedoch einige Verunreinigungen enthält, wird sie chromatographisch oder durch andere Maßnahmen gereinigt und anschließend konzentriert, wobei man das Lactam in Form von Kristallen erhält. Gewünschtenfalls können die Kristalle durch Umkristallisation unter Verwendung eines Wasser-Alkohol-Systems weiter gereinigt werden. Die Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren liegt 10 bis 20% höher als bei dem bekannten chemischen Oxydationsverfahren.

D-Gluconsäure-ö-lactam ist ein Zwischenprodukt für die Synthese von ß-Glucuronicase-Inhibitor, D-Glucaro-ö-lactam,

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

100 ml eines sterilen, 2%igen Kyokuto-Bouillonkulturmediums in einem 500-mI-Sakaguchi-Kolben wurden mit Pseudomonas ovalis IFO 12051 inokuliert. Man kultivierte bei 28⁰C 42 Stunden, während der Kolben mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung geschüttelt wurde. Die geernteten Zellen wurden dann aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren isoliert und in 50 ml m/20 Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) dispergiert und anschließend wurde zentrifugiert, wobei man gewaschene Zellen erhielt.

0,9 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Zellen wurden zu 50 ml einer 2%igen Nojirimycin-Phosphatpufferlösung (m/20) bei einem pH-Wert von 7,5 gegeben und dann wurde bei 28⁰C 3,5 Stunden umgesetzt, während die Reaktionsmischung mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung geschüttelt wurde. Anschließend erfolgte eine Zentrifugentrennung. Die entstehende überstehende Lösung wurde durch eine 15-ml-Säule, die mit einem stark sauren Ionenaustauschharz gefüllt war, geleitet und anschließend wurde unter Verwendung eines basischen lonenaustauschharzes neutralisiert. Die so neutralisierte Flüssigkeit wurde auf ungefähr 5 ml bei vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde in eine 85-ml-Aktivkohlesäule gegeben und mit Wasser entwickelt. Jeweils 5 ml der eluierten Fraktionen wurden der Papierchromatographie unterworfen (wobei die Entwicklung durch ein aufsteigendes

Verfahren unter Verwendung von Toyo-Filterpapier Nr. 50 — Toyo Roshi Co., Japan, erfolgte und man eine Mischung aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser in einein Verhältnis von 3:1:1 verwendete). Der Rf-Wert von D-Gluconsäure-o-lactam wurde zu 0,3 bestimmt

ίο und das Material wurde als D-Gluconsäure-o-lactam identifiziert, Fp. 203 bis 205⁰C, [<x]o= +63°. Die so identifizierten Fraktionen wurden bei vermindertem Druck eingeengt, wobei man 430 mg Kristalle erhielt.

Beispiel 2

Ein steriles Kulturmedium mit einem pH-Wert von 6,8, welches 0,2% Natriumglutamat, 0,2% K₂HPO₄, 0,01% MgCl₂, 0,001% FeSO₄, 2% Saccharose, 0,5% Pepton und 0,2% Hefaextrakt enthielt, wurde mit einer Platinschleife mit Gluconobacter suboxidans IAM 1829 inokuliert. Man kultivierte bei 28°C während 42 Stunden in einer Rohrschüttelvorrichtung. Zehn Kulturmedien (100 ml) der gleichen Zusammensetzung, wie oben erwähnt, wurden mit den so erhaltenen kultivierten Zellen in einer Menge von 1 ml inokuliert. Das Kulturmedium war sterilisiert, man arbeitete in 500-ml-Sakaguchi-Kolben. Die so inokulierten Zellen wurden bei 28° C 43 Stunden unter Verwendung einer Reziprok-Schüttelvorrichtung kultiviert, anschließend wurde mittels Zentrifugieren getrennt und dann mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen, wobei man 5_:5 g (Feuchtgewicht) gewaschene Zellen erhielt.

5 ml einer 2%igen Nojirimycinlösung (mit einem pH-Wert von 7,5 und einer Konzentration von m/20, hergestellt unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung) wurden in je fünf Sakaguchi-Kolben gegeben. Dazu gab man jeweils 0,9 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Zellen für die Umsetzung mit dem Nojirimycin. Man schüttelte bei 28° C 3 Stunden mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung. Die entstehende Reaktionslösung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch eine Säule aus einem stark sauren Ionenaustauschharz gewaschen. Anschließend wurde mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert. Die so neutralisierte Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert und im Vakuum getrocknet, wobei man 3,76 g kristallines D-Gluconsäure-o-lactam erhielt.

Beispiel 3

Aspergillus niger IAM 2094, Rhizopus delemer IAM 6015 und Gluconobacter suboxidans ATCC Nr. 621 wurden nacheinander mit Nojirimycin entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 umgesetzt, wobei man das Kulturmedium von Beispiel 1 und 1 g Nojirimycin verwendete. Die Ausbeuten an D-Gluconsäure-ö-lactam sind in Tabelle I angegeben.
Tabelle I
Oxydation von Nojirimycin durch Zellen von bestimmten Fungi- und Bakterienspecies.

Menge Konz. a, Ausbeute an
der Nojirimy- D-Gluconsäure-Zellen ein o-lactarn

S ο ⁰L "L

β /0 /0

Aspergillus niger
IAM 2094

1,1 2,0

12,4

-f

Fortsetzung

	Menge der Zellen	Konz, a. Nojirimy cin	Ausbeute an D-Gluconsäurc- (5-lactiim
	B	%	%
Rhizopus delemer IAM 6015	1,0	2,0	33,3
Gluconobacter suboxidans ATCC Nr. 621	0,9	4,0	57,2
dto., wieder verwendet	0,8	2,0	22,0
Gefrorene und getrocknete Zellen von Gluconobacter suboxidans ATCCNr. 621	0,2	2,0	49,1

Beispiel 4

300 g Nojirimycin werden in 1,5 1 destilliertem Wasser gelöst; dazu gibt man 80 g eines rohen Enzympräparates (aus Glucoseoxydase mit 10 000 E/mg (E = Einheiten), hergestellt durch Penicillium amagasakiensis). Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird auf 6,0 eingestellt, und dann wird die Umsetzung bei 3O⁰C in einem 30-1-Flaschenfermentor unter Rühren (bei 300 U/min) unter Luft-Strömungsbedingungen durchgeführt, 65 Stunden nach der Umsetzung wurde die Reaktionslösung durch eine Säule, die mit 1,5 I eines stark sauren Ionenaustauschharzes gefüllt war, geleitet. Die Säule wurde mit 7 1 Wasser gewaschen. Die so durchgeleitete Lösung und die Waschlösungen wurden zusammen vereinigt (22 I) und dann wurde mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert. Anschließend erfolgte eine Entfärbungsbehandlung unter Verwendung von 50 g Kohlepulver. Die so entfärbte Lösung wurde, so wie sie war, konzentriert. Zu der so konzentrierten Lösung (500 ml) fügte man 100 ml Methanol, dann wurde gekühlt, wobei man Kristalle erhielt. Die Kristalle ίο wurden abfiltriert. Man erhielt 220 g D-Gluconsäure-olactam in Form von nadelartigen, farblosen Kristallen (Ausbeute 77%).

Beispiel 5

301 eines flüssigen Kulturmediums (pH-Wert eingestellt auf 7,0), welches 2,0% Stärke, 2,5% Sojabohnenpulver, 1,0% Weizenkeime, 0,5% Pepton und 0,25% Natriumchlorid enthielt, wurde unter Verwendung eines Flaschenfermentors mit Penicillium notatum IFO 4640 inokuliert. Man kultivierte bei 28°C während 72 Stunden, während man unter Luft-Strömungsbedingungen rührte. Nach dem Kultivieren wurde die Lösung filtriert, wobei man 151 Filtrat erhielt. Zu dem Filtrat fügte man 2 Volumina gekühltes Aceton und dann wurde die Reaktionsmischung bei 5° C stehengelassen. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Der so abgetrennte Niederschlag wurde in 500 ml Wasser gelöst, dann wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Zu der überstehenden Lösung fügte man 10 g Nojirimycin und setzte bei 35°C während 5 Stunden unter Rühren um. Die Reaktionslösung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben, behandelt, wobei man 3,2 g nadelartige, farblose Kristalle aus D-Gluconsäure-o-lactam erhielt (Ausbeute 32%).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-olactam durch Oxydation von Nojirimycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Nojirimycin (5-Amino-5-deoxy-D-glucose) der Einwirkung eines Glucose oxydierenden Enzyms oder eines Mikroorganismus, der fähig ist, ein Glucose oxydierendes Enzym zu bilden, bei pH-Werten von 5 bis 8 und einer Temperatur zwischen Zimmertemperatur und ungefähr 60°C aussetzt.