CZ20021784A3 - Mikrobiální 9alfa-hydroxylace steroidů - Google Patents
Mikrobiální 9alfa-hydroxylace steroidů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021784A3 CZ20021784A3 CZ20021784A CZ20021784A CZ20021784A3 CZ 20021784 A3 CZ20021784 A3 CZ 20021784A3 CZ 20021784 A CZ20021784 A CZ 20021784A CZ 20021784 A CZ20021784 A CZ 20021784A CZ 20021784 A3 CZ20021784 A3 CZ 20021784A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- steroid
- dione
- genes
- androstene
- Prior art date
Links
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 title claims abstract description 33
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 16
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 9alpha-hydroxyandrost-4-en-3,17-dione Chemical group O=C1CC[C@]2(C)[C@@]3(O)CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 claims description 32
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 claims description 30
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 18
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 3
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 9
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 101150086911 kstD gene Proteins 0.000 description 8
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 8
- 102100034503 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 4
- 241001524101 Rhodococcus opacus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N (+)-androsta-1,4-diene-3,17-dione Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N androsta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 3
- 229940068065 phytosterols Drugs 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 241000430521 Alyssum Species 0.000 description 2
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- IDCPFAYURAQKDZ-UHFFFAOYSA-N 1-nitroguanidine Chemical compound NC(=N)N[N+]([O-])=O IDCPFAYURAQKDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001070 3-oxosteroid delta(1) dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- JCEUDJXAQHPZGL-PLOWYNNNSA-N 9alpha-hydroxyandrosta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(O)CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JCEUDJXAQHPZGL-PLOWYNNNSA-N 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 101150114125 D1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001509401 Gordonia rubripertincta Species 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000187694 Rhodococcus fascians Species 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N cortivazol Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2C[C@H]([C@]([C@@]2(C)C[C@H](O)[C@@H]1[C@@]1(C)C2)(O)C(=O)COC(C)=O)C)=C(C)C1=CC1=C2C=NN1C1=CC=CC=C1 RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy geneticky modifikovaných mikroorganismů s inhibovanou schopností degradace jádra steroidů, použití takového mikroorganismu při akumulaci steroidů stejně jako takto modifikovaných mikroorganismů.
Dosavadní stav techniky
Schopnost degradovat fytosteroly je široce rozšířená u nokardioformních aktinomycet a vyžaduje soubor enzymů degradujících postranní řetězec a strukturu steroidního jádra.
Enzym 3-ketosteroid-Á1-dehydrogenáza (KSTD) [4-en-3-oxosteroid:(akceptor)-1-en-oxidoreduktáza, EC 1.3.99.4] se účastní štěpení kruhu B steroidního jádra zavedením dvojné vazby do polohyC1-C2. Enzym se zvláště účastní konverze 4-androsten-3,17-dionu na 1,4-androstadien-3,17-dion a 9cc-hydroxy-4-androsten-3,17-dionu na 9a-hydroxy-1,4-androstadien-3,17-dion (viz obr. 1). Tento enzym byl identifikován u několika bakterií: Arthrobacter simplex (Penasse a Peyre, 1968, Rhodococcus. Crit. Rev. Biotech. 14: 29 73), Pseudomonas (Levý a Talalay, 1959, J. Biol. Chem. 234: 2009 2013; 1959, J. Biol. Chem. 234: 2014 - 2021), Nocardia restrictus (Sih a Bennet, 1962, Biochem. Biophys. Acta 56: 587 - 592), Nocardia corallina (Itagaki a další, 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038: 60 - 67), Nocardia opaca (Drobnič a další, 1993, Biochim. Biophys. Res. Comm. 190: 509 - 515), Mycobacterium fortuitum (Wovcha a další, 1979, Biochim. Biophys. Acta 574: 471 - 479) a Rhodococcus erythropoiis IMET7030 (Kaufmann a další, 1992, J. Steroid Biochem. Molec. Biol.
- 2 • * · · ·· · · · • · · 4 · · · • · 4 4 4444 • · · · · · · • 4 · · ···· ·· ·· ···
43: 297 - 301). KSTD bakterie N. opaca byla charakterizována jako flavoprotein (Lestrovaja a další, 1978, Z. Allg. Mikrobiol. 18: 189 196). Pouze geny kódující KSTD (ksřD: 3-ketosteroid-A1-Dehydrogenáza) A. simplex, Comamonas testosteroni a Rhodococcus rhodochrous byly úplně charakterizovány (Plesiat a další, 1991, J. Bacteriol. 173: 7219 - 7227; Molnár a další, 1995, Mol. Microbiol. 15: 895 - 905; Morii a další, 1998, J. Biochem. 124: 1026 - 1032).
Výlučná inhibice 1,2-dehydrogenázy steroidů způsobuje hromadění 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dionu, což je vynikající výchozí materiál pro syntézu kortikoidů (Kieslich K., 1985, J. Basic Microbiol. 25: 461 - 474). 9cc-Hydroxyandrogeny mají průmyslovou důležitost jako antiandrogeny, antiestrogeny a antifertilitní látky. Skupina 9cc-hydroxy se snadnoí dehydratuje na 9(11)-dehydrosystém a poskytuje výchozí strukturu pro výrobu 9a-halogenovaných kortikoidů.
Příslušníci rodu Rhodococcus jsou velmi dobře známí svým velkým katabolickým potenciálem (Warhurst a Fewson, 1994, Rhodococcus. Crit. Rev. Biotech. 14: 29 - 73; Bell a další, 1998, J. Appl. Microbiol. 85: 195 - 210). Několik druhů z rodu Rhodococcus je schopno degradovat přirozené fytosteroly, které jsou lacinými výchozími látkami pro výrobu biologicky aktivních steroidů (Kieslich K., 1986, Drug Res. 36: 888 - 892). Kmeny Rhodococcus a
Mycobacterium upravené působením mutagenů a/nebo inkubované s inhibitory enzymů převádějí steroly na 4-androsten-3,17-dion a 1,4androstadien-3,17-dion (Martin, 1977, Adv. Appl. Microbiol. 22: 29 58).
Ačkoli již bylo popsáno klonování genu ksťD a exprese inaktivního proteinu KSTD R. erythropolis IMET7030 v Escherichia coli (Wagner a další, 1992, J. Basic Microbiol. 32: 65 - 71; 1992, J. Basic Microbiol. 32: 269 - 277) a je dostupná nukieotidová sekvence N. opaca (Drobnič a další, 1993, Biochem. Biophys. Res. Comm. 190:
• · · · • · · • · · • · ·· » · · · ' • ·
- 3 509 - 515) (synonymum R. erythropolis IMET7030) (DDBJ/EMBL/GenBank U59422), nebyla ohlášena žádná molekulární charakterizace tohoto genu. Aktivita KSTD je nezbytná pro degradaci steroidního jádra a pro akumulaci steroidních meziproduktů je nezbytná inaktivace genu kstD.
Podstata vynálezu
Podle jednoho provední vynálezu je poskytnuta nukleotidová sekvence genu kstD R. erythropolis. Protein KSTD1 je kódován nukleotidy 820 - 2329 SEQ ID NO: 1.
Inaktivace genů je mocným nástrojem pro analýzu genové funkce a pro zavádění metabolických bloků. Přerušení genu nereplikativním vektorem nesoucím selektivní markér je běžně používanou metodou pro inaktivaci genů. Konstrukce genů s požadovanými vlastnostmi přístupy genetického inženýrství metabolických biochemických cest však může vyžadovat postupnou inaktivaci nebo náhradu několika genů. To je možné pouze v případě, kdy je dostupná vhodná strategie pro zavádění neoznačených genových delecí nebo genových náhrad, což umožňuje nekonečné množství cyklů metabolického inženýrství bez závislosti na větším počtu markérů.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje postupná inaktivace genů, s výhodou dehydrogenázových genů, které se účastní degradace steroidů. Vynález se zvláště týká inaktivace genů, které se účastní při akumulaci 9ct-hydroxy-4-androsten-3,17-dionu pěstováním mikroorganismů na 4-androsten-3,17-dionu. S výhodou je alespoň gen kstD1 inaktivován.
Neočekávaně bylo zjištěno, že přerušení genu kstD1 kódujícího 3-ketosteroid-Á1-dehydrogenázu v R. erythropolis SQ1 nevedlo
- 4 • · · k inaktivaci degradace steroidního jádra. Přítomná zbytková aktivita se zdála být závislá na přítomnosti druhého enzymu. Nyní bylo zjištěno, že pro získání kmene s úplně blokovanou degradací steroidního jádra je nezbytná inaktivace více než jednoho genu. Druhým enzymem je s výhodou dehydrogenáza, výhodněji isoenzym KSTD. Aby bylo možné přerušit nebo odstranit několik genů, může být s výhodou použito metody místně specifické mutageneze. Pro postupnou inaktivaci genů KSTD je výhodná metoda zavedení neznačených genových delecí (unmarked gene deletion). Získané geneticky modifikované geny by neobsahovaly heterologní DNA.
Podle dalšího výhodného provedení předkládaného vynálezu je inaktivován alespoň gen kstD2. Nejvýhodněji jsou inaktivovány alespoň oba geny ksřD1 a ksťD2.
Další provedení předkládaného vynálezu představuje nukleotidová sekvence genu kstD2 R. erythropolis. Protein KSTD2 je kódován nukleotidy 1 - 1678 SEQ ID NO: 5.
Nebyly dosud popsány žádné metody pro zavádění neznačených genových delecí do bakterií rodu Rhodococcus. Metody genové delece nebo náhrady genu však byly popsány u některých jiných členů actinomycetales, totiž Streptomyces (Hillemann a další, 1991, Nucleic. Acid Res. 19: 727 - 731; Hosted a Baltz, 1997, J. Bacteriol. 179: 180 186), Corynebacterium (Schafer a další, 1994, Gene 145: 69 - 73) a Mycobacterium (Marklund a další, 1995, J. Bacteriol. 177: 6100 6105; Norman a další, 1995, Mol. Microbiol. 16: 755 - 760; Sander a další, 1995, Mol. Microbiol. 16: 991 - 1000; Pelicic a další, 1996 Mol. Microbiol. 20: 919 - 125; Knipfer a další, 1997, Plasmid 37: 129 - 140). Pro screening řídce se vyskytující druhé rekombinace vedoucí k delecí nebo náhradě genu mohou být použity markéry s negativní selekcí (counter-selectable markers). V tomto ohledu se jako použitelné reportérové geny ukázaly jak sacB, tak i rpsL (Hosteda Baltz, 1997, J. Bacteriol. 179: 180 - 186; Schafer a další, 1994, J. Bacteriol. 172:
- 5 1663 - 1666; Sander a další, 1995 Mol. Microbiol. 16: 991 - 1000; Pelicic a další, 1996, Mol. Microbiol. 20: 919 - 925; Jáger a další, 1992, J. Bacteriol. 174: 5462 - 5465), ale mohou být stejně dobře použity jiné vhodné markéry. Použití genu rpsL v bakteriích Rhodococcus nebylo popsáno, ale gen sacB (kódující levansacharázu Bacillus subtilis) poskytuje u tohoto rodu silný pozitivní selekční markér (Jáger a další, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 126: 1 - 6; DenisLarose a další, 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 4363 - 4367).
Levansacharáza (levansucrase) B. subtilis kódovaná genem sacB katalyzuje hydrolýzu cukrů a syntézu levanů (polymery fruktózy s vysokou molekulovou hmotnosti). Exprese genu sacB v bakterii Rhodococcus je v přítomnosti sacharózy letální. Biochemický základ pro toxicitu působení levansacharázy na sacharózu je dosud neznámý. Podmínečná letalita (tj. přítomnost nebo nepřítomnost sacharózy) genu sacB může být proto použita jako markér s negativní selekcí (counter-selectable markér). Negativní selekce v této souvislosti znamená, že exprese markéru je letální, místo aby poskytovala rezistenci, jak je tomu v případě selektovatelných markérů (například rezistenčních markérů).
Negativní selekce je zapotřebí pro selekci těch mutant, u kterých proběhla druhá rekombinace, čímž došlo ke ztrátě markéru sacB a zavedení požadované mutace. Výhodou tohoto systému je, že v průběhu selekce přežijí výlučně potenciálně dobré mutanty. Ve srovnání se systémem, ve kterém se použije pouze jednoho selekčního markéru, zabrání negativní selekce časově náročnému procesu screeningu na ztrátu rezistenčního markéru, který by byl nezbytný při použití systému s jedním selekčním markérem.
Výhoda neznačené (unmarked) mutace je v tom, že umožní opakované zavádění mutací do stejného kmene. Při procesu zavedení mutace se odstraní cizí DNA (vektorová DNA). Nově zavedená vektorová DNA, pro zavedení druhé mutace, se proto nemůže • ·
- 6 • · · · · t · • · · · · · · · ·· · • · · · · · · · · · · · • · · · · · · integrovat v místě předcházející mutace (homologní rekombinací mezi vektorovými DNA). K integraci zcela jistě dojde, jestliže je vektorová DNA stále přítomná v chromosomu a poskytne velký počet falešně pozitivních integrantů. Systém umožní použití jediného antibiotického genu pro zavedení neomezeného počtu mutací. Neznačená mutace také umožní snadné využití v průmyslu, protože nepřítomnost heterogenní DNA dovolí jednoduché nakládání s odpadní fermentační půdou.
Inaktivace genu genovou deleci umožní konstrukci stabilních, nerevertujících mutant. Zvláště malé geny (< 500 bp) jsou genovou deleci snadněji inaktivovány ve srovnání s přerušením genu jedinou rekombinantní integrací. Mutageneze genovou deleci může být také použita pro inaktivaci shluku několika genů z genomu. Strategie mutageneze genovou deleci může být také použita pro náhradu genu (například změnu standardního typu na mutantní gen).
Výhodný kmen pro mutagenezi genů pro katabolické dehydrogenázy steroidů je Rhodococcus erythropolis. Je však také možno uvažovat deleci neznačeného genu pro ksřD1 a/nebo kstD2 v jiných druzích, geneticky dostupných konjugací, jestliže mají stejnou (nebo podobnou) molekulární organizaci jako R. erythropolis SQ1. Tyto druhy s výhodou patří do rodu Rhodococcus, ale mohou být také použity příbuzné druhy jako Nocardia, Mycobacterium a Arthrobacter.
Inaktivace genů u příslušníků rodu Rhodococcus je ztěžována výskytem nelegitimních rekombinačních dějů, jejichž výsledkem je náhodná integrce mutagenního vektoru do genomu (Desomer a další, 1991, Mol. Microbiol. 5: 2115 - 2124; Barnes a další, 1997, J. Bacteriol. 179: 6145 - 6153), což je jev, který byl autory vynálezu pozorován při pokusu o přerušení genu ksřD1 v R. erythropolis SQ1. Nelegitimní rekombinace je také dobře známý jev u několika pomalu rostoucích druhů Mycobacterium (McFadden, 1996, Mol. Microbiol. 121: 205 - 211). Ukázalo se, že náhodnou integraci minimalizuje
- 7 konjugativní přenos plasmidu z E. coli S17 - 1 do Rhodococcus (Powell a Archer, 1998, Antinie van Leeuwenhoek 74: 175 - 188). Konjugativní mobilizace plasmidu z E. coli kmen S17 - 1 do mnoha různých kmenů koryneformních bakterií a do Rhodococcus fascians DSM20131 se ukázala jako možná (Schafer a další, 1990, J. Bacteriol. 172: 1663 - 1666; Jauger a další, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 126: 1 6). Podle předkládaného vynálezu byl proto upraven konjugativní přenos mutagenního vektoru nesoucího gen sacB jako markér s negativní selekcí pro zavedení neznačených genových delecí v katabolismu steroidů R. erythropolis SQ1.
V dalším provedení předkládaného vynálezu může být provedeno zavedení inaktivace druhého genu použitím stejných metod, jako je ilustrováno v příkladu pro gen kstD2. Pro inaktivaci každého dalšího genu je opět možno použít stejných metod, nebo alternativně UV záření nebo chemických prostředků, jako je nitroguanidin nebo diepoxyethan. Způsoby zavádění genových mutací tímto způsobem jsou v oboru dobře známé.
Dobře známé jsou také způsoby konstrukce nosičů pro použití v protokolu mutageneze (Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, poslední vydání). Navíc jsou v oboru dobře známé způsoby místně specifické mutageneze, ligace dalších sekvencí, PCR, sekvenování DNA a konstrukce vhodných expresních systémů. Části nebo veškerá DNA kódující požadovaný protein mohou být zkonstruovány synteticky použitím standardních technik na pevné fázi, s výhodou pro zavedení restrikčních míst pro snadné provádění ligaci.
Z předcházejícího podrobného popisu vynálezu budou odborníkům v oboru zřejmé také modifikace a variace způsobu pro zavádění mutací přerušených genů nebo neznačených genových delecí stejně jako transformace a konjugace. Takové modifikace a variace mají rovněž spadat do rámce předkládaného vynálezu.
• 4·· » · · · · · · • · · · · « « · · · 4 • ··· · · · · · · · ·
Q 4 ······· ~ Ό “ ·4·4 ·· ·· ··· ·· ····
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu mohou být pro akumulaci steroidních meziproduktů použity mikroorganismy s inaktivacemi většího počtu genů. Akumulovaným produktem je s výhodou 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Výchozí materiál může záviset na enzymech, jejichž geny jsou inaktivovány. Vhodnými výchozími látkami jsou například fytosteroly nebo 4-androsten-3,17-dion. Výhodným výchozím materiálem je 4-androsten-3,17-dion.
Výhoda předkládaného vynálezu spočívá v tom, že lze získat vysoké konverzní výtěžky výchozího steroidu na akumulovaný produkt. Výtěžky mohou přesáhnout 80 %, s výhodou více než 90 % a často dosahují hodnoty téměř 100 %.
Ještě další provedení vynálezu spočívá v geneticky modifikovaných mikroorganismech s větším počtem inaktivovaných genů, které se účastní při degradaci steroidů. Těmito geny jsou zvláště dehydrogenázy. S výhodou je inaktivován alespoň gen /csřD1 nebo kstD2, Zvláště výhodná je inaktivace obou genů ŘsřD1 a kstD2. Výhodné jsou mikroorganismy náležející k rodu Rhodococcus. Nejvýhodnější je kmen Rhodococcus erythropolis RG1-LTV29.
Kmeny mikroorganismů Rhodococcus erythropolis RG1-UV29 a Rhodococcus erythropolis RG1 byly uloženy ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Německo, pod depozitními čísly DSM 13157 a DSM 13156. Tato uložení byla provedena v souladu s podmínkami Budapešťské dohody.
Odborníkovi v oboru bude zřejmé, jak používat metody a materiály popisované a odkazované v tomto dokumentu pro konstrukci mikroorganismů postrádajících schopnost degradovat steroidní jádro. Podobně je možno inaktivovat větší počet genů kódujících některé další enzymy degradující steroidní jádro.
44 ·♦·♦·· 44 ·4 • · · · · 4 4 4 4 4 ·
4 4 4444 4 4 4
44444 4 444 4 4
4 444 4444
- 4444 44 44 4·4 44 4444
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1
Schematické znázornění degradace steroidního jádra v R. erythropolis SQ1. Polohy isoenzymů 3-ketosteroid-A1-dehydrogenázy (KSTD) jsou označeny jako KSTD1 a KSTD3.
Obr. 2
Schematické znázornění mutagenního vektoru pSDH422 s markérem sacB s negativní selekcí použitým pro konstrukci Rhodococcus erythropolis kmen RG1 s neznačenou genovou delecí ks/D1 o délce 1062 bp. ORF2 a ORF3 jsou obklopující geny kstDl v R. erythropolis SQ1.
Obr. 3
Schematické znázornění molekulární organizace genu kstOl v R. erythropolis SQ1 standardního typu a po integraci plasmidu pSDH422 jednoduchým crossing-overem ve specifickém místě po směru transkripce (kmen SDH422 - 3) a proti směru transkripce (kmen SDH422 - 4) vzhledem ke genu ksíD1. Na vloženém obrázku je analýza Southernovým přenosem, s použitím genu ksíD1 jako sondy, chromosomální DNA R. erythropolis štěpené fíamHI u standardního typu (dráha 1), kmene SDH422 - 3 (dráha 2), SDH422 - 4 (dráha 3) a dvou jednotlivých delečních mutant kstDl (dráhy 4 a 5).
Obr. 4
Biologická konverze v šestilitrové kultuře Rhodococcus erythropolis SQ1 UV-29 4-androsten-3,17-dionu na 9cc-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Křivky jsou znázorněny pro 10 g/l AD (-O-) a 20 g/l AD (-Δ-, -χ-).
« φ · φ » ·
Φ· φφ • « φ
• φφφ φ φ •φφφ Φ·
- 10 • φ φφφ • φ φ ·· ··«
Obr. 5
Biologická konverze v šestilitrové kltuře Rhodococcus erythropolis RG8 4-androsten-3,17dionu na 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. 10 g/l AD (-Δ-, -x-).
Následující příklady budou uvedeny pro ilustraci vynálezu a v žádném případě by neměly být interpretovány jako omezující rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Charakterizace ksfD1
Byla vyvinuta oligonukleotidová sonda degenerovaného kstD [5’ttcgg(c/g)gg(c/g)ac(c/g)tc(c/g)gc(c/g)tactc(c/g)gg(c/g)gc(c/g)-tc(c/g)atctgg] (SEQ ID NO: 2) z uspořádání N-koncových částí známých proteinových sekvencí KSTD A. simplex, C. testosteroni a N. opaca. Celková DNA R. erythropolis SQ1 štěpená BglW byla podle velikostí dělena centrifugací v sacharózovém gradientu. Southernova analýza při 68 °C (stringentní promývání 2 x SSC 2x15 min a 0,1 x SSC 2 x 10 min) získaných frakcí poskytla fragment DNA 6 kb hybridizující s oligonukleotidovou sodnou kstD značenou digoxigeninem. Tento fragment byl ligován do místa BglU kyvadlovým vektorem pDA71 Rhodococcus-E. coli (Dabs a další, 1995, Development of improved Rhodococcus plasmid vectors and their use in cloning genes of potential commercial and medical importance, str. 129 - 135. Proceedings of the Ninth Symposium on the Actinomycetes, Moscow, Rusko) a subklonován do plasmidů pBluescript II KS (Stratagene) štěpeného SamHI (pSDH200).
Z analýzy restrikčním mapováním autoři vynálezu došli k závěru,
- 11 ···· · · · ···· 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 · • 9999· 9 999 9 9 · · · 9 9 9 9
9999 99 99 999 99 9999 že ve fragmentu 6 kb bylo přítomno pouze jedno místo EcoRV, které fragment dělilo na dva fragmenty stejné velikosti o délce přibližně 3 kb. Southernova analýza ukázala, že přibližně 2,9 kb dlouhý fragment EcoRV plasmidů pSDH200 obsahoval sekvence homologní s oligonukleotidem kstD. Sekvenování nukleotidů ukázalo otevřený čtecí rámec 1533 nukleotidů (kstD 1, viz SEQ ID NO: 1) kódující KSTD1, jak bylo ukázáno heterologní expresí v Escherichia. Další sekvenování nukleotidů ukázalo dva ORF 1533 nukleotidů (ORF1) a 627 nukleotidů (ORF2) kódující domnělé proteiny o délce 510 aminokyselin, popřípadě 208 aminokyselin.
Příklad 2
Kmen s delecí KstD!
Byl zkonsruován mutagenní vektor obsahující fragment chromosomální DNA R. erythropolis SQ1 s delecí kstDl. Byla provedena delece 1062 bp fragmentu Bsmi pSDH200, kódující velkou vnitřní část KSTD1, za získání konstruktu pSDH200)Bsml. Pro konstrukci mutagenního vektoru byl klonován 2724 bp fragment Smal/EcoRl plasmidů pSDH200)Bsml nesoucí zbývajících 468 bp genu kstDl a jeho obklopující oblasti do místa Smai/EcoRi plasmidů pK18mobsacB (pSDH422, viz obr. 2). Vektor pSDH422, kódující rezistenci na kanamycin pro selekci integrace mutagenního vektoru do hromosomu a nesoucí gen sacB B. subtilis pro negativní selekci, byl zaveden do E. coli S17-1 a mobilizován do R. erythropolis SQ1 konjugací provedenou následujícím způsobem. Buňky kmene příjemce R. erythropolis SQ1 byly rozetřeny na agar LBP doplněný 30 pgml kyseliny nalidixové a pěstovány 5 dnů. Mutagenní vektor pSDH422 byl nejprve zaveden transformací do E. coli S17-1.
Transformanty (přibližně 1000 na plotnu) pěstované přes noc na selektivním médiu (kanamycin 25 pg/ml) byly inkubovány při laboratorní teplotě dalších 24 hod. Kolonie obou kmenů Rhodococcus • · • · ft
- 12 • ftft • » ft · • ft • · ·ftft · ·· • · · · ft · ftftft ftft · • · · · · · · • · · · · · •ft ftftft ftft ···· a E. coli byly resuspendovány v konečném objemu 1,5 ml LBP (1% bacto-pepton (Difco), 0,5% kvasničný extrakt (BBL) a 1% NaCl). Alikvoty 750 μΙ každého kmene byly smíchány a jemně odděleny centrifugací. Centrifugát byl resuspendován v 1 ml LBP a buňky byly rozetřeny na neselektivní agar LBP v 250 μΙ alikvotech. Po pěstování přes noc při 30 °C byl materiál narostlý do konfluence resuspendován ve 2 ml média LBP a 100 μΙ alikvoty byly rozetřeny na agar LBP doplněný kanamycinem (200 pg/ml) a kyselinou nalidixovou (30 pg/ml). Transkonjugáty R. erythropolis SQ1 se objevily po třech dnech. Všechny kanamycin-resistentní (kanr) transkonjugáty Rhodococcus byly citlivé na sacharózu (sucs); po otisku na půdu LBPS (1% bactopepton, 0,5% kvasničný extract, 1% NaCl, 10% sacharóza) doplněnou 200 pg/ml kanamycinu.
Southernova analýza (obr. 3) standardního typu (dráha 1: jeden pruh přibližně 4500 bp) a dvou transkonjugátů, SDH422-3 (dráha 2: dva pruhy přibližně 2900 a 10 100 bp) a SDH422-4 (dráha 3: dva pruhy přibližně 4000 a 9000 bp) ukázala, že oba si zachovaly jednu kopii pSDH422 integrovanou v cílovém místě jednoduchou rekombinací. Delece genu ksíD1 v R. erythropolis SDH422-3 byla dosažena v průběhu růstu přes noc za neselektivních podmínek a zviditelněna následným otiskem na selektivním médiu, tj. agar LBPS.
Delece genu ksíD1 byla dosažena v průběhu růstu přes noc za neselektivních podmínek a následným otiskem na selektivním médiu, tj. agar LBPS. PCR kolonií s primery ksřD1 (dopředný primer (forward, 5’h>3’) [5’ gcgcatatgcaggactggaccagcgagtgc] (SEQ ID NO: 3); reverzní primer [5’ gcgggatccgcgttacttcgccatgtcctg] (SEQ ID NO: 4)) u 9 kolonií sucr/kans poskytla šest produktů PCR s velikostí fragmentů 468 bp obsahující delecí genu kstD1. Delece genu byla potvrzena Southernovou analýzou při 60 °C (promývání za stringentních podmínek 2 x SSC 2x5 min a 0,1 x SSC 2x5 min) s použitím náhodně digoxigeninem značeného genu ksřD1 jako sondy. Fragment ·«· ·
44 • 4 4 ·
4 4
444
4
4444 94
- 13 DNA 4,5 kb kstD1 standardního typu získaný po štěpení BamHI chromosomální DNA byl v mutantech s delecí genu zmenšen na 3,4 kb, což ukazuje delecí očekávaných 1062 bp fragmentu DNA kstD1. Získaný kmen byl označen R. erythropolis RG1.
Příklad 3
Inaktivace A1-dehydrogenace steroidů UV mutagenezí
Buňky R. erythropolis RG1 v pozdní exponenciální fázi (2.108 CFU/ml) pěstované v minerálním médiu s 10 mM glukózou (K2HPO4 4,65 g/l, NaH2PO4.H2O 1,5 g/l, NH4CI3 g/l, MgSO4.7H2O 1 g/l, stopové prvky Vishniac, pH 7,2) byly krátkodobě sonikovány za získání jednotlivých buněk. Zředěné (104) vzorky byly rozetřeny na minerální agar s glukózou a ozářeny 15 až 20 s UV lampou (Philips TAW 15W) ze vzdálenosti 27 cm, což v průměru vede k usmrcení 95 % buněk. Po čtyřech dnech inkubace byly kolonie otisknuty na minerální agarové médium obsahující 4-androsten-3,17-dion (0,5 g/l, solubilizovaný v DMSO (50 mg/ml). Mutanty s růstovou deficiencí na steroid načárkované po třech až čtyřech dnech byly vybírány pro další charakterizaci. Pro selekci kmenů s blokovanou A1-dehydrogenací byl proveden screening na 4-androsten-3,17-dion růstově deficientní mutanty schopné růst na minerálním médiu obsahujícím 1,4-androstadien-3,17-dion (0,25 g/l). Z toho je možné vyvodit, že tento gen byl inaktivován. Gen byl nazván kstD3 (viz obr. 1).
Příklad 4
Mikrobiální 9a-hvdroxylace 4-androsten-3,17dionu UV-mutantou
Rhodococcus erythropolis UV-29
Rhodococcus erythropolis SQ1 UV-29 je UV-mutanta, která je schopná konverze 4-androsten-3,17-dionu (AD) na 9a-hydroxy-499 9999 • 9
999
999 9·
- 14 • · 9 • ·
9999 99 « 9«
9 9 9
9 9 • 99 • 99
9 99 9 9
-androsten-3,17-dion (9aOH-AD) s koncentrací 10 až 20 g/l.
Tato konverze byla provedena následujícím způsobem:
V 250 ml Erlenmeyerově baňce obsahující 75 ml sterilního média (1,5% kvasničný extrakt, 1,5% glukóza; pH 7,0) byl pěstován Rhodococcus erythropolis SQ1 UV-29 na rotační třepačce (180 ot/min) při 28 °C 24 hod (předkultura). Touto předkulturou byl zaočkován (1 %) 10 I fermentor obsahující 6 I fermentační půdy sterilizované in šitu (1,5% kvasničný extrakt, 1,5% glukóza, 0,01% odpěňovací prostředek polypropylenglykol; pH 7,5) a inkubován při 28 °C 16 hod za probublávání sterilním vzduchem a kultura byla míchána pro indukci submerzního růstu. Potom byla přidána suspenze 60 g 4-androsten-3,17-dionu ve 300 ml polysorbátu (0,1 %). Aerobní inkubace za míchání při 28 °C potom pokračovala 24 hod. Vzorky kultury byly potom extrahovány methanolem (70 %) a zfiltrovány přes 0,45 pm filtr s příčným tokem přes membránu před zjišťováním složení steroidů pomocí HPLC. Stejný postup byl prováděn třikrát s dvojnásobnými koncentracemi AD 20 g/l, s přidáním 120 g namísto 60 g AD.
Jak je ukázáno na obr. 4, během 24 hod dojde k téměř úplné konverzi 10 až 20 g/l 4-androsten-3,17-dionu na 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion (přibližně 93 % z celkového 4-androsten-3,17-dionu).
Příklad 5
Charakterizace ksfD2
Genová knihovna R. erythropolis RG1 byla zavedena do kompetentního kmene R. erythropolis RG1-UV29 elektrotransformací. Získané kolonie byly otisknuty na minerální agarové médium obsahující 4-androsten-3,17-díon (0,5 g/l) jako jediný zdroj uhlíku a
- 15 • 0 44
0 4 4
4 0 • 0 0 0 0
0 0000 00 «· 000* ·» ·· • 0 0 4 0 0 0
0400« 04 4
0 0 0 0 * 0 0 0 4 0 ··
0 0 0 04 4000 energie. Komplementace fenotypu kmene RG1-UV29 byla hodnocena po třech dnech inkubace při 30 °C. Kolonie rostoucí na minerálním agarovém médiu s 4-androsten-3,17-dionem byly kultivovány v médiu LBP pro izolaci plasmidové DNA, která byla potom znovu zavedena do kmene RG1-UV29 pro kontrolu správné komplementace. Plasmid pKSD101 izolovaný z transformantu, který se vyznačoval obnoveným růstem na minerálním médiu s 4-androsten-3,17-dionem, byl zaveden do E. coli DHSa pro další analýzu. V pKSD101 byl identifikován inzert o délce přibližně 6,5 kb rhodokokové DNA, který byl vystaven restrikční mapovací analýze, subklonování a následným komplementačním experimentům. Fragment DNA EcoRI o délce 3,6 kb plsmidu pKSD101 byi stále ještě schopen obnovit fenotyp kmene RG1UV29, a tak byl subklonován do pBBIuescript(ll) KS (pKSD105) pro sekvenování nukleotidů. Analýza nukleotidové sekvence odhalila přítomnost velkého otevřeného čtecího rámce (ORF) o délce 1698 nukleotidů kódujícího domnělý protein 565 aminokyselin s vypočtenou molekulovou hmotností 60,2 kDa. Tento ORF byl označen kstO2 (SEQ ID NO: 5) (který je identický s dříve popsaným ksřD3 - viz příklad 3). Odvozená aminokyselinová sekvence kstD2 ukázala vysokou podobnost se známými 3-ketosteroid-A1-dehydrogenázami (KSTD), což ukazuje, že kstD2 kóduje druhý enzym KSTD v R. erythropolis RG1.
Příklad 6
Kmeny s deleci kstD2
R. erythropolis kmen RG7 je mutantní kmen získaný z R. erythropolis standardního kmenu SQ1, obsahující jedinou deleci genu ksřD2. R. erythropolis kmen RG8 je zkonstruován postupnou deleci dvou genů kódujících 3-ketosteroid-A1-dehydrogenázovou aktivitu, tj. ksfD1 a kstD2, z kmene standardního typu R. erythropolis SQ1. Kmen *4 44
4 4 4 • 4 4
4 4
4 4
4 4 4 f 4 •4 4444
4
4 9»
4· • 9 4 9
4 9 • 494 • » •944 44
- 16 *4
RG8 byl získán delecí kmenu kstt)2 z genomu deleční mutanty ksřD1 R. erythropolis kmen RG1. Metoda použitá pro delecí genu kstD2 byla analogická jako metoda popsaná pro delecí genu ksřD1 v příkladu 2 kromě toho, že bylo použito odlišného mutagenního vektoru (pKSD201 proti pSDH422).
Mutagenní vektor pKSD201 byl zkonstruován následujícím způsobem. Vnitřní fragment DNA o délce 1093 bp genu kstO2 byl vyjmut štěpením Mlu\ a následnou samovolnou ligací pKSD105, vedoucí ke konstrukci pKSD200. Fragment 2,4 kb EcoRI plasmidu pKSD200 nesoucí mutovaný gen kstD2 byl ligován do EcoRI štěpeného pK18mobsacB, za získání pKSD201. Plasmid pKSD201 byl zaveden do E. coli S17-1 a mobilizován konjugací s R. erythropolis kmen SQ1 (za vytvoření kmene RG7), nebo s kmenem RG1 (za vytvoření kmene RG8). Transkonjuganty (sucs kanr), získané z cílené integrace pKSD201 do genomu se objevily po 3 dnech růstu při 30 °C. Delece kstD2 bylo dosaženo růstem vybraného transkonjugantu (sucs kanr) přes noc za neselektivních podmínek (tj. médium LBP) a následným vysetím na selektivní agarové médium LBPS. PCR kolonií provedená na 15 koloniích sucr/kans s použitím primerů kstO2 (dopředný primer [5’ gcgcatatggctaagaatcaggcaccc] (SEQ ID NO: 6); reverzní primer [5’ gcgggatccctacttctctgctgcgtgatg] (SEQ ID NO: 7)) poskytla čtyři produkty PCR s velikostí fragmentu 0,6 kb, obsahující zbývající část genu kstD2. Southernovou analýzou použitím digznačeného genu kstO2 jako sondy na chromosomální DNA standardního typu štěpené Asp718 a těchto čtyřech získaných mutantách byla potvrzena delece ksřD2: velikost fragmentu DNA standardního typu Asp718 2,4 kb byla snížena v mutantních kmenech na 1,3 kb.
- 17 ft· • ft • · ftftftft ftftftft ftft ·« ftftftft ·· ftft • ftft ftftftft • · ftftft ftft ft ftft · · · · * ftft · ft · ft • ft ··· ftft ftftftft
Příklad 7
Mikrobiální 9a-hvdroxylace 4-androsten-3,17-dionu kmenem R.
erythropolis RG8
Rhodococcus erythropolis RG8 je dvojitá deleční mutanta ksfD1 a kstD2, která je schopná konvertovat 4-androsten-3,17-dion (AD) na 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion (9aOH-AD) při koncentraci 10 g/l.
Tato konverze byla prováděna následujícím způsobem:
Ve 250 ml Erlenmeyerově baňce obsahující 75 ml sterilního média (1,5% kvasničný extrakt, 1,5% glukóza; pH 7,0) byla pěstována Rhodococcus erythropolis RG8 na rotační třepačce (180 ot/min) při 28 °C po dobu 24 hod (předkultura). 10 I fermentor obsahující 6 I fermentační půdy sterilizované in sítu (1,5% kvasničný extrakt, 1,5% glukóza, 0,01% odpěňovací prostředek polypropylenglykol; pH 7,5) byl zaočkován předkulturou (1 %) a inkubován při 28 °C 16 hod za probublávání sterilním vzduchem, a kultura byla míchána pro indukci submerzního růstu. Potom byla přidána suspenze 60 g 4-androsten-3,17-dionu v 300 ml polysorbátu (0,1 %). Aerobní inkubace za míchání při 28 °C byla potom udržována 24 hod. Během procesu byly odebírány vzorky. Tyto vzorky byly extrahovány methanolem (70%) a zfiltrovány přes 0,45 pm filtr s příčným tokem přes membránu před stanovením složení steroidů pomocí HPLC. Tento postup byl proveden dvakrát.
Jak je ukázáno na obr. 5, během 15 hod je 10 g/l 4-androsten-3,17-dionu téměř úplně převedeno na 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion (přibližně 92 až 96 % z celkového 4-androsten-3,17-dionu).
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob konstrukce geneticky modifikovaného kmene mikroorganismu degradujícího steroidy postrádajícího schopnost degradovat steroidní jádro, vyznačující se tím, že zahrnuje inaktivaci většího počtu genů účastnících se degradace steroidního jádra, kde delece prvního genu se provádí neznačenou genovou delecí.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e zahrnuje deleci většího počtu genů pro dehydrogenázy steroidů.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e prvním deletovaným genem je ksíD1 nebo kstD2.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e jakýkoli následující gen se inaktivuje ozářením UV.
- 5. Způsob podle některého z nároků 3 nebo 4, vyznačující se tím, že jakýkoli následující gen se deletuje neznačenou genovou delecí.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e druhý gen se deletuje neznačenou genovou delecí.• · • ·- 19 • φ φ φ φ φ · · · · · · • · · · φ φ · φφφφ φφ φφ Φ·Φ ·· φφφφ
- 7. Způsob podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že mikroorganismem je Rhodococcus, s výhodou R. erythopolis.
- 8. Mikroorganismus připravený způsobem podle některého z nároků 1 až 7.
- 9. Mikroorganismus podle nároku 8, vyznačující se tím, že jsou inaktivovány alespoň oba geny ksřD1 a kstD2.
- 10. Geneticky modifikovaný kmen, kterým je Rhodococcus erythopolis RG1-UV29 (DSM13157).
- 11. Použití mikroorganismu podle některého z nároků 8 až 10 při výrobě 9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dionu kultivací uvedeného mikroorganismu na kultivačním médiu s obsahem 4-androsten-3,17-dionu.
- 12. Nukleotidová sekvence kódující protein KSTD1 kódovaný nukleotidy 820 až 2329 SEQ ID NO. 1.
- 13. Nukleotidová sekvence kódující protein KSTD2 kódovaný nukleotidy 1 až 1678 SEQ ID NO. 5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99203470 | 1999-10-22 | ||
| EP99204449 | 1999-12-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021784A3 true CZ20021784A3 (cs) | 2002-08-14 |
Family
ID=26153382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021784A CZ20021784A3 (cs) | 1999-10-22 | 2000-10-17 | Mikrobiální 9alfa-hydroxylace steroidů |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1232278A1 (cs) |
| CN (1) | CN1224716C (cs) |
| AR (1) | AR026186A1 (cs) |
| AU (1) | AU775476B2 (cs) |
| CA (1) | CA2396879A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20021784A3 (cs) |
| IL (1) | IL149715A0 (cs) |
| NO (1) | NO20022449L (cs) |
| NZ (1) | NZ519039A (cs) |
| RU (1) | RU2268935C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001031050A1 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1478742B1 (en) | 2002-02-21 | 2010-04-21 | N.V. Organon | Identification of 3-ketosteroid 9-alfa-hydroxylase genes and microorganisms blocked in 3-ketosteroid 9-alfa-hydroxylase activity |
| AU2003302151A1 (en) * | 2002-12-03 | 2004-07-09 | N.V. Organon | New expression system from rhodococcus |
| AT503486B1 (de) * | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
| RU2351645C1 (ru) * | 2007-07-20 | 2009-04-10 | Наталия Евгеньевна Войшвилло | ШТАММ Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1740 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 9 АЛЬФА-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ |
| WO2009024572A1 (en) * | 2007-08-21 | 2009-02-26 | N.V. Organon | Method for the production of modified steroid degrading microorganisms and their use |
| RU2011138954A (ru) | 2009-02-23 | 2013-03-27 | Рейксюниверситейт Гронинген | Фармацевтическая композиция и способы лечения туберкулеза |
| CN103361394B (zh) * | 2013-08-07 | 2016-08-17 | 中国科学院上海高等研究院 | 利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法 |
| CN103805577A (zh) * | 2013-08-14 | 2014-05-21 | 济南环亿生物科技有限公司 | 一种采用睾丸酮丛毛单胞菌高效生产羟基类固醇脱氢酶的方法 |
| WO2015128534A1 (es) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | MUTANTES RECOMBINANTES SELECTIVOS DE MYCOBACTERIUM SMEGMATIS mc2 155 Y SU USO PARA LA PRODUCCIÓN DE 1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DIONA O 4-ANDROSTEN-3,17-DIONA A PARTIR DE ESTEROLES NATURALES |
| CN107586762A (zh) * | 2017-09-18 | 2018-01-16 | 天津科技大学 | 一种3‑甾酮‑δ1‑脱氢酶突变体及其应用 |
| US11001871B2 (en) | 2017-12-15 | 2021-05-11 | Jiangnan University | Method for producing 9alpha-hydroxy androstane-4-alkene-3,17-diketone by enzymatic conversion |
| CN107955827B (zh) * | 2017-12-15 | 2019-07-02 | 江南大学 | 一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法 |
| GB2577037A (en) * | 2018-08-09 | 2020-03-18 | Cambrex Karlskoga Ab | Genetically-modified bacteria and uses thereof |
| KR20210125490A (ko) * | 2019-02-08 | 2021-10-18 | 사노피 | 스테로이드의 1,2-탈수소화를 위한 미생물의 생명공학적 최적화 |
| CN110229838B (zh) * | 2019-05-28 | 2021-01-08 | 浙江理工大学 | 一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法 |
| CN114621965B (zh) * | 2022-02-15 | 2023-10-03 | 复旦大学 | 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU196627B (en) * | 1986-11-18 | 1988-12-28 | Gyogyszerkutato Intezet | Microbiological process for producing y alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione |
| RU2039824C1 (ru) * | 1993-06-22 | 1995-07-20 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН | Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона |
-
2000
- 2000-10-17 EP EP00977417A patent/EP1232278A1/en not_active Ceased
- 2000-10-17 CZ CZ20021784A patent/CZ20021784A3/cs unknown
- 2000-10-17 RU RU2002113373/13A patent/RU2268935C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-10-17 NZ NZ519039A patent/NZ519039A/en unknown
- 2000-10-17 CA CA002396879A patent/CA2396879A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-17 CN CNB008175675A patent/CN1224716C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-17 AU AU15145/01A patent/AU775476B2/en not_active Ceased
- 2000-10-17 WO PCT/EP2000/010223 patent/WO2001031050A1/en not_active Ceased
- 2000-10-17 IL IL14971500A patent/IL149715A0/xx unknown
- 2000-10-20 AR ARP000105523A patent/AR026186A1/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-05-23 NO NO20022449A patent/NO20022449L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1232278A1 (en) | 2002-08-21 |
| RU2268935C2 (ru) | 2006-01-27 |
| IL149715A0 (en) | 2002-11-10 |
| NO20022449L (no) | 2002-06-19 |
| CN1413260A (zh) | 2003-04-23 |
| AR026186A1 (es) | 2003-01-29 |
| WO2001031050A1 (en) | 2001-05-03 |
| CN1224716C (zh) | 2005-10-26 |
| NO20022449D0 (no) | 2002-05-23 |
| NZ519039A (en) | 2004-09-24 |
| CA2396879A1 (en) | 2001-05-03 |
| RU2002113373A (ru) | 2004-02-27 |
| AU775476B2 (en) | 2004-08-05 |
| AU1514501A (en) | 2001-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20021784A3 (cs) | Mikrobiální 9alfa-hydroxylace steroidů | |
| US9567618B2 (en) | Microorganisms and methods for producing substituted phenols | |
| JP2012040016A (ja) | エタノール生産用の不活性化乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を有する好熱性微生物 | |
| EP0620852A1 (en) | Cyclic di-guanylate metabolic enzymes | |
| JP4801151B2 (ja) | 不活性化された乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する改変微生物 | |
| JP2025038080A (ja) | ステロイドの１，２－脱水素のための微生物の生物工学的最適化 | |
| US7514236B2 (en) | Identification of 3-ketosteroid 9-alfa-hydroxylase genes and microorganisms blocked in 3-ketosteroid 9-alfa-hydroxylase activity | |
| CN102245781A (zh) | 用于生产核黄素的方法 | |
| CN113461789B (zh) | 一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用 | |
| JP2011200133A (ja) | 遺伝的に改変された微生物の製造方法 | |
| US20060172423A1 (en) | New expression system from rhodococcus | |
| IL118714A (en) | Isolated cell which contains at least one dna sequence coding for a protein with a sucrose isomerase activity and processes for the preparation thereof | |
| RU2832723C2 (ru) | Биотехнологическая оптимизация микроорганизмов | |
| US20090186390A1 (en) | Method for the Production of Modified Steroid Degrading Microorganisms and their Use | |
| JP2006502692A (ja) | デヒドロゲナーゼの過剰発現のための方法 | |
| JP6160814B2 (ja) | 遺伝的に改変されたロドコッカス属細菌変異株及びこれを製造する方法 | |
| JP2002017362A (ja) | 高温耐性コリネ型細菌の形質転換法及び形質転換体 |