CN116059267A

CN116059267A - 一种枯草芽孢杆菌iob430发酵后生元粉的制备方法及应用

Info

Publication number: CN116059267A
Application number: CN202310199984.XA
Authority: CN
Inventors: 韩雪梅; 梁武; 王海宽; 付田民; 孙韵琪; 刘晴晴
Original assignee: Tianjin Inncorigin Biological Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Inncorigin Biological Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-06
Filing date: 2023-03-06
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2043-03-06
Also published as: CN116059267B

Abstract

本发明提供一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法及应用，依据该方法所得到的生物酵技术产品，以及其在制备降尿酸相关药物中的应用，通过实验获得了枯草芽孢杆菌IOB430的最佳活化、培养和发酵的最优条件参数，以小扁豆粉为发酵原料，获得了枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品，经实验验证，枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品对高尿酸血症大鼠关节肿胀有显著的改善作用，降低高尿酸血症中的黄嘌呤氧化酶活力效果较为显著，显著降低高尿酸血症大鼠血脂中的TG、TC水平，明显的降低血液中的ALT、AST活力，减轻肝细胞发生损害，有效保护肝细胞，且效果均优于枯草芽孢杆菌IOB430单纯菌粉。

Description

一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法，以及其在制备降尿酸相关药物中的应用。

背景技术

近年来，由于益生菌安全性高、无耐药性及对宿主健康的影响被人们所熟知，已被广泛应用于食品加工和人类健康等多个领域，目前已有研究表明，益生菌具有增强免疫力、改善肠道功能、缓解代谢性疾病等作用。

高尿酸血症是体内嘌呤代谢紊乱导致血尿酸浓度的异常增高的一种代谢性疾病，特征是血液中尿酸水平异常升高，可引发多种并发症，如慢性肾脏疾病、心血管疾病和痛风等，威胁人体健康。目前使用的抗高尿酸血症的药物主要包括：秋水仙碱、苯溴马隆、别嘌呤醇、黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制剂等，对降低血清尿酸有一定的疗效，但是长期使用会存在一定的耐药性和副作用。因此，提供一种具有安全、无副作用，又能缓解高尿酸血症和痛风的产品十分必要。

因此，随着对益生菌等微生态制剂的研究不断深入，使用益生菌、后生元等微生态制剂调节肠道微生态，提高肠道免疫力，可促进体内尿酸从肠道排出，缓解高尿酸血症，成为了降尿酸的有效、安全手段。

然而，目前一些关于枯草芽孢杆菌的功能研究主要涉及以下几个方面：改善宿主肠道内的微生物平衡（中国专利申请，CN202111601933 .2，公开日：CN114214241A，公开日：20220322）；应用到抗炎、屏障功能及抵抗肠毒性大肠杆菌对肠道损伤中（中国专利申，CN202111166134 .7，公开号：CN113773997A，公开日：20211210）；枯草芽孢杆菌及其制备具有调节肠道功能的普洱茶方法（中国专利申请，CN201810912284 .X，公开号：CN108998393A，公开日：20181214），并未见有枯草芽孢杆菌在降尿酸方面应用报道。因此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉的制备方法，以及其在降尿酸方面的应用，对高尿酸血症具有显著的作用效果，带来重要科研和临床应用价值，有利于开发一款能够缓解高尿酸血症病症且不损害人体健康的产品。

发明内容

本发明使用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）IOB430是自主筛选获得，筛选自发酵大豆酱中，此菌株已经进行了菌株保藏和理化指标的检测，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16024，于2020年01月08日在中国食品发酵工业研究院有限公司进行了细菌鉴定检测，菌落为浅黄色、圆形、表面干燥、半透明、边缘不整齐的菌落。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法，依据该方法所得到的生物酵技术产品，以及其在制备降尿酸相关药物中的应用。

第一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法，具体步骤为：

（1）枯草芽孢杆菌IOB430（保藏编号CGMCC No.16024）菌株活化和培养；

（2）用所述活化后的枯草芽孢杆菌IOB430发酵，制备其灭活后生元粉；

（3）对所述后生元粉进行纳豆激酶活性测定。

进一步地，所述步骤（1）中，菌株活化方法为使用营养肉汤固态培斜面培养基在36±2℃环境中活化，活化时间为14-24h。

进一步地，所述步骤（1）中，菌株活化时间优选为20h。

进一步地，所述步骤（1）中，菌株培养方法为使用营养肉汤液体培养基在36±2℃环境下，置于摇床中，通气培养，培养时间为4-24h。

进一步地，所述步骤（1）中，培养时间优选为16-20h。

进一步地，所述步骤（2）中，发酵原料为小扁豆粉，菌种接种步骤中，料水比范围是1：1.75-2，接种量为1×106-5×107 CFU/g，发酵时间为24-36h。

进一步地，所述步骤（2）中，菌种接种步骤中，料水比优选为1：1.75，接种量优选为5×10⁷CFU/g，发酵时间优选为32h。

进一步地，所述步骤（2）中，发酵反应后将样品进行高温干燥，条件为80-100℃，时间24-48h。

进一步地，所述步骤（2）中，将所述干燥后的样品进行超微粉碎，粉碎后进行包装，即为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉成品。

进一步地，所述步骤（3）中，采用紫外分光光度计法检测发酵产生的纳豆激酶的活性进行检测。

进一步地，所述步骤（3）中，样品中纳豆激酶 X（FU/g）按以下公式计算为： X=（A-A0）/(0.01×60×0.1)×D，式中：A为样品液吸光度，A0为空白管吸光度，D为样品的稀释率，其计算方法为定容体积（mL）/称样量（g）。

进一步地，还包括步骤（4），验证枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症的改善作用。

进一步地，所述步骤（4）中，具体实验操作为：

（a）取4-5周龄、体重220±5g的SPF级昆明雄性大鼠若干只，随机分成5组：空白组、模型组、实验1组、实验2组、实验3组，每组10只；

（b）鼠房控制温度 (22±2) ℃，湿度40%-60%，12 h昼夜循环，自由饮食饮水，定期清洗鼠笼，基础饲料适应性饲养5天；

（c）5天后模型组、实验1组、实验2组、实验3组每天上午灌胃给予氧嗪酸钾造模，用量为2.5g/kg，按照10 ml/kg 体重的剂量进行灌胃；

（d）连续灌胃1周后眼内呲取血用磷钨酸法测定血清尿酸水平。

（e）制备大鼠高尿酸血症模型后，空白组与模型组灌胃给予10mL/kg生理盐水，实验1组、实验2组、实验3组每天以0.83ml/kg的剂量分别给予未发酵的小扁豆粉、枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉和枯草芽孢杆菌IOB430菌粉干预4周；

（f）在0天、7天、14天、28天进行相关指标的检测。

进一步地，所述步骤（f）中，检测指标为包括大鼠的体重、毛色、粪便、关节、尿酸。

进一步地，所述步骤（f）中，体重指标检测时间为每周同一时间，尿酸测定前进行大鼠隔夜禁食不禁水12h。

第二方面，本发明提供一种利用上述枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法所得到的枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品。

第三方面，本发明提供上述枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品在制备降尿酸相关药物中的应用。

进一步地，所述降尿酸相关药物为治疗高尿酸血症的药物。

技术效果：

（1）本发明提供一种枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉的制备方法，通过实验获得了枯草芽孢杆菌IOB430的最佳活化、培养和发酵的条件参数，为后续领域内对该菌种的进一步开发利用提供了便捷的实验参考，促进了对枯草芽孢杆菌IOB430的发酵和发酵产品开发。

（2）以小扁豆粉为发酵原料，获得了枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品，为领域内，针对高尿酸病症改善的微生物保健产品的开发研究，提供了优异的产品选择，该产品经过验证，具有明确高效的降尿酸功效，且效果均优于枯草芽孢杆菌IOB430单纯菌粉，有望替代药物，成为对患者身体负担更小的保健康复型药品，改善高尿酸血症，提升全民健康水平。

（3）经验证，枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品对高尿酸血症大鼠关节肿胀有显著的改善作用，降低高尿酸血症中的黄嘌呤氧化酶活力效果较为显著，显著降低高尿酸血症大鼠血脂中的TG、TC水平，明显的降低血清中的ALT、AST活力，减轻肝细胞发生损害，有效保护肝细胞。通过小规模人群实验，发现枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对降低血尿酸的含量具有一定的帮助，且效果均优于枯草芽孢杆菌IOB430单纯菌粉。因此，通过以小扁豆粉为原料进行草芽孢杆菌IOB430的发酵，得到的发酵产品具有显著的降低尿酸、改善关节病症、护肝的功效潜能，是可以大规模开发、工业生产并创造价值的优异微生物发酵制品。

附图说明

图1：本发明的不同组别大鼠体重变化；

图2：本发明的不同组别尿酸值变化；

图3：本发明的不同组别关节变化；

图4：本发明的不同组别黄嘌呤氧化酶活力；

图5：本发明的不同组别大鼠TC、TG的变化；

图6：本发明的不同组别大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶的变化。

枯草芽孢杆菌IOB430分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16024。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：枯草芽孢杆菌IOB430菌粉的制备

枯草芽孢杆菌IOB430菌粉的制备方法如下：（1）菌株活化：将菌株按1：20接种于活化培养基中，36±2℃，静置，密闭，培养20h，即得一级种子液，将一级种子按1：25接种于活化培养基中，36±2℃，静置，密闭，培养20h，即得二级种子液；一级培养基为蛋白胨10g，牛肉膏粉 3g，氯化钠 5g，使用蒸馏水1000ml溶解配置，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。（2）发酵：按照1：50的接种量，将培养好的二级种子液接种到灭好菌的发酵液培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，37℃，密闭培养28h，即得发酵液；发酵液培养基为：蛋白胨 10g，牛肉膏粉 3g，氯化钠 5g，使用蒸馏水1000ml溶解配置，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0-7.2，然后121℃灭菌25min。（3）菌粉：发酵液培养基离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得枯草芽孢杆菌IOB430菌粉。

实施例2：枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆粉的工艺流程及参数

1.菌株活化

（1）将冻存管中的菌株接种至斜面培养基中，并放置到36±2℃环境下培养，观察不同培养时间的菌落形态，菌体特征。其中，斜面培养基使用营养肉汤固态培养基，其配方为：蛋白胨 10g，牛肉膏粉 3g，氯化钠5g，琼脂 15g，使用蒸馏水1L溶解配置，并调节pH至7.2±0.2。

（2）观察菌生长状态（菌种子形态），结果如表1，菌株活化培养要求斜面培养基上的菌种子个体均匀，形态一致，粗壮，由表1可知，培养时间为20h的斜面种子较符合条件，所以斜面种子的最佳培养时间为20h。

表1 不同培养时间种子的生长情况

2.活化培养基种龄的确定：

（1）取一环新鲜的斜面菌株接种于装有营养肉汤液体培养基的三角瓶中，在36±2℃条件下放置于摇床中，通气培养。

（2）于不同培养时间取样镜检，测定活菌浓度并观察记录，结果表2。

（3）由图1和表2所知，培养时间16~20h，菌体处于对数生长期的后期，此时菌体活力旺盛，浓度较高，芽孢的形成率较高，故选择活化种子的最佳种龄为16~20h。

表2 不同培养时间种子的镜检结果

3.发酵培养基参数的确定

（1）枯草芽孢杆菌IOB430在固体培养基上能获得的最高活菌数作为菌株生长活力的判断指标，采用不同料水比、接种量、固体发酵时间作为变量探究最佳培养条件，结果如表3-表5所示。

（2）随着料水比的增加，菌株的活性也逐渐增加，但是料水比在1：1.75-2之间菌株活性变化较小，固选择最佳料水比为1：1.75，菌株活性为2.43±0.16×10⁹CFU/g；最佳的接种量为5×10⁷CFU/g，最高活性为6.32±0.17×10⁹CFU/g；最佳培养时间为32h，最高的活菌数为4.23±0.15×10¹⁰CFU/g。

表3 料水比的确定

表4 接种量的确定

表5 培养时间的确定

实施例3：干燥24h制备枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉

（1）根据实施例确定的最佳发酵条件（斜面种子的最佳培养时间为20h，活化种子的最佳种龄为16~20h，最佳料水比为1：1.75，最佳的接种量为5×10⁷CFU/g，最佳培养时间为32h）进行实验，最终获得发酵样品，将样品进行高温干燥，具体的干燥条件为80-100℃，干燥24h，将干燥后的样品进行超微粉碎，粉碎后进行包装，即为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉成品。

（2）在后处理过程中未添加任何添加剂、稳定剂、保护剂，整个产品只包含发酵原料，本申请获得的产品属于生物类发酵技术产品。

实施例4：干燥32h制备枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉

（1）根据实施例确定的最佳发酵条件（斜面种子的最佳培养时间为20h，活化种子的最佳种龄为16~20h，最佳料水比为1：1.75，最佳的接种量为5×10⁷CFU/g，最佳培养时间为32h）进行实验，最终获得发酵样品，将样品进行高温干燥，具体的干燥条件为80-100℃，干燥36h，将干燥后的样品进行超微粉碎，粉碎后进行包装，即为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉成品。

实施例5：干燥48h制备枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉

（1）根据实施例确定的最佳发酵条件（斜面种子的最佳培养时间为20h，活化种子的最佳种龄为16~20h，最佳料水比为1：1.75，最佳的接种量为5×10⁷CFU/g，最佳培养时间为32h）进行实验，最终获得发酵样品，将样品进行高温干燥，具体的干燥条件为80-100℃，干燥48h，将干燥后的样品进行超微粉碎，粉碎后进行包装，即为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉成品。

实施例6：枯草芽孢杆菌IOB430灭活后生元粉的纳豆激酶活性测定：枯草芽孢杆菌IOB430在发酵过程中会产生纳豆激酶，本实验采用紫外分光光度计法检测发酵产生的纳豆激酶的活性进行检测。

检测原理：纳豆粉中的纳豆激酶与纤维蛋白发生反应，使纤维蛋白肽键水解。水解反应使溶液在紫外光275nm处吸光度发生变化。用紫外分光光度计测定水解反应前后吸光度的变化，通过换算间接得出纳豆激酶的活力，单位用FU表示。一个活力单位（1 FU）是指在275nm下，使吸光度值每增加0.01时消耗的酶量。

样品检测方法：

（1）将1.4 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液和0.4 mL 0.96％纤维蛋白原溶液加至10mL 离心管中，37±0.5℃水浴中孵育5 min。取出加入0.1 mL 凝血酶溶液并均匀混合。至37±0.5℃水浴中孵育10 min。取出加入0.1 mL 样品溶液，涡旋混合5 s，至37±0.5℃水浴中孵育60 min。在分别达到孵育20 min 和40 min 时间点时，分别取出在涡旋混合器上再均匀混合5 s 后，继续孵育。至反应60 min 时，加入2 mL 0.2 mol/L TCA 终止反应液。将加过终止反应液的样品管继续混合均匀5s后，于37℃±0.5℃继续孵育20 min，使终止反应完全。取出样品液进高速离心机，在12000 rpm 条件下离心10 min。用移液管小心移取2 mL上清液至比色皿中，并于275 nm 处测定吸光度（A）。

（2）设置空白对照：将1.4 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液和0.4 mL 0.96％纤维蛋白原溶液加至10mL 离心管中，37±0.5℃水浴中孵育5 min。取出加入0.1 mL 凝血酶溶液并均匀混合。至37±0.5℃水浴中孵育10 min。取出加入2mL 0.2 mol/L TCA 终止反应液，均匀混合5s。加0.1 mL 样品溶液，均匀混合5 s 后，放入37℃±0.5℃水浴中孵育20 min。取出样品液进高速离心机，在12000 rpm 条件下离心10 min。用移液管小心移取2 mL 上清液至比色皿中，并于275 nm 处测定吸光度（A）。

（3）样品中纳豆激酶 X（FU/g）按以下公式计算：

X=（A-A0）/(0.01×60×0.1)×D；

式中：A——样品液吸光度；A0——空白管吸光度；D——样品的稀释率，其计算方法为定容体积（mL）/称样量（g）

检测结果：根据以上检测方法，本发明获得的纳豆激酶的活性为9600FU/g。

实施例7：枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症的改善作用

（1）实验材料：选择的实验鼠为4-5周龄SPF级昆明雄鼠，体重220±5g。实验1组的材料为未发酵的小扁豆粉，实验2组的材料为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉，实验3组的材料为枯草芽孢杆菌IOB430菌粉

（2）小鼠建模与分组：

取4-5周龄、体重220±5g的SPF级昆明雄鼠若干只，随机分成5组（每组10只）：空白组、模型组、实验1组、实验2组，实验3组。

鼠房控制温度 (22±2) ℃，湿度40%-60%，12h昼夜循环，自由饮食饮水，定期清洗鼠笼，基础饲料适应性饲养5天，5天后模型组、实验1组、实验2组，实验3组每天上午灌胃给予氧嗪酸钾 (2.5g/kg) 造模，按照10 ml/kg 体重的剂量进行灌胃，连续灌胃1周后眼内呲取血用磷钨酸法测定血清尿酸水平。

制备大鼠高尿酸血症模型后，空白组与模型组灌胃每天给予10mL/kg生理盐水，实验1组、实验2组和实验3组每天以0.83ml/kg的剂量分别给予未发酵的小扁豆粉、枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉、枯草芽孢杆菌IOB430菌粉干预4周，分别在0天、7天14天、28天进行相关指标的检测。

（3）数据监测方法

（a）大鼠形态观察：观察大鼠的体重、毛色、粪便、关节情况等。

（b）大鼠体重的测定：试验开始后，每周同一时间对小鼠体重进行测定。

（c）大鼠尿酸的测定：试验开始后，每周测定前大鼠隔夜禁食不禁水12h，测定其尿酸值。

（d）大鼠血液及组织采集：试验结束时，4组大鼠均隔夜禁食12h后称重，采用眼球取血法收集血液标本，断颈处死。解剖并迅速取出肝脏和肾脏于冰冷的生理盐水中冲洗。将血液样品在 4 ℃条下3000×g 离心10 min，并收集血清置于-80 ℃保存备用。

（e）肝脏中相关指标的测定：肝脏组织于0.1mmol/L 磷酸盐缓冲溶液按质量比1∶10的比例混匀，用匀浆机进行匀浆，10000×g 离心10min，收集上清液，按照试剂盒说明书的步骤测定肝脏中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。

（f）血清指标的测定：利用试剂盒对血清中的相关指标进行测定。

（g）血脂指标的测定：利用试剂盒对血脂中的相关指标进行测定。

（4）实验结果

（a）大鼠形态：通过观察大鼠的活动和精神情况，空白组、模型组、实验1组、实验2组和实验3组的大鼠活动正常，精神状态良好。表明大鼠食用未发酵的小扁豆粉、枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉和枯草芽孢杆菌IOB430菌粉后，小鼠精神状态较好。

（b）大鼠体重：如图1所示，试验期间大鼠的死亡率为零，各组大鼠在试验期间均有所增加，且增加趋势一致，并且相同时间，空白组和实验组大鼠体重接近，没有显著差异。枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症大鼠的体重具有轻微的缓解作用。

（c）大鼠尿酸：如图2所示，经枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉灌胃高尿酸血症大鼠后，与模型组相比尿酸含量存在明显的下降趋势，进一步说明能够降低大鼠的尿酸含量。

（d）大鼠关节变化：如图3所示，对比不同组别大鼠关节变化趋势发现，与模型组相比，枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉实验组大鼠关节肿胀度明显下降。上述结果表明，与模型组相比，枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症大鼠关节肿胀有显著的改善作用。

（e）大鼠黄嘌呤氧化酶活力：如图4所示，枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉干预大鼠后，高尿酸血症大鼠黄嘌呤氧化酶活力明显下降。这表明枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症中的黄嘌呤氧化酶活力降低效果较为显著。

（f）大鼠血脂指标：由图5可知，与正常组大鼠相比，模型组大鼠总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）显著增高。利用枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉干预大鼠后，显著降低高尿酸血症大鼠血脂中的TG、TC水平，可有效降低肝脏中血脂的积累，表明枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉有助于调节高尿酸血症引起的血脂异常。

（g）大鼠肝功能指标：由图6可知，

血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）是分布于肝细胞浆和线粒体中的酶，机体处于正常情况下，血液中的ALT、AST维持在一个较低水平，但当机体肝细胞受损或坏死，ALT和AST转移至血液中。因此，血液中ALT、AST活力的升高可作为机体肝细胞发生损害的指标。由图可知，与正常组大鼠相比，模型组大鼠谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）显著增高。利用枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对大鼠进行灌胃发现，可以明显的降低血液中的ALT、AST活力，减轻肝细胞发生损害，有效保护肝细胞。

实施例7：小规模人群应用实验

（1）筛选30人具有高尿酸症的人群进行小规模的人群应用实验，其中男性15人，女性15人。人群选择的标准为男性血尿酸水平≥420umol/L，女性的血尿酸≥360umol/L。试验样品为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉，服用剂量为5g/次，一日两次，试验期间一切饮食照旧，饭后2h服用试验样品，试验周期为4周。检测血尿酸的时间为饭前半小时。

表6 小规模人群血尿酸结果统计

（2）通过以上小规模人群试验结果表明，服用枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对降低血尿酸的含量具有一定的帮助。

综上所述，本实验研究了枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症的影响。结果表明，枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对降低高尿酸血清中尿酸水平、黄嘌呤氧化酶活力效果较好，可以改善高尿酸血症关节肿胀等相关指标，同时还可以降低血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和血脂总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，且效果均优于枯草芽孢杆菌IOB430单纯菌粉，这为辅助治疗高尿酸血症提供了一定的药理学依据，同时为开发枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉的新产品提供了思路。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范。

Claims

1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IOB430发酵后生元粉的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

步骤（1）枯草芽孢杆菌IOB430（保藏编号CGMCC No.16024）菌株活化和培养；

步骤（2）用所述活化后的枯草芽孢杆菌IOB430发酵，制备其灭活后生元粉；

步骤（3）对所述后生元粉进行纳豆激酶活性测定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，菌株活化方法为：使用营养肉汤固态培斜面培养基在36±2℃环境中活化，活化时间为14-24h。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：菌株活化时间为20h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，菌株培养方法为：使用营养肉汤液体培养基在36±2℃环境下，置于摇床中，通气培养，培养时间为4-24h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，培养时间为16-20h。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，发酵原料为小扁豆粉，菌种接种步骤中，料水比范围是1：1.75-2，接种量为1×10⁶-5×10⁷CFU/g，发酵时间为24-36h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述步骤（2）中，菌种接种步骤中，料水比为1：1.75，接种量为5×10⁷CFU/g，发酵时间为32h。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，发酵反应后将样品进行高温干燥，条件为80-100℃，时间24-48h。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将所述干燥后的样品进行超微粉碎，粉碎后进行包装，即为枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉成品。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，采用紫外分光光度计法检测发酵产生的纳豆激酶的活性进行检测。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，样品中纳豆激酶X（FU/g）按以下公式计算为：X=（A-A0）/(0.01×60×0.1)×D，式中：A为样品液吸光度，A0为空白管吸光度，D为样品的稀释率。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤（4），验证枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉对高尿酸血症的改善作用。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，具体实验操作为：

（c）5天后，模型组、实验1组、实验2组、实验3组每天上午灌胃给予氧嗪酸钾造模，用量为2.5g/kg，按照10 ml/kg 体重的剂量进行灌胃；

（d）连续灌胃1周后眼内呲取血用磷钨酸法测定血清尿酸水平;

（e）制备大鼠高尿酸血症模型后，空白组与模型组灌胃给予10mL/kg生理盐水，实验1组、实验2组和实验3组每天以0.83ml/kg的剂量分别给予未发酵的小扁豆粉、枯草芽孢杆菌IOB430发酵小扁豆后生元粉和枯草芽孢杆菌IOB430菌粉干预4周；

（f）在0天、7天、14天、28天进行相关指标的检测。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述（f）中，检测指标为包括大鼠的体重、毛色、粪便、关节、尿酸。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于：所述（f）中，体重指标检测时间为每周同一时间，尿酸测定前进行大鼠隔夜禁食不禁水12h。

16.一种根据利用权利要求1-15任一项所述的方法制备得到的枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品。

17.一种根据利用权利要求1-15任一项所述的方法制备得到的枯草芽孢杆菌IOB430发酵后生元粉产品在制备降尿酸相关药物中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于：所述降尿酸相关药物为治疗高尿酸血症的药物。