CN107177607A

CN107177607A - 枯草芽孢杆菌bs04的尿酸氧化酶基因及其用途

Info

Publication number: CN107177607A
Application number: CN201710473772.0A
Authority: CN
Inventors: 孙文秀; 李伟; 陈洪娜
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了一种来自枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途，属于生物技术领域。本发明获得枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，申请GenBank序列号为KX388349，且本发明的枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因的重组蛋白能够高效降解尿酸，酶活力相比其它来源的尿酸氧化酶要高很多，耐热性较好，为其商品化生产提供理论基础。

Description

枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，从枯草芽孢杆菌BS04中克隆到尿酸氧化酶基因，该基因能够在体外稳定表达，并产生活性较高的尿酸氧化酶。

背景技术

尿酸酶又称尿酸氧化酶(Uricase or Urate oxidase)，是动物嘌呤代谢过程中的一种重要的酶，是以分子氧作为受体，在嘌呤代谢中有重要的作用，能催化尿酸氧化，生成尿囊素、CO₂和H₂O₂。尿酸氧化酶在生物界中广泛存在，除人类和一些高等灵长目动物外，绝大多数生物体内(包括古细菌、细菌、真菌、放线菌、植物、鱼类和大多数非灵长目哺乳动物)都能产生具有生物活性的尿酸氧化酶。而人类在进化的过程中因尿酸氧化酶基因发生无义突变，不能合成尿酸氧化酶进而失去分解尿酸的能力，使尿酸成为人类嘌呤代谢的最终产物，造成人的血尿酸水平较其它哺乳动物高。高浓度的尿酸是人类罹患高尿酸血症、痛风及其相关疾病的元凶。现今用于治疗痛风及相关疾病的药物主要是别嘌呤醇、秋水仙碱等化学药物，具有严重的副作用，这促使人们寻找更安全高效的降尿酸药物。

尿酸氧化酶由于降解尿酸的高效率而受到人们的关注，由最初从黄曲霉中提取尿酸氧化酶用于医疗，到现在采用基因工程技术来重组表达尿酸氧化酶，这使得尿酸氧化酶的研究发展迅速。由于从微生物中直接提取尿酸氧化酶周期长、易污染、产量低、纯度不高，而利用基因重组获得尿酸氧化酶则可以克服上述缺点。为此，有学者将黄曲霉的尿酸氧化酶基因重组到大肠杆菌中，也有学者将其重组到酿酒酵母中，出现了有酶活性、但表达量低、提纯难度大等问题。

近年来，关于尿酸氧化酶的相关研究均有报道，但在实际生产过程中酶活性低、热稳定性差，限制了其在治疗高尿酸血症及痛风相关疾病中的应用。枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中，生长周期短，繁殖速度快，从中分离鉴定尿酸氧化酶基因并表达，获得纯化蛋白，无疑为获取高表达高活性的尿酸氧化酶提供了新的途径，具有潜在的市场价值和应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种来自枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途，该基因能够在体外稳定表达，并产生活性较高的尿酸氧化酶。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，该尿酸氧化酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，申请GenBank序列号为KX388349。

优选地，如上所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，该基因能够在体外稳定表达，产生的尿酸氧化酶酶比活力约为36.65U/mg。

优选地，如上所述的所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，所述该基因通过体外重组获得重组蛋白的方法包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的克隆：采用CTAB法提取枯草芽孢杆菌BS04的基因组DNA，根据GenBank数据库中已报道的尿酸氧化酶基因的序列，设计1对特异引物Uri-F和Uri-R，以基因组DNA为模板，Uri-F和Uri-R为引物，进行PCR扩增获得枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因，所述的Uri-F为5’-ATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；所述的Uri-R为5’-GGCTTTCAGGCTC-3’。

PCR扩增产物用胶回收试剂盒(Tiangen gel extraction kit)进行PCR产物的回收和纯化，再与pEASY-T1载体(Takara)连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序。测序结果表明，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的核苷酸序列见SEQID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。该尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，并申请GenBank序列号为KX388349。

(2)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体的构建：根据枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的基因序列和原核表达载体PET-28a(+)的多克隆位点，设计1对特异性引物Uri-P-F和Uri-P-R，分别在上、下游引物添加了EcoRⅠ和NotI酶切位点，以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-P-F和Uri-P-R为引物，进行PCR扩增，将PCR产物和PET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体PET-Uri；

所述Uri-P-F为5’-CCCGAATTCATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；

所述Uri-P-R为5’-TTGCGGCCGCGGCTTTCAGGCTC-3’。

(3)重组蛋白的诱导表达、纯化：将步骤(2)得到的PET-Uri转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取阳性转化子于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.1mmol/L，培养4h；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况。

将阳性重组菌以1％的接种量添加到含有氨苄青霉素的培养基中，大量培养，诱导表达，离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集上清，上样、结合、洗脱，获得纯化的重组蛋白。

优选地，如上所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BS04，已于2014年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2014294。

(4)重组蛋白生物活性的测定及其性质测定：参照Koyama等的方法，测定枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因重组蛋白的生物活性、最适作用PH值、最适作用温度及热稳定性。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

(1)本发明采用分子生物学的方法，分离鉴定了枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因。

(2)利用基因工程技术，构建了枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白。

(3)该重组蛋白能够高效降解尿酸，酶活力相比其它来源的尿酸氧化酶要高很多，且耐热性较好，为其商品化生产提供理论基础。

附图说明

图1为重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析图，其中Ck1：空质粒菌株；ck2：未诱导的尿酸氧化酶基因重组菌株；1：IPTG诱导的尿酸氧化酶基因重组菌株；2：亲和层析纯化的尿酸氧化酶；M：蛋白分子量标准。

图2为枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶最适反应pH值研究结果。

图3为枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶最适反应温度研究结果。

图4为枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶热稳定性研究结果。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BS04)，于2013年分离自湖北省荆州市辣椒根际土壤中，已保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2014294。

实施例1枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的克隆

采用CTAB法提取枯草芽孢杆菌BS04的基因组DNA，根据GenBank数据库中已报道的尿酸氧化酶基因的序列，设计1对特异引物Uri-F(5’-ATGTTCACAATGGATGACCTG-3’)和Uri-R(5’-GGCTTTCAGGCTC-3’)，以基因组DNA为模板，Uri-F和Uri-R为引物，进行PCR扩增获得枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因。

PCR反应程序为PCR反应体系：ddH₂O(16.2μL)，10×buffer(2.5μL)，dNTP(2μL)，Uri-F(1μL)，Uri-R(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.3μL)，总体积25μL。PCR反应程序：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min 15s，共35个循环；最后72℃延伸7min。PCR扩增产物用胶回收试剂盒(Tiangen gel extraction kit)进行PCR产物的回收和纯化，再与pEASY-T1载体(Takara)连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序。测序结果表明，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。该尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，并申请GenBank序列号为KX388349。

实施例2枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体的构建

根据枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的基因序列和原核表达载体PET-28a(+)的多克隆位点，设计1对特异性引物Uri-P-F(5’-CCCGAATTCATGTTCACAATGGATGACCTG-3’)和Uri-P-R(5’-TTGCGGCCGCGGCTTTCAGGCTC-3’)，分别在上、下游引物添加了EcoRⅠ和NotI酶切位点。以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-P-F和Uri-P-R为引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系：ddH₂O(16.2μL)，10×buffer(2.5μL)，dNTP(2μL)，Uri-P-F(1μL)，Uri-P-R(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.3μL)，总体积25μL。PCR反应程序：94℃ 4min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min 15s，共35个循环；最后72℃延伸7min。将PCR产物与原核表达载体PET-28a(+)同时进行EcoRⅠ和XhoI双酶切，分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5a，在含有氨苄青霉素(50ug/mL)的平板上进行抗性筛选。挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中进行培养，37℃、220r/m，培养8h后用质粒提取试剂盒提取质粒，采用质粒PCR和双酶切的方法验证重组质粒，已成功构建重组表达载体，命名为PET-Uri。

实施例3重组蛋白的诱导表达和纯化

取1ng重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL的氨苄青霉素平板上进行37℃过夜培养。挑取阳性转化子于含50μg/mL的氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃、200r/min摇培至指数生长期后添加IPTG，使终浓度为0.1mmol/L培养4h。离心收集菌体进行超声波破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达结果，重组蛋白分子量大约为60kDa。

将阳性重组菌按1％比例进行扩大培养，IPTG诱导重组表达，4℃、1200r/min离心收集菌体，加入裂解液(250mmol/L氯化钠，20mmol/L Tris，HCL调PH至8.4)，冰浴超声破碎，离心收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析融合蛋白的表达形式。收集上清并用0.45μm滤膜过滤，进行Ni-NTA亲和层析，先用20mmol/L咪唑充分洗去杂蛋白，然后用200mmol/L咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱,收集纯化的尿酸氧化酶重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果表明，可看到大小为60kDa的单一条带，与预期结果基本一致，结果见图1。

实施例4重组蛋白生物活性的测定

参照Koyama等的方法，在25℃，取3mL pH值为8.4的硼酸缓冲液中溶解的120μmol/L尿酸溶液，置于1cm石英比色杯中，加入适量尿酸氧化酶溶液，充分混匀，准确反应5min，以硼酸缓冲液为空白，用UV-1601PC紫外分光光度计在293nm处测定吸光值的减少量。活力单位：该条件下每分钟催化1umol尿酸生成尿囊素所需酶量为1个单位(IU)。其计算公式为：

U＝(ΔA×VT×df)/(12.2×VE)

式中，U为每毫升尿酸酶活力单位数；ΔA为每分钟293nm波长下的光密度下降值；VT为反应液总体积(mL)；df为稀释倍数；12.6为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；VE为酶液体积(mL)。

结果表明，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的酶活力约为0.8554U/mL，比活力约为36.65U/mg，明显高于目前报道的相关尿酸氧化酶的活力。

实施例5重组蛋白的最适反应PH值

分别在pH值为6.0、7.0的磷酸盐缓冲液，pH值为8.0、8.4、9.0的硼酸盐缓冲液，pH值为9.5、10.1、10.5、10.8的碳酸盐缓冲液中配置不同pH值的尿酸底物，25℃条件下，取0.06mL纯化的尿酸氧化酶分别在与3mL不同pH值环境尿酸底物反应过程中，测定尿酸底物在293nm处3min内的吸光度变化并计算其酶活力，得到枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的反应pH值－相对活力曲线图，从而确定尿酸氧化酶的最适反应pH值，结果见图2。结果显示，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的最适反应pH值在8.0～9.5。

实施例6重组蛋白的最适反应温度

取0.05mL纯化的尿酸氧化酶分别与在4、25、37、45、53、60、70℃的温度条件下温育的3mL pH 9.0硼酸缓冲液中溶解的120μmol/L尿酸底物反应，精确测定反应过程中尿酸底物在293nm处理3min内的吸光度变化并计算其酶活力，得到尿酸氧化酶的反应温度－相对活力曲线图，从而确定尿酸氧化酶的最适反应温度，结果见图3。结果表明，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的最适反应温度是25～53℃。

实施例7重组蛋白的热稳定性

取0.05mL纯化尿酸氧化酶溶液分别置于30、40、50、60℃条件下处理5、15、30、60min，热处理完毕后立即冰浴，然后在25℃下与3mL pH 9.0硼酸缓冲液中溶解的120μmol/L尿酸溶液反应测定其剩余酶活力，得到尿酸氧化酶的热处理－相对活力曲线图，从而确定尿酸氧化酶的热稳定性，结果见图4。结果显示，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶在40℃经过60min热处理活力剩余67.12％，耐热性较好。

SEQ ID NO:1

<110> 长江大学

<120> 枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌BS04（bacillus subtilis）

<400> 1

atgttcacaa tggatgacct gaaccaaatg gacacacaaa cactgacaga cacacttggc 60

tctatttttg aacactcttc atggattgcg gagagatccg cagcactacg gccgttttcg 120

tccctttctg atcttcaccg caaaatgact ggcattgtaa aagccgcgga tcgcgagaca 180

cagcttgatt taatcaaaaa gcatccccgg ctcggaacaa agaaaacaat gagcgatgac 240

tcggtacgag agcagcagaa cgcggggctc agcaaattag aacagcagga atacgaggag 300

tttctcatgc tgaatgaaca ctattatgat cgcttcggct ttccttttat tttagcggtg 360

aagggaaaga cgaaacagga cattcaccaa gccctgctgg caaggcttga gagcgaacga 420

gaaacggagt tccagcaggc ccttatagaa atttaccgaa tcgcccgctt tcgtctggct 480

gacatcatca ctgaaaaagg agagacgcaa atgaaaagaa ctatgtctta tggcaaagga 540

aatgtatttg cataccgaac gtttttaaaa ccgctcactg gagtgaagca aatcccagaa 600

tcatcttttg ccgggagaag caataccgtt gtcggtgttg atgtgacatg cgaaattggc 660

ggagaagcct tcctgccatc atttacagac ggagacaata ctctcgtcgt ggcgacggat 720

tcaatgaaaa actttatcca gcgccatctc gcatcctatg aaggaacgac aaccgagggg 780

ttcctacact atgtagctca ccgattttta gatacctatt ctcatatgga caagatcact 840

ctgactggcg aagacattcc gtttgaagca atgcctgcat acgaggagaa agagcttagc 900

acaagccgcc tcgtcttcag aagatcgcgt aatgaacgaa gccgctctgt gctgaaagca 960

gaacgaagcg ggaataccat aacgattaca gagcaataca gcgaaatcat ggatcttcag 1020

ctcgtcaagg tgagcggcaa ctccttcgtc ggcttcatcc gggacgaata tacgactctc 1080

ccggaagacg gcaaccgccc gctgtttgtc tatttaaaca tcagctggca atatgaaaat 1140

accaatgacg catacgcttt tgatccatcc cgctacgttg cggctgaaca agtccgcgac 1200

ttagcgagca ccgtttttca cgagctcgaa accccttcaa tccaaaactt aatctatcat 1260

atcggctgca gaatattagc gaggttcccg cagctcactg atgtcagctt ccaatctcaa 1320

aatcacacgt gggatacggt tgtcgaagaa atcccgggct caaaaggaaa agtctacacc 1380

gaaccgcgcc cgccatacgg tttccaacat tttaccgtga caagagaaga cgccgagaaa 1440

gaaaaacaga aagccgctga aaaatgtcgg agcctgaaag cctga 1485

<210> 2

<211> 494

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌BS04（Bacillus subtilis）

<400> 2

Met Phe Thr Met Asp Asp Leu Asn Gln Met Asp Thr Gln Thr Leu Thr

1 5 10 15

Asp Thr Leu Gly Ser Ile Phe Glu His Ser Ser Trp Ile Ala Glu Arg

20 25 30

Ser Ala Ala Leu Arg Pro Phe Ser Ser Leu Ser Asp Leu His Arg Lys

35 40 45

Met Thr Gly Ile Val Lys Ala Ala Asp Arg Glu Thr Gln Leu Asp Leu

50 55 60

Ile Lys Lys His Pro Arg Leu Gly Thr Lys Lys Thr Met Ser Asp Asp

65 70 75 80

Ser Val Arg Glu Gln Gln Asn Ala Gly Leu Ser Lys Leu Glu Gln Gln

85 90 95

Glu Tyr Glu Glu Phe Leu Met Leu Asn Glu His Tyr Tyr Asp Arg Phe

100 105 110

Gly Phe Pro Phe Ile Leu Ala Val Lys Gly Lys Thr Lys Gln Asp Ile

115 120 125

His Gln Ala Leu Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu Arg Glu Thr Glu Phe

130 135 140

Gln Gln Ala Leu Ile Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Arg Phe Arg Leu Ala

145 150 155 160

Asp Ile Ile Thr Glu Lys Gly Glu Thr Gln Met Lys Arg Thr Met Ser

165 170 175

Tyr Gly Lys Gly Asn Val Phe Ala Tyr Arg Thr Phe Leu Lys Pro Leu

180 185 190

Thr Gly Val Lys Gln Ile Pro Glu Ser Ser Phe Ala Gly Arg Ser Asn

195 200 205

Thr Val Val Gly Val Asp Val Thr Cys Glu Ile Gly Gly Glu Ala Phe

210 215 220

Leu Pro Ser Phe Thr Asp Gly Asp Asn Thr Leu Val Val Ala Thr Asp

225 230 235 240

Ser Met Lys Asn Phe Ile Gln Arg His Leu Ala Ser Tyr Glu Gly Thr

245 250 255

Thr Thr Glu Gly Phe Leu His Tyr Val Ala His Arg Phe Leu Asp Thr

260 265 270

Tyr Ser His Met Asp Lys Ile Thr Leu Thr Gly Glu Asp Ile Pro Phe

275 280 285

Glu Ala Met Pro Ala Tyr Glu Glu Lys Glu Leu Ser Thr Ser Arg Leu

290 295 300

Val Phe Arg Arg Ser Arg Asn Glu Arg Ser Arg Ser Val Leu Lys Ala

305 310 315 320

Glu Arg Ser Gly Asn Thr Ile Thr Ile Thr Glu Gln Tyr Ser Glu Ile

325 330 335

Met Asp Leu Gln Leu Val Lys Val Ser Gly Asn Ser Phe Val Gly Phe

340 345 350

Ile Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Pro Glu Asp Gly Asn Arg Pro Leu

355 360 365

Phe Val Tyr Leu Asn Ile Ser Trp Gln Tyr Glu Asn Thr Asn Asp Ala

370 375 380

Tyr Ala Phe Asp Pro Ser Arg Tyr Val Ala Ala Glu Gln Val Arg Asp

385 390 395 400

Leu Ala Ser Thr Val Phe His Glu Leu Glu Thr Pro Ser Ile Gln Asn

405 410 415

Leu Ile Tyr His Ile Gly Cys Arg Ile Leu Ala Arg Phe Pro Gln Leu

420 425 430

SEQ ID NO:3

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<400> 3

atgttcacaa tggatgacct g 21

SEQ ID NO:4

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<400> 4

ggctttcagg ctc 13

SEQ ID NO:5

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<400> 5

cccgaattca tgttcacaat ggatgacctg 30

SEQ ID NO:6

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<400> 6

ttgcggccgc ggctttcagg ctc 23

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：该尿酸氧化酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，申请GenBank序列号为KX388349。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：该基因能够在体外稳定表达，并产生高活性的尿酸氧化酶。

3.如权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：所述该基因通过体外重组获得重组蛋白的方法包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的克隆：以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-F和Uri-R为引物，进行PCR扩增，扩增产物回收和纯化，再与pEASY-T1载体连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序，获得枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因；

所述的Uri-F为5’-ATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；

所述的Uri-R为5’-GGCTTTCAGGCTC-3’；

(2)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体的构建：以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-P-F和Uri-P-R为引物，进行PCR扩增，将PCR产物和PET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体PET-Uri；

所述Uri-P-F为5’-CCCGAATTCATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；

所述Uri-P-R为5’-TTGCGGCCGCGGCTTTCAGGCTC-3’；

(3)重组蛋白的诱导表达、纯化：将步骤(2)得到的PET-Uri转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性转化子于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.1mmol/L，培养4h；

(4)重组蛋白的活力测定：将步骤(3)获得的重组蛋白，参照Koyama等的方法，测定其酶比活力约为36.65U/mg。

4.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BS04，已于2014年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2014294。