CN107586762A

CN107586762A - 一种3‑甾酮‑δ1‑脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN107586762A
Application number: CN201710837906.2A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 秦慧民; 毛淑红; 王建文
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-01-16

Abstract

本发明属于基因工程和酶过程技术领域，具体涉及一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体及其应用。所述突变体是通过反向PCR进行定点突变获得的，突变后的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体比酶活为190450.28U/mg，较野生型提高了315.73％。所提供突变体及突变位点为今后3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶及生物酶法高效催化生产甾体药物的研究提供了理论依据与技术保障。

Description

一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其应用

技术领域：

本发明属于基因工程和酶过程技术领域，具体涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其应用。

背景技术：

甾体药物作为继抗生素之后需求量次多的药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克作用，能改善蛋白质代谢、恢复和增强体力以及利尿降压，广泛用于治疗风湿性关节炎、支气管哮喘、湿疹等皮肤病、过敏性休克、前列腺炎、爱迪森氏等内分泌疾病，也可用于避孕、安胎、减轻女性更年期症状、手术麻醉等方面，以及预防冠心病、艾滋病、减肥等。目前甾体药物合成以化学合成为主，微生物转化为辅的工艺路线，包括甾体A环C1,2脱氢、甾体B环C7,8脱氢、9(11)α- 羟基化等。微生物转化指通过微生物体内的相关酶系的催化反应而发挥作用。甾体药物具有环戊烷骈多氢菲母核，由于其结构复杂性，化学工艺存在许多弊端，包括工艺路线复杂、反应条件苛刻、副产物多、收率低等等。而酶法催化因其特异性强、反应条件温和，产率高等重要优势，已为许多甾体药物开发提供更加高效的策略。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD3),或称甾体C1,2脱氢酶，作用是使甾体A环C1,2脱氢，形成双键，是甾醇降解的关键酶。其含有1548bp的开放阅读框，编码515个氨基酸。

本发明将野生型KsdD3化转到E.coli BL21(DE3)异源表达，上清经过Ni亲和层析和离子交换层析纯化后，进行酶学性质分析，表明其反应最适温度为30℃，最适pH为7.5，比酶活为45811.05U/mg，这与工业应用仍存在差距，因此通过对野生型分子改造使其酶活性提高，将有助于3-甾酮-Δ1-脱氢酶在工业生产甾体药物的推广。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种通过定点突变构建的酶活性提高的3-甾酮-Δ1- 脱氢酶突变体。本发明以简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11037基因组为模板，克隆出3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD3)基因，采用反向PCR进行定点突变获得编码突变体的基因mKsdD3，而后将编码突变体的基因进行异源表达获得3- 甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体P139D。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Pro139Asp，表示位置139的氨基酸由野生型的Pro替换成Asp，位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.2中野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸序列编号。

在本发明中，KsdD3表示野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的编码基因，mKsdD3表示3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D的编码基因，信息如下表。

用于表达所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的表达载体为pET28a(+)，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；

本发明的实验步骤概述如下：

(1)采用PCR技术以简单节杆菌TCCC11037基因组为模板，设计引物，扩增获取3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(SEQ ID No.2)，通过密码子优化后(SEQ ID No.5)构建于pET28a(+)表达载体，得到KsdD3-pET28a；

(2)以(1)中野生型重组载体KsdD3-pET28a为模板，通过反向PCR定点突变获得突变体P139D编码基因mKsdD3，测序鉴定mKsdD3；

(3)将验证正确的突变体重组载体mKsdD3-pET28a通过化转转入大肠杆菌 BL21(DE3)进行发酵培养，获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D。

所述发酵培养的方法，具体如下：

(1)重组菌株接于LB培养基(含有50-80μg/mL卡那霉素)，37℃下220 r/min培养12h后，以1％的接种量接于LB培养基(含有50-80μg/mL卡那霉素)，待菌浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入IPTG，终浓度为0.5mM，在16℃，160r/min下诱导24h；

(2)5000r/min离心收集菌体，重悬后超声破碎，低温高速离心(4℃,18000 r/min)得到上清，即含有3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体；

(3)高速离心上清经Ni-NTA亲和层析及离子交换色谱(GE-RESOURCE^TM Q)纯化后，得到3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。

有益效果：

(1)本发明通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，使其甾体C1,2 脱氢反应的活性提高。突变后的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D比酶活为 190450.28U/mg，野生型为45811.05U/mg，较野生型提高了315.73％。

(2)本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体比酶活有较大幅度提高，所提供的突变位点为今后3-甾酮-Δ1-脱氢酶及生物酶法高效催化生产甾体药物的研究提供了理论依据与技术保障。

附图说明：

图1野生型和突变体重组载体琼脂糖凝胶电泳图

其中，泳道1为野生型，泳道2为P139D；

图2野生型和突变体SDS-PAGES

其中，泳道1为野生型，泳道2为P139D；

图3雄烯二酮催化过程示意图；

图4转化率趋势变化图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1、3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的获得

以简单节杆菌TCCC11037(简单节杆菌TCCC11037已公开在非专利文献《简单节杆菌groEL基因表达对大肠杆菌抗逆性能的影响》，生物技术通报， 2016,32(5):180-186)基因组为模板，扩增获得野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因 KsdD3(SEQ ID No.2)，根据大肠杆菌BL21(DE3)进行密码子优化后得到SEQ ID No.5所示的序列，构建于pET28a(+)表达载体，得到KsdD3-pET28a，以 KsdD3-pET28a为模板，以引物F(SEQ ID No.6)、和引物R(SEQ IDNo.7)为引物，进行反向PCR获得mKsdD3,即SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体过程如下：

采用东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD-Plus突变体试剂盒获得3-甾酮 -Δ1-脱氢酶突变体：

(1)PCR反应体系如下：

模板(50ng/μL)	1μL
		引物F(10pmol/μL)	1.5μL
引物R(10pmol/μL)	1.5μL
		2mM dNTP	5μL
10×Buffer for iPCR	5μL
		KOD-Plus	1μL
ddH₂O	35μL

PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10sec；68℃延伸7.5min；8个循环后4℃下保存；通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带；

(2)消化PCR产物中的模板

在PCR反应液(50μL)中加入2μLDpn I，轻轻混匀后，置于37℃下反应1h；

(3)PCR产物自身环化，反应体系如下：

Dpn I处理后的PCR产物	5μL
		Ligation high	5μL
T4Polynucletide Kinase	1μL
		ddH₂O	4μL

轻轻混匀后，置于16℃下反应1h；

(4)取(3)中10μL环化产物，通过化转转入E.coli JM109中，挑取转化子，提质粒测序验证，如图1所示。经测序，突变位点已按照预设目标得到突变。 -80℃保存质粒及相关菌。

实施例2、3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的表达

将分别包含野生型KsdD3和突变体mKsdD3基因的重组载体 KsdD3-pET28a、mKsdD-pET28a分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得BL21/KsdD3 和BL21/mKsdD3重组菌。

将上述重组菌分别接于5mL LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，37℃下220r/min培养12h后，以1％的接种量接于100mL LB培养基(含有50μg/mL 卡那霉素)，待菌浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入IPTG，终溶度为0.5mM，在16℃， 160r/min下诱导24h完成发酵培养。

实施例3、3-甾酮-Δ1-脱氢酶的纯化与精制

将实施例2发酵培养完的菌液5000r/min、15min下离心收集菌体，用溶液 A(20mMTris-HCl,pH 8.0,500mM NaCl,20mM咪唑,2mM DTT)重悬后，加入溶菌酶(终溶度为200μg/mL)、IPTG(终溶度为1mM)冰上放置30min，冰上超声破碎(2s开，5s关，400W功率)，低温高速离心(4℃,18000r/min)去除细胞碎片得到上清。

Ni亲和层析：取4个开放柱(Open-Column)，并各加入1mL Ni-NTA树脂 (QIAGEN)，用20mL溶液A平衡树脂。将高速离心上清于1mL树脂置于4℃下结合40-60min。将混合液过开放柱，结合有蛋白的树脂将被截留。用20mL溶液A 漂洗树脂。最后用15mL溶液B(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,400mM 咪唑,2mM DTT)洗脱下蛋白。

离子交换层析：用GE-AKTA Pure 25L层析系统及GE-RESOURCE^TM Q阴离子交换柱实现离子交换层析使蛋白进一步得到纯化。将上述15mL洗脱液用溶液 C(20mMTris-HCl,pH8.0)稀释到150mL，通过泵上样，最后在含有0-1M NaCl 的溶液C下线性洗脱下蛋白。

通过12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定蛋白大小与纯度，得到蛋白分子量约54KDa，与DNAMAN预测一致，蛋白纯度在95％以上，如图 2所示。

实施例4、3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活测定

1、酶浓度测定

采用BCA法测定蛋白的浓度，试剂盒购自索莱宝公司。

(1)配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu 试剂(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀。

(2)稀释标准品：取10μL BSA标准品用PBS稀释至100μL(样品一般可用 PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20μL加到96 孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μL。

(3)将样品作适当稀释，加20μL到96孔板的样品孔中。

(4)各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30min。用酶标仪测定562nm 光吸收OD562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

2、酶活性测定方法

1mL酶活测定的反应体系如下：

所述雄烯二酮采用甲醇溶解，酶活测定体系中的甲醇浓度为2％；

将不含有酶液的上述反应体系置于30℃下孵育3min，加入酶液，并在30℃反应下测定3min内600nm下的吸光度变化。

空白对照：加入灭活过的酶液。

酶活性定义：1U定义为每分钟内1nM DCPIP被还原的酶，单位为nM·min^-1，酶活计算公式如下：

式中：A0、A1分别表示初始和反应结束的吸光度；

V为反应体积，为1mL；

t为反应时间，为3min；

ξ₆₀₀为消光系数，ξ₆₀₀＝18.7×10³cm^-1·M^-1。

3、野生型和突变体比酶活比较

以实施例3所述方法获得的蛋白样品为实验对象，按照实施例4测酶活的方法测得的酶活力除以该反应体系中酶含量即为比酶活，野生型与突变体比酶活如下表。

实施例5、3-甾酮-Δ1-脱氢酶对雄烯二酮催化产物HPLC鉴定

3-甾酮-Δ1-脱氢酶特异性催化雄烯二酮A环C1,2脱氢，并形成双键，生成 1,4-雄烯二酮，其催化过程示意图如图3所示。建立如下表所示的酶催化反应体系(1mL)：

所述雄烯二酮采用甲醇溶解，反应体系中的甲醇浓度为3％；

所述酶为实施例3所述方法溶液C洗脱下的脱氢酶蛋白，将1mL反应体系置于30℃下反应。用800μL乙酸乙酯萃取，取得上清600μL，并用N₂吹干，在溶于500μL甲醇中。通过HPLC测得3-甾酮-Δ1-脱氢酶野生型及突变体P139D 对雄烯二酮的不同时间的转化率变化，如图4所示。P139D较野生型对雄烯二酮的转化率提高40％左右。

HPLC检测条件如下：

色谱柱：Diamonsil 5μm C18(2),250×4.6mm；

流动相：80％甲醇,20％ddH₂O；

流速：0.6mL/min；

进样量：10μL；

紫外检测波长：241nm。

虽然本发明已以较佳实施公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 515

<212> PRT

<213> 简单节杆菌TCCC11037

<400> 1

Met Asp Trp Ala Glu Glu Tyr Asp Val Leu Val Ala Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

Gly Gly Met Ala Gly Thr Tyr Thr Ala Ala Arg Glu Gly Leu Ser Val

20 25 30

Cys Leu Val Glu Ala Gly Asp Lys Phe Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ala Trp Phe Pro Ala Asn Pro Val Leu Leu Arg Ala

50 55 60

Gly Thr Asp Asp Thr Ile Glu Asp Ala Leu Glu Tyr Tyr Arg Ala Val

65 70 75 80

Val Gly Asp Arg Thr Pro Ala Asp Leu Gln Glu Thr Tyr Val Arg Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Leu Val Ala Tyr Leu Glu Glu Asp Asp His Phe Ser Phe

100 105 110

Glu Ser Tyr Pro Trp Pro Asp Tyr Phe Gly Asp Ala Pro Lys Ala Arg

115 120 125

Arg Asp Gly Gln Arg His Ile Ile Pro Thr Pro Leu Pro Val Pro Ser

130 135 140

Ala Pro Glu Leu Arg Glu Val Val Arg Gly Pro Leu Asp Asn Asp Arg

145 150 155 160

Leu Gly Thr Pro Gln Pro Asp Asp Leu Phe Ile Gly Gly Arg Ala Leu

165 170 175

Val Ala Arg Phe Leu Thr Ala Leu Ala Thr Tyr Pro His Ala Thr Leu

180 185 190

Val Arg Glu Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Val Glu Asp Gly Val Val

195 200 205

Val Gly Ala Ile Val Glu Thr Asp Gly Val Arg Arg Ala Ile Arg Ala

210 215 220

Arg Arg Gly Val Leu Leu Ala Ala Gly Gly Phe Glu Ala Asn Asp Glu

225 230 235 240

Leu Arg Gln Lys Tyr Gly Val Pro Gly Val Ala Arg Asp Thr Met Gly

245 250 255

Pro Pro Thr Asn Val Gly Ala Ala His Gln Ala Ala Ile Ala Val Gly

260 265 270

Ala Asp Thr Asp Leu Met Gly Glu Ala Trp Trp Ser Pro Gly Leu Thr

275 280 285

His Pro Asp Gly Arg Ser Ala Phe Ala Leu Trp Phe Thr Gly Gly Ile

290 295 300

Phe Val Asp Gly Ala Gly Arg Arg Phe Val Asn Glu Ser Ala Pro Tyr

305 310 315 320

Asp Arg Leu Gly Arg Ala Val Ile Asp His Leu Thr Glu Gly Gly Val

325 330 335

Thr Pro Arg Tyr Trp Met Val Tyr Asp His Lys Glu Gly Ser Ile Pro

340 345 350

Pro Val Arg Ala Thr Asn Val Ser Met Val Asp Glu Glu Gln Tyr Val

355 360 365

Ala Ala Gly Leu Trp His Thr Ala Asp Thr Leu Pro Glu Leu Ala Ala

370 375 380

Leu Ile Gly Val Pro Ala Asp Ala Leu Val Ala Thr Val Ala Arg Phe

385 390 395 400

Asn Glu Leu Val Ala Asp Gly Tyr Asp Ala Asp Phe Gly Arg Gly Gly

405 410 415

Glu Ala Tyr Asp Arg Phe Phe Ser Gly Gly Glu Pro Pro Leu Val Ser

420 425 430

Ile Asp Glu Gly Pro Phe His Ala Ala Ala Phe Gly Ile Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Thr Lys Gly Gly Leu Arg Thr Asp Thr Ser Ala Arg Val Leu Thr

450 455 460

Ala Asp Gly Thr Pro Ile Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Met

465 470 475 480

Ala Ala Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Pro Ile Gly

485 490 495

Thr Ser Met Leu Phe Ser His Leu Ala Val Arg His Met Gly Thr Glu

500 505 510

Asp Ala Arg

515

<210> 2

<211> 1548

<212> DNA

<213> 简单节杆菌TCCC11037

<400> 2

atggactggg cagaggagta cgacgtactg gtggcgggct ccggcgccgg cggcatggcc 60

gggacctaca ccgcggcccg cgaggggctc agcgtgtgcc tggtcgaggc cggggacaag 120

ttcggcggga cgaccgccta ctccggcggc ggtggggcct ggttccccgc gaacccggtg 180

ctgctgcggg cgggcaccga cgacacgatc gaggacgctc tcgagtacta ccgagcggtc 240

gtcggcgacc gcacccccgc ggacctgcag gagacctacg tccgcggcgg cgccggcctg 300

gtcgcctacc tcgaggagga cgaccacttc tccttcgagt cctacccgtg gccggactac 360

ttcggcgacg cccccaaggc ccgtcgcgac ggccagcggc acatcatccc gacgccgctg 420

ccggtgccct ccgcacccga gctgcgcgag gtggtccgcg ggccgctcga caacgaccgg 480

ctcggcacgc cgcagcccga cgacctgttc atcggcggac gggcgctcgt cgcccgcttc 540

ctgaccgcgc tcgcgaccta cccccacgcc acgctcgtgc gcgagaccgc actggccgag 600

ctcgtcgtcg aggacggcgt cgtggtcggc gcgatcgtcg agaccgacgg cgtccgccgc 660

gcgatccggg cccgccgcgg cgtcctcctg gccgcgggcg gcttcgaggc caatgacgag 720

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gagctggccg cgctgatcgg cgtccccgcc gacgcgctgg tcgccacggt cgcgcgcttc 1200

aacgagctcg tcgccgacgg gtacgacgcg gacttcggcc gcggcggcga ggcctacgac 1260

cggttcttct ccggcggcga gccgccgctg gtgagcatcg acgaggggcc gttccacgcg 1320

gccgccttcg gcatctccga cctcggcacc aagggcgggc tgcgcaccga cacgtccgcg 1380

cgcgtgctga ccgcggacgg cacgccgatc gggggcctct acgcagccgg caatacgatg 1440

gcggcgccga gcggcaccac ctacccgggc ggtggcaacc cgatcgggac aagcatgctc 1500

ttcagccacc tcgccgtgcg gcacatgggc accgaggacg cgcgatga 1548

<210> 3

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Trp Ala Glu Glu Tyr Asp Val Leu Val Ala Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

Gly Gly Met Ala Gly Thr Tyr Thr Ala Ala Arg Glu Gly Leu Ser Val

20 25 30

Cys Leu Val Glu Ala Gly Asp Lys Phe Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ala Trp Phe Pro Ala Asn Pro Val Leu Leu Arg Ala

50 55 60

Gly Thr Asp Asp Thr Ile Glu Asp Ala Leu Glu Tyr Tyr Arg Ala Val

65 70 75 80

Val Gly Asp Arg Thr Pro Ala Asp Leu Gln Glu Thr Tyr Val Arg Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Leu Val Ala Tyr Leu Glu Glu Asp Asp His Phe Ser Phe

100 105 110

Glu Ser Tyr Pro Trp Pro Asp Tyr Phe Gly Asp Ala Pro Lys Ala Arg

115 120 125

Arg Asp Gly Gln Arg His Ile Ile Pro Thr Asp Leu Pro Val Pro Ser

130 135 140

Ala Pro Glu Leu Arg Glu Val Val Arg Gly Pro Leu Asp Asn Asp Arg

145 150 155 160

Leu Gly Thr Pro Gln Pro Asp Asp Leu Phe Ile Gly Gly Arg Ala Leu

165 170 175

Val Ala Arg Phe Leu Thr Ala Leu Ala Thr Tyr Pro His Ala Thr Leu

180 185 190

Val Arg Glu Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Val Glu Asp Gly Val Val

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Val Gly Ala Ile Val Glu Thr Asp Gly Val Arg Arg Ala Ile Arg Ala

210 215 220

Arg Arg Gly Val Leu Leu Ala Ala Gly Gly Phe Glu Ala Asn Asp Glu

225 230 235 240

Leu Arg Gln Lys Tyr Gly Val Pro Gly Val Ala Arg Asp Thr Met Gly

245 250 255

Pro Pro Thr Asn Val Gly Ala Ala His Gln Ala Ala Ile Ala Val Gly

260 265 270

Ala Asp Thr Asp Leu Met Gly Glu Ala Trp Trp Ser Pro Gly Leu Thr

275 280 285

His Pro Asp Gly Arg Ser Ala Phe Ala Leu Trp Phe Thr Gly Gly Ile

290 295 300

Phe Val Asp Gly Ala Gly Arg Arg Phe Val Asn Glu Ser Ala Pro Tyr

305 310 315 320

Asp Arg Leu Gly Arg Ala Val Ile Asp His Leu Thr Glu Gly Gly Val

325 330 335

Thr Pro Arg Tyr Trp Met Val Tyr Asp His Lys Glu Gly Ser Ile Pro

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Pro Val Arg Ala Thr Asn Val Ser Met Val Asp Glu Glu Gln Tyr Val

355 360 365

Ala Ala Gly Leu Trp His Thr Ala Asp Thr Leu Pro Glu Leu Ala Ala

370 375 380

Leu Ile Gly Val Pro Ala Asp Ala Leu Val Ala Thr Val Ala Arg Phe

385 390 395 400

Asn Glu Leu Val Ala Asp Gly Tyr Asp Ala Asp Phe Gly Arg Gly Gly

405 410 415

Glu Ala Tyr Asp Arg Phe Phe Ser Gly Gly Glu Pro Pro Leu Val Ser

420 425 430

Ile Asp Glu Gly Pro Phe His Ala Ala Ala Phe Gly Ile Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Thr Lys Gly Gly Leu Arg Thr Asp Thr Ser Ala Arg Val Leu Thr

450 455 460

Ala Asp Gly Thr Pro Ile Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Met

465 470 475 480

Ala Ala Pro Ser Gly Thr Thr Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Pro Ile Gly

485 490 495

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500 505 510

Asp Ala Arg

515

<210> 4

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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ggtacctata cagccgcacg cgaaggcctg agtgtgtgcc tggttgaagc cggcgacaaa 120

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gttgcctatc tggaagaaga cgaccacttc agcttcgaga gttacccgtg gccggattac 360

tttggcgatg caccgaaagc acgtcgtgac ggccagcgcc acattattcc gaccgatctg 420

cctgttccga gcgcacctga attacgtgaa gtggttcgtg gcccgctgga taatgatcgt 480

ttaggcaccc cgcagccgga tgacctgttt attggcggtc gcgccctggt ggcccgtttt 540

ctgaccgcac tggccacata cccgcatgcc accctggtgc gtgaaacagc cctggccgaa 600

ctggtggttg aagacggtgt ggtggttggt gccattgttg aaaccgacgg tgtgcgccgt 660

gcaattcgtg cacgccgtgg cgttctgtta gccgccggtg gtttcgaggc aaatgatgag 720

ctgcgccaga aatatggcgt tccgggtgtg gcccgtgata ccatgggtcc gcctaccaat 780

gttggtgccg cccatcaggc agccattgca gtgggtgccg acacagacct gatgggtgaa 840

gcctggtgga gcccgggtct gacccatcct gacggtcgca gcgcctttgc cctgtggttt 900

accggcggta tctttgtgga cggtgcaggt cgtcgcttcg tgaatgaaag cgccccgtat 960

gatcgtctgg gccgcgcagt tattgatcac ctgaccgagg gcggtgttac accgcgctat 1020

tggatggtgt acgaccacaa ggaaggcagc attcctccgg tgcgtgccac caacgtgagc 1080

atggtggacg aagaacagta tgtggccgcc ggtttatggc acaccgccga taccctgccg 1140

gaactggcag cactgattgg tgttccggcc gatgcactgg ttgccacagt ggcccgtttc 1200

aacgaactgg tggccgacgg ttatgatgca gactttggcc gcggtggcga ggcctatgat 1260

cgttttttca gcggtggcga gccgccgctg gttagcattg atgaaggccc gtttcacgca 1320

gcagcctttg gcatcagcga tctgggcacc aaaggcggtc tgcgtaccga caccagtgca 1380

cgcgttctga ccgccgatgg caccccgatt ggtggtctgt atgcagccgg caacaccatg 1440

gcagcaccga gtggcaccac ctatccgggt ggcggtaatc cgattggcac cagcatgctg 1500

ttcagccacc tggccgtgcg tcacatgggt accgaagatg cccgctaa 1548

<210> 5

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggactggg ccgaggaata tgatgtgctg gttgcaggta gcggtgccgg cggtatggca 60

ggtacctata cagccgcacg cgaaggcctg agtgtgtgcc tggttgaagc cggcgacaaa 120

ttcggcggca ccacagccta tagtggtggt ggcggtgcct ggtttcctgc caacccggtg 180

ctgttacgtg ccggtaccga cgataccatc gaagacgcac tggagtacta tcgtgccgtg 240

gttggcgatc gcacccctgc agatctgcag gaaacctatg tgcgcggtgg cgcaggtctg 300

gttgcctatc tggaagaaga cgaccacttc agcttcgaga gttacccgtg gccggattac 360

tttggcgatg caccgaaagc acgtcgtgac ggccagcgcc acattattcc gaccccgctg 420

cctgttccga gcgcacctga attacgtgaa gtggttcgtg gcccgctgga taatgatcgt 480

ttaggcaccc cgcagccgga tgacctgttt attggcggtc gcgccctggt ggcccgtttt 540

ctgaccgcac tggccacata cccgcatgcc accctggtgc gtgaaacagc cctggccgaa 600

ctggtggttg aagacggtgt ggtggttggt gccattgttg aaaccgacgg tgtgcgccgt 660

gcaattcgtg cacgccgtgg cgttctgtta gccgccggtg gtttcgaggc aaatgatgag 720

ctgcgccaga aatatggcgt tccgggtgtg gcccgtgata ccatgggtcc gcctaccaat 780

gttggtgccg cccatcaggc agccattgca gtgggtgccg acacagacct gatgggtgaa 840

gcctggtgga gcccgggtct gacccatcct gacggtcgca gcgcctttgc cctgtggttt 900

accggcggta tctttgtgga cggtgcaggt cgtcgcttcg tgaatgaaag cgccccgtat 960

gatcgtctgg gccgcgcagt tattgatcac ctgaccgagg gcggtgttac accgcgctat 1020

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atggtggacg aagaacagta tgtggccgcc ggtttatggc acaccgccga taccctgccg 1140

gaactggcag cactgattgg tgttccggcc gatgcactgg ttgccacagt ggcccgtttc 1200

aacgaactgg tggccgacgg ttatgatgca gactttggcc gcggtggcga ggcctatgat 1260

cgttttttca gcggtggcga gccgccgctg gttagcattg atgaaggccc gtttcacgca 1320

gcagcctttg gcatcagcga tctgggcacc aaaggcggtc tgcgtaccga caccagtgca 1380

cgcgttctga ccgccgatgg caccccgatt ggtggtctgt atgcagccgg caacaccatg 1440

gcagcaccga gtggcaccac ctatccgggt ggcggtaatc cgattggcac cagcatgctg 1500

ttcagccacc tggccgtgcg tcacatgggt accgaagatg cccgctaa 1548

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatctgcctg ttccgagcgc acc 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtcggaata atgtggcgct gg 22

Claims

1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQID No.4所示。

4.权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体或权利要求3所述的基因的用途。

5.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体或宿主细胞。

6.如权利要求5述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pET28a(+)，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。