DE3739017C2

DE3739017C2 - Mycobacterium-roseum sp. nov. NCAIM B(P) 000339 und Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 9alpha-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on)

Info

Publication number: DE3739017C2
Application number: DE3739017A
Authority: DE
Inventors: Geb Bokany Jekkel; Karoly Albrecht; Gabor Dr Ambrus; Tibor Dr Lang; Istvan Mihaly Dr Szabo; Eva Ilkoey; Eva Csajagi; Kalman Koenczoel; Imre Moravcsik; Gabor Hantos; Emulia Simonovits; Geb Szemenyei Lengyel; Zsuzsanna Vida
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1986-11-18
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1996-06-20
Anticipated expiration: 2007-11-18
Also published as: DE3739017A1; IT8767940A0; US5004695A; JPS6485099A; GB2197869A; GB8726949D0; HUT46077A; AT396480B; NL8702758A; ATA304487A; IT1218692B; GB2197869B; HU196627B

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Mycobacterium- Mikroorganismenstamm und ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17- di-(on) aus natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprunges oder aus einem Gemisch derselben durch deren mikrobiologischen Seitenkettenabbau unter Verwendung des ersteren.

9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) ist ein wichtiges Ausgangsmaterial für die Synthese von Cortico steroid-Arzneimitteln (V. Van Rheenen, K. P. Shephard: J. Org. Chem. 44 [1979], 1 582).

Im Patentschrifttum sind Verfahren zur Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) durch mikro biologisches Hydroxylieren von Steroiden mit Androstan skelett bekannt. Das Hydroxylieren von 4-Androsten- 3,17-di-(on) mit Nocardia corallina (britische Patent schrift 8 62 701) und Nocardia canicruria (US-Patent schrift 43 97 947) - beide von der Nocardia-Gattung - oder mit Cornynebacterium equi (japanische Offenlegungs schrift 79-14 79 98), welches der Corynebacterium-Gattung angehört, ergibt 9α-(Hycroxy)-4-androsten-3,17-di-(on).

Ein Pilz Corynespora cassicola aus der Caliciales- Gattung hydroxyliert 4-Androsten-3,17-di-(on) in der 9α-Stellung (japanische Offenlegungsschrift 80-7 78 97), während Circinella muscae der Mucorales-Gattung Testo steron in 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) umwandelt (P. G. Rao: Indian J. Chem. 1 [1963], 314).

Seit kurzem wird 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) durch die mikrobiologische Umwandlung von Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs hergestellt. Gemäß dem Patentschrifttum wird diese mit folgenden Mikroorganismen durchgeführt: Mycobacterium fortuitum (US-Patentschriften 41 75 006 und 40 35 236), Mycobacterium parafortuitum (japanische Offenlegungsschrift 80-13 83 95) und Mycobacterium vaccae (japanische Offenlegungsschriften 80-08 53 97 und 82-08 97).

Sterine, besonders diejenigen pflanzlichen Ursprunges, wie β-Sitosterin und Campesterin, sind mit geringem Aufwand verbundene leicht zugängliche Ausgangsstoffe. So stell die Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) durch Abbau von natürlichen Sterinen einen technisch und wirtschaftlich vorteilhaften Weg dar.

Während der technischen beziehungsweise industriellen Durchführung dieses Verfahrenstyps für den Seitenkettenabbau von Sterinen wurde aber festgestellt, daß die Gärung ziemlich verzögert ist und die Ausbeuten an 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) viel zu niedrig sind.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Mycobacterium-Mikroorganismenstamm, durch dessen Verwendung die mikrobiologische Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten- 3,17-di-(on) aus natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprunges oder aus einem Gemisch derselben schnell und mit höheren Ausbeuten durchgeführt werden kann, zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Während eigener Untersuchungen wurden aus verschiedenen Erdproben nach dem Verfahren von G. E. Peterson und Mitarbeitern (J. Lipid Research 3 [1962], 275) Sitosterin abbauende Mikroorganismen isoliert. Aus diesen an Sterinen wachsenden Mikroorganismen wurde ein Mycobacterium- Stamm selektiert und seine Mutanten wurden mit einer von der Anmelderin früher entwickelten mutagenen Behandlung von Sphaeroplasten hergestellt. Gemäß diesem Verfahren wurde der selektierte Stamm in einer Glycin und Vancomycin enthaltenden Nährlösung gezüchtet, dann wurde die Zellwand des Mikroorganismus durch Lysozymbehandlung aufgelöst und die erhaltene Sphaeroplaste und/oder Protoplaste wurden in einem Rohrzucker osmotisch stabilisierten Medium mit N-(Methyl)-N′-(nitro)-N- (nitroso)-guanidin behandelt. Nach dieser mutagenen Behandlung wurden die Sphaeroplaste und/oder Protoplaste in osmotisch stabilisiertem, festen Agarmedium bei einer Temperatur, die optimal für den Wuchs des Mikroorganismus ist, zur Regenerierung der Zellwand bebrütet.

Aus den regenerierten Baktereinkolonien wurden diejenigen Mutanten, welche die Sterinseitenkette abspalten und gleichzeitig mit hoher Ausbeute Steroide mit Androstan- Skelett anreichern konnten, selektiert. Für Selektions zwecke wurden die obigen Kolonien auf natürliche Sterine, wie Sitosterin und/oder Cholesterin, beziehungsweise 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) enthaltendes Agarminimalmedium, beziehungsweise ferner Glycerin als Kohlenstoffquelle enthaltenden Agarnährboden geimpft. Diejenigen Stämme, welche in Nährböden, die Glycerin beziehungsweise natürliche Sterine enthalten, gut wuchsen, dagegen in 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) enthaltende Medien überhaupt nicht wachsen konnten, wurden selektiert.

14 000 Isolate wurden auf ihre Fähigkeit, Sterine abbauen zu können, mit diesem Verfahren geprüft. Diejenigen Stämme, welche keine 1,2-Steroiddehydrogenase-Aktivität besaßen und größere Mengen von 9α-(Hydroxy)-4-androsten- 3,17-di-(on) mittels Abbaues von natürlichen Sterinen anreichern konnten, wurden isoliert, und derjenige Stamm, welcher die größte Ausbeute an 9α-(Hydroxy)-4-androsten- 3,17-di-(on) ergab, wurde selektiert. Während der taxonomischen Identifizierung konnte dieser Stamm in keine bekannte Mycobacterienart eingestuft werden, er wurde als eine neue Species innerhalb dieser Gattung erkannt. Die Hauptmerkmale der neuen Species, die während der taxono mischen Vergleichsprüfung mit bekannten, Sterine umsetzenden Bakterien verglichen wurden, sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt. Der neue Stamm wurde Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 genannt.

Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 ist ein neues Taxon der Mycobacterium-Gattung, der aus Speciesniveau differenziert werden kann. Dieser Organismus, der bei 45°C sich nicht mehr vermehrt, unterscheidet sich merklich von Mycobacterium phlei, das auch noch bei 52°C aktiv bleibt, Citrat und Succinat als Kohlenstoffquelle verwertet, Säure aus Arabinose, Galaktose und Mannit bildet und tiefgelbe und orangefarbene Kolonien bildet, und auch von Mycobacterium smegmatis, das ähnlich wie Mycobacterium phlei, auch an Citrat und Succinat und ferner an Oxalat und Benzoat wachsen kann, was Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 nicht vermag; ferner bildet Mycobacterium smegmatis im Gegensatz zu Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 an nahezu allen diagnostischen Kohlenstoffquellen, wie Arabinose, Galaktose, Sorbit, Mannit, Inosit und Fructose, Säure; es kann eine 4stündige Hitzebehandlung bei 60°C nicht überleben und bildet keine Pigmente. Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 kann auch von Mycobacterium fortuitum unterschieden werden, da dieses immer farblose Kolonien hat und bei niedriger Temperatur nicht wachsen kann. Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 ist ein schnell wachsendes Mycobacterium mit charakte ristischer roter Pigmentation, ist psychrophil (kältebeständig) und kann sich selbst bei 6°C in Form von reifen roten Kolonien vermehren, während die Stämme von Mycobacterium fortuitum schon bei 17°C gehemmt werden. Die 100%ige, tiefrote Endopigmentation der Kolonien und Kulturen von Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 ist von höchster taxonomischer Bedeutung, da von Good (1985) bei der Reihenuntersuchung einer großen Zahl, und zwar von mehr als 500 Stämmen von Mycobacterium fortuitum, kein einziger mit Pigmentation gefunden wurde und so von ihm Mycobacterium fortuitum als pigmentfrei und nicht-photo chromogen gewertet wurde. Es ist auch ein wichtiger Unterschied, daß die Stämme Mycobacterium fortuitum an MacConkey-Agar gut wachsen, während Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 dies nicht einmal in Spuren vermag. Weiterhin besteht auch ein großer Unterschied in der Wärmebeständigkeit. Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 ist nicht nur kältebeständig, sondern auch wärmebeständig. Die ganze Population vermag eine 4stündige Wärmebehandlung bei 60°C zu überleben, während dieselbe Behandlung die ganze Zellenmasse von Mycobacterium fortuitum zerstört. Bei Verwendung von Xylose als Kohlenstoffquelle, die kein Substrat für die Säurebildung bei Mycobacterium fortuitum ist, vermag Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 mit einer bestimmten Variabilität Säure zu bilden, das heißt, daß die Säureerzeugungsrate des Stammes für Monate hoch und für andere Monate wieder niedrig ist. Schließlich können die meist gelben, photo- und skoto chromogenen Stämme von Mycobacterium vaccae und Mycobacterium parafortuitum, die gemäß Schrifttumsangaben taxonomisch als identisch anzusehen sind, von Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 dadurch unterschieden werden, daß sie Citrat und Succinat als Kohlenstoffquelle verwerten, keine Wärmebeständigkeit bei 60°C haben und Säure aus Inosit und Mannit erzeugen.

Auf Grund der obigen diagnostischen Merkmale ist Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 als ein Vertreter der neuen, schnell wachsenden Mycobacterienspecies anzusehen. Dieser Stamm ist als "typischer Stamm" anzusehen und die neue Species wird "roseum" genannt (Mycobacterium roseum sp. nov.) Das Adjektiv roseum weist auf die charak teristische rosa bis tiefrote Farbe der Species hin.

Die taxonomische Vergleichsuntersuchung der neuen Species und der bekannten Mycobacterienspecies wurde auf Grund des folgenden Schrifttums ausgeführt: H. C. Good; Ann. Rev. Microbiol. 39 [1985], 347 bis 369 und Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, The William-Wilkins Company, Baltimore, 1975.

Die taxonomischen Merkmale von Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Taxonomie von Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339
N = negativ P = positiv (P) = schwach positiv
Gelatine-Hydrolyse
N
Stärke-Hydrolyse	N
Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat-Hydrolyse (Tween-40-Hydrolyse)	P
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat-Hydrolyse (Tween-80-Hydrolyse)	P
Phosphatase-Aktivität	P
Katalase-Aktivität	P
Oxydase-Aktivität	P
Urease-Aktivität	P
Ammoniakbildung aus Nitrat	N
Nitritbildung aus Nitrat	P
Adeninabbau	P
Äsculinabbau	P
Hypoxanthinabbau	N
Xanthinabbau	N
Ausflösung von Tyrosin	N

Verbrauch als einzige Kohlenstoffquelle
Adonit
N
Arabinose	N
Dulcit	N
Fructose	P
Galaktose	N
Glycerin	P
Glucose	P
Inosit	N
Stärke	N
Lactose	N
Maltose	N
Mannit	N
Mannose	P
Mucinsäure	N
Raffinose	N
Rhamnose	N
Xylose	N
Calciumlactat	P
Natriumacetat	N
Natriumbenzoat	N
Natriumcitrat	N
Natriumgluconat	N
Natriummalonat	N
Natriumoxalat	N
Natriumpyruvat	N
Natriumsalicylat	N
Natriumsuccinat	N

Verbrauch als einzige Stickstoffquelle
Ammoniumphosphat
P
Ammoniumcarbonat	P
Ammoniumchlorid	N
Ammoniumnitrat	P
Ammoniumsulfat	P
Calciumnitrat	P
Kaliumnitrat	P

Säurebildung aus
Adonit
P
Arabinose	N
Dextrin	N
Dulcit	N
Fructose	P
Galaktose	N
Glycerin	P
Glucose	P
Inosit	N
Inulin	N
Stärke	N
Lactose	N
Mannit	N
Mannose	P
Melecitose	N
Raffinose	N
Saccharose	P
Salicin	(P)
Sorbit	P
Sorbose	N
Trehalose	P
Xylose	P (variabel)

Wuchs an
2 Gew.-% Natriumchlorid
P
4 Gew.-% Natriumchlorid	P
6 Gew.-% Natriumchlorid	P
10 Gew.-% Natriumchlorid	N
MacConkey-Agar	N
Wuchs bei 6°C	P
Wärmebeständigkeit: 60°C/4 Stunden	P

Gegenstand der Erfindung ist daher der Mycobacterium- Mikroorganismenstamm Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339, hinterlegt am 1. Juni 1986 in der Ungarischen Nationalen Sammlung von Landwirtschaftlichen und Industriellen Mikroorganismen (MIMNG), Budapest, Ungarn unter der Zugriffnummer NCAIM B (P) 000339.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten- 3,17-di-(on) aus natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprunges oder aus einem Gemisch derselben durch aerobes, submerses Gären eines enzymdefekten, Sterin abbauenden Mikroorganismus in einem Kohlen stoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium und Isolieren des entstandenen Produktes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Gären des für den Seitenkettenabbau vorgesehenen Sterines oder Steringemisches durch Züchten der Kultur des erfindungs gemäßen Mycobacterium-Mikroorganismenstammes durchgeführt wird.

Vorteilhaft wird als Sterine natürlichen Ursprunges ein Gemisch von β-Sitosterin und Campesterin im Gewichtsverhältnis von 2 : 1 verwendet.

Der Stamm Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 ist wegen seines Mangels an 1,2-Steroiddehydrogenase-Aktivität und kräftigen Wuchses für die Gärung besonders gut geeignet.

Es ist auch günstig, daß das Nährmedium keine mit hohem Aufwand verbundene Ingredienzien erfordert. So kann dieser Stamm außer Stickstoffquellen natürlichen Ursprunges, wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Maisquellenwasser, Casein hydrolysat und Hefeextrakt, auch anorganische Stickstoffquellen verwerten. Kohlenstoffquellen, die in der Gärungsindustrie üblich sind, wie Glucose, Fructose, Sac charose (Rohrzucker), Melasse, Glycerin und Fette, können vorteilhaft eingesetzt werden. Der Metallionenbedarf wird durch den Metallgehalt der Nährmedienbestandteile natürlichen Ursprunges gedeckt.

Da die Sterin-Substrate den Wuchs des genannten Stammes nicht beeinflussen, können diese zusammen mit dem Nährmedium vor dem Impfen sterilisiert werden.

Es ist auch vorteilhaft, Polyoxyäthylensorbitanmono oleat im Nährmedium zu verwenden, da dieses günstigen, einheitlichen und kräftigen Wuchs sichert. Die Züchtung und biologische Umwandlung können zweckmäßig bei 28 bis 37°C, vorzugsweise 32°C, durchgeführt werden. Der Fortgang der Umwandlung kann dünnschichtchromatographisch verfolgt werden. Der Umwandlungszeitraum ist kurz, er beträgt im allgemeinen 100 bis 120 Stunden.

An Hand der Versuchsergebnisse wird aus natürlichen Sterinen durch Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) als Hauptprodukt in hohen Ausbeuten erhalten. In der Gärbrühe werden auch kleinere Mengen von Produkten mit teilweise abgebauter Seitenkette angereichert, wie 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)- 23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure-methylester, 9α-(Hydroxy)- 3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure, 9α-(Hydroxy)- 3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4,17(20)-choladien-22- säure und 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4,17(20)- choladien-22-aldehyd.

Vorteilhaft werden die Zellen des Mikroorganismus durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Die mikrobiologischen Umsetzungsprodukte, die an der Zellenmasse adsorbiert sind, können mit Alkoholen, zum Beispiel Methanol, abgelöst werden, während die in der Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Chlorkohlenwasserstoffen oder Äthylacetat, nach Ansäuern der Brühe auf einen pH-Wert von 2 extrahiert werden können.

Das Hauptprodukt, das 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17- di-(on) wird von den in kleineren Mengen anwesenden Neben produkten durch Säulenchromatographie oder präparative Dünnschichtchromatographie und nachfolgendes Kristalli sieren abgetrennt.

Die Struktur der isolierten Umsetzungsprodukte wurde mit UV-, IR-, PMR- und Massenspektrometrie aufgeklärt.

Die Erfindung wird an Hand des folgenden Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Es wurde aus 4 bis 5 Tage alten Kartoffel-Glucose- Schrägagar-Kolonien des erfindungsgemäßen Mikroorganismus Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 mit 10 ml sterilem Wasser eine Zellsuspension bereitet. Mit 5 ml dieser Suspension wurde in einem 3-l-Erlenmeyerkolben 800 ml eines sterilen UFR Inoculummediums der folgenden Zusammensetzung beimpft:

Glycerin\|8,0 g
Harnstoff	0,4 g
Sojamehl	1,6 g
Hefeextrakt	0,8 g
Ammoniumchlorid	2,4 g
Calciumcarbonat	2,4 g
Diabasisches Kaliumphosphat	0,4 g
Magnesiumsulfat/Wasser, Gewichtsverhältnis 1 : 7	0,4 g
Eisen(III)-chlorid/Wasser, Gewichtsverhältnis 1 : 6	0,4 g
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat [Tween-80]	0,4 g
In 800 ml Leitungswasser

Vor dem Sterilisieren wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und 45 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.

Der Kolben wurde 3 Tage lang bei 32°C auf einem Rotations schüttler (340 Umdrehungen/Minute, Durchmesser 3,5 cm) bebrütet. Mit dieser Vorkultur wurde dann 5 l eines 60 Minuten lang bei 121°C sterilisierten UHF-Mediums in einer 10-l-Gärvorrichtung bebrütet. Die Zusammen setzung des UHF-Mediums war wie folgt.

Glycerin\|50 g
Ammoniumchlorid	15 g
Calciumcarbonat	15 g
Sojamehl	10 g
Dibasisches Kaliumphosphat	2,5 g
Harnstoff	2,5 g
Gemisch von β-Sitosterin und Campesterin im Gewichtsverhältnis von 2 : 1	100 g
Polypropylenglykol	30 g
Polyoxyäthylensorbitanmonooleat [Tween-80]	10 g
In 5 l Leitungswasser

Vor dem Sterilisieren wurde der pH-Wert des Nährmediums auf 7 eingestellt.

Die geimpfte Kulturbrühe wurde in ein Wasserbad von 32°C eingebracht, die Gärung wurde bei einer Rührge schwindigkeit von 350 Umdrehungen/Minute zunächst mit einer Belüftung von 90 l/Stunde und dann nach abnehmendem Schäumen mit einer Belüftung von 150 l/Stunde 120 Stunden lang fortgesetzt und die aus dem Gemisch von β-Sitosterin und Campesterin im Gewichtsverhältnis von 2 : 1 umgesetzten Umsetzungsprodukte wurden isoliert.

Die Sterin-Umsetzungsprodukte in 1 l Kulturbrühe, die am Anfang 20 g rohes Sitosterin (β-Sitosterin und Campesterin im Gewichtsverhältnis von 2 : 1) enthielt, wurden wie folgt isoliert.

Die Zellenmasse der Kulturbrühe wurde abfiltriert und die darauf adsorbierten Sterin-Umsetzungsprodukte sowie die nicht umgesetzten Ausgangsstoffe wurden 3mal mit je 200 ml Methanol weggelöst. Die vereinigten Methanol- Eluate wurden unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand betrug 12 g.

Das Filtrat der Kulturbrühe wurde mit einer 2 n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Der ausgefallene Niederschlag, ein Gemisch von 9α-(Hydroxy)- 3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure und 9α-(Hydroxy)- 3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4,17(20)-choladien-22-säure wurde abfiltriert und 4 Stunden lang unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 1 g Säuregemisch. Das Filtrat wurde 2mal mit je 200 ml Äthylacetat extrahiert und die vereinigten Äthylacetat-Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand betrug 3,1 g.

Die aus der Zellenmasse und aus der angesäuerten Kultur brühe gewonnenen rohen Umsetzungsprodukte wurden vereinigt und an einer aus 250 g Kieselsäure bestehenden Säule chromatographiert. Als Entwicklungslösungen wurden Gemische von n-Heptan und Äthylacetat, die stufenweise immer größere Mengen von Äthylacetat enthielten, eingesetzt. Nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien wurden mit einem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat, das 25 Vol.-% Äthylacetat enthielt eluiert. Beim Eindampfen dieser Fraktionen wurden 1,5 g des β-Sitosterin-Campesterin Gemisches gewonnen. Das Eluieren wurde mit einem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat im Volumverhältnis von 6 : 4 fortgesetzt. Die vereinigten Fraktionen wurden unter Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde aus Aceton umkristallisiert. Ausbeute: 0,3 g 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)- 23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure-methylester mit einem Schmelzpunkt von 212 bis 216°C.

Das Eluieren mit einem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat im Volumenverhältnis von 55 : 45, Einengen der entsprechenden Fraktionen unter Vakuum und Umkristalli sieren aus Aceton ergab 0,1 g 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)- 23,24-di-(nor)-4,17(20)-choladien-22-aldehyd mit einem Schmelzpunkt von 204 bis 209°C.

Das weitere Eluieren mit einem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat im Volumenverhältnis von 45 : 55, Einengen der entsprechenden Fraktionen unter Vakuum und Umkristallisieren des Rückstandes aus Methanol ergab 5,7 g 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on), mit einem Schmelzpunkt von 219 bis 221°C und einem[α]_D-Wert von +180° (c = 1, Chloroform).

Das Eluieren mit einem weiteren n-Heptan-Äthylacetat- Gemisch, und zwar einem mit einem Volumenverhältnis von 3 : 7 und Einengen der entsprechenden Fraktionen unter Vakuum ergab einen Rückstand, der aus einem Gemisch von 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure und 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4,17(20)-chola dien-22-säure bestand. Dieser Rückstand wurde mit dem nach dem Ansäuern der Kulturbrühe gewonnenen Säuregemisch vereinigt und das ganze Gemisch wurde 2mal aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 0,4 g chromatographisch reine 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)-4,17(20)-choladien- 22-säure mit einem Schmelzpunkt von 242 bis 248°C.

Das in der Mutterlauge des Umkristallisierens zurückgebliebene Gemisch von 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)- 4-cholen-22-säure und 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di- (nor)-4,17(20)-choladien-22-säure wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie in Komponenten geteilt [Adsorbens: Gemisch von Kieselgel G (Reanal, Budapest) und Kieselgel 60 HF_254-366 (Reanal, Budapest) { Gewichts verhältnis 2 : 1 }, Entwicklungslösungsmittel: Gemisch von Benzol und Aceton { Volumenverhältnis 1 : 1 }]. Ausbeute: 0,1 g chromatographisch reine 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)- 23,24-di-(nor)-4-cholen-22-säure (Schmelzpunkt: 258 bis 260°C) und 0,2 g 9α-(Hydroxy)-3-(oxo)-23,24-di-(nor)- 4,17(20)-choladien-22-säure.

Claims

1. Mycobacterium roseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339.

2. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 9α-(Hydroxy)-4-androsten-3,17-di-(on) aus natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprunges oder aus einem Gemisch derselben durch aerobes, submerses Gären eines enzymdefekten, Sterin abbauenden Mikroorganismus in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium und Isolieren des entstandenen Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gären des für den Seitenkettenabbau vor gesehenen Sterines oder Steringemisches durch Züchten Mycobacteriumroseum sp. nov. NCAIM B (P) 000339 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sterine natürlichen Ursprunges ein Gemisch von β-Sitosterin und Campesterin im Gewichtsverhältnis von 2 : 1 verwendet.