CN109820088B - 一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用，涉及小麦胚芽蛋白衍生物技术领域，本发明所述小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，以小麦胚芽粉为原料进行碱提酸沉得到小麦胚芽蛋白，再以链霉蛋白酶或蛋白酶N对得到的小麦胚芽蛋白进行酶解，从而得到小麦胚芽蛋白水解物。试验表明，本发明提供的小麦胚芽蛋白水解物具有显著的抗幽门螺旋杆菌粘附胃粘膜细胞的活性，可用于预防幽门螺旋杆菌感染。与现有药物相比，具有天然、安全、价格低廉、高效、温和、不易产生耐药菌等优点。本发明将为小麦加工副产品提供新的利用途径，增加小麦加工的附加值。

Description

一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及小麦胚芽蛋白衍生物技术领域，尤其涉及一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用。

背景技术

1、中国小麦胚芽深加工及综合利用概况

小麦是世界播种面积最大、产量最多、分布最广的粮食作物，同时中国是小麦产量第一大国，年产量在一亿吨以上。然而，在小麦加工成面粉的过程中，小麦胚芽的存在会影响面粉的加工品质、烘焙品质以及储存期，因此，小麦胚芽是小麦加工业的主要副产物之一。中国每年的小麦胚芽产量在300万吨左右。长期以来，由于开发技术等问题的限制，中国小麦胚芽资源一直没有得到合理的利用，利用率低于10％，造成了极大的资源浪费。

近年来，小麦胚芽的加工利用主要以提取小麦胚芽油为主，但是脱脂后的小麦胚芽蛋白粕(约占小麦胚芽组成的30％)一直没有找到很好的开发途径。因此，有效利用小麦胚芽蛋白资源、拓宽其应用范围、提高其商品价值、尤其是开发其在功能食品和保健品行业中的应用，对小麦胚芽蛋白的深加工及综合利用具有重要意义。

2、食品组分抑制致病菌粘附活性研究的国内外概况

致病菌一般通过粘附素(adhesin)特异性识别宿主细胞膜表面受体，进而粘附于宿主细胞，如图1(a)所示。细菌粘附被认为是引起细菌感染的第一步也是必要的前提条件(Savage,1977)。另外，致病菌粘附细胞后，可以抵挡人体自身的净化机制(排泄、咳嗽、打喷嚏等)、躲避免疫系统的攻击、更容易吸收宿主细胞提供的营养，有利于致病菌在人体内存活和繁殖(Ofek and Doyle,1994)。因此，抑制致病菌粘附对于保证人类健康具有重要意义。

利用抗粘附剂干扰致病菌粘附宿主细胞的方法称为抗粘附疗法(anti-adhesivetherapy)，目前的抗粘附疗法研究领域，大多是利用细胞膜受体类似物(receptoranalogs)，一般是糖或糖复合物，作为抗粘附剂，由于致病菌表面和细胞表面都带净负电荷(静电排斥作用)，因此，细胞膜受体类似物更有利于与致病菌结合，进而抑制致病菌粘附细胞，这也是研究最深入的抗粘附活性机理，如图1(b)所示(Ofek et al.,2003)。与抗生素方法相比，抗粘附疗法更加安全且温和，因为抗粘附剂不会杀灭致病菌或抑制其生长(Karlsson,1998)。

3、食品组分抑制幽门螺旋杆菌(H.pylori)粘附的研究意义和进展

幽门螺旋杆菌(H.pylori)特异性地与胃粘膜上皮细胞粘附，是公认的慢性胃炎与消化性溃疡病的重要致病因子之一，也可能与胃癌，胃粘膜相关性淋巴瘤的发病密切相关，世界卫生组织将其列为I类致癌因子。H.pylori在全球自然人群的感染率超过50％，中国人群感染率为50～70％。机体感染H.pylori后，一般难以自行清除，若不采取根除治疗，将终生携带。

目前，最常采用的根除H.pylori的方法是抗生素治疗，但随着H.pylori对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多毒副作用(Suerbaum andMichetti,2002；Amieva and El-Omar,2008；欧阳军,2012)。因此，为了防止H.pylori感染、保持人类胃肠道菌群健康，抑制H.pylori粘附胃粘膜上皮细胞是最有潜力和发展前景的方法之一。

瑞巴派特，化学名为2-(4-氯苯甲酰胺基)-3-(1,2-二氢-2-氧代-4-喹啉基)丙酸，是一种辅助治疗H.pylori感染的药物。研究表明该药物可以抑制H.pylori粘附至胃黏膜上皮细胞、减少氧化应激、降低H.pylori产生的细胞因子浓度等，进而起到辅助治疗H.pylori感染的疗效。但是，瑞巴派特的摄入也会引起许多不良反应，例如：可引起白细胞减少、也有血小板减少的报道；危害精神神经系统；引起胃肠道不适、肝功能异常、内分析系统代谢紊乱、过敏反应等。

近20年，鉴定和分离食品组分用于抑制H.pylori粘附胃粘膜上皮细胞的研究取得一定进展，但大部分研究处于体外活性测定阶段且近期研究成果较少。

等(1995)首先证明人乳中的κ酪蛋白具有抑制H.pylori粘附人胃粘膜的活性，并推测可能的抗粘附机理为：κ酪蛋白中的海藻糖基部分与胃粘膜表面的糖基受体相似，因此可以与胃粘膜表面受体竞争H.pylori，进而抑制H.pylori粘附胃粘膜。接下来，科研工作者采用体外实验发现了更多具有抗H.pylori粘附活性的食品组分，例如：蔓越莓中的高分子非透析性物质、牛乳中高分子量乳清蛋白、植物多糖和豌豆活性肽(Camesano,2007；Wittschier etal,2009；康慧,2009；Niehues et al,2010；Inngjerdingen et al,2014)。

另外，在以小鼠作为动物模型的试验中，牛乳中唾液酸化的糖复合物显示了抑制H.pylori粘附和定植于小鼠胃粘膜表面的活性(Wang et al.,2001)。当利用猕猴作为动物模型时，人乳和牛乳中分离出的唾液酸乳糖钠盐降低了H.pylori在一些猕猴(6只中的3只)胃粘膜上定植的数量，但不是对所有实验猕猴均有效(Mysore et al.,1999)。此外，临床实验表明唾液酸乳糖钠盐没有减轻H.pylori在人胃粘膜上的粘附和定植(Parente et al.,2003)。

因而，进一步研究和开发更高效、低成本的具有抑制H.pylori粘附胃粘膜上皮细胞活性的食品组分仍然十分必要。

发明内容

本发明为了克服现有抗生素疗法治疗幽门螺旋杆菌感染的毒副作用大、耐药性逐年上升的问题，提供了一种小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，该方法制备得到的小麦胚芽蛋白水解物具有显著的抗幽门螺旋杆菌粘附胃粘膜细胞的活性，同时具有成本低、安全性好等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将小麦胚芽粉以pH值为9～10的碱性溶液提取，固液分离，所得上清液为碱提取液；

(2)将碱提取液的pH值调节为3.5～4.5，静置，固液分离，所得沉淀为小麦胚芽蛋白；

(3)以蛋白酶对所述小麦胚芽蛋白酶解2.5～5h，固液分离，所得上清液干燥，得到小麦胚芽蛋白水解物；

所述蛋白酶包括链霉蛋白酶或蛋白酶N。

优选的，步骤(1)所述碱性溶液的提取次数为2～4次，所述碱性溶液每次提取的时间独立的为20～50min。

优选的，步骤(1)所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

优选的，步骤(2)所述酸性溶液的提取次数为2～4次，所述酸性溶液每次提取的时间独立的为30～60min。

优选的，步骤(2)所述酸性溶液选自盐酸溶液、磷酸溶液或醋酸溶液。

优选的，步骤(3)所述小麦胚芽蛋白与蛋白酶的质量比为1～5:80～120。

本发明提供了一种上述技术方案所述制备方法得到的小麦胚芽蛋白水解物。

本发明提供一种上述技术方案所述小麦胚芽蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用。

优选的，所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂为功能性食品或营养品。

优选的，所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的剂型包括片剂、口服液、颗粒剂或胶囊剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，通过碱提酸沉、蛋白酶水解的方式制备得到。本发明制备得到的小麦胚芽蛋白水解物具有抗幽门螺旋感觉粘附胃粘膜上皮细胞的活性，本发明探索了小麦胚芽蛋白衍生物的新功能，以期扩大小麦胚芽蛋白的应用领域、开发深度和新的资源利用途径，实现小麦加工业副产物的有效增殖。

(2)与抗生素疗法相比，本发明制备得到的小麦胚芽蛋白水解物作为抗粘附试剂来源天然、安全，治疗/预防幽门螺旋杆菌感染方法温和，不易产生耐药菌。与现有药物瑞巴派特相比，本发明制备得到的小麦胚芽蛋白水解物抑制幽门螺旋杆菌粘附的效果更佳，其制备成本更低，可用于功能性食品或营养品中。

附图说明

图1为黏附素特异性识别宿主细胞的机制示意图；其中：

(a)细菌粘附宿主细胞：细菌表面疏水性分子

与细胞磷脂分子

形成疏水相互作用，克服细菌和细胞表面的静电排斥力；细菌通过粘附素

特异性识别宿主细胞膜表面受体(■)，进而粘附于宿主细胞；

(b)细胞膜受体类似物与细菌粘附素结合，抑制细菌粘附宿主细胞；

图2为实施例2中菌落浓度与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线；

图3为实施例2中FITC荧光强度值与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将小麦胚芽粉以pH值为9～10的碱性溶液提取，固液分离，所得上清液为碱提取液；

(2)将碱提取液的pH值调节为3.5～4.5，静置，固液分离，所得沉淀为小麦胚芽蛋白；

(3)以蛋白酶对所述小麦胚芽蛋白酶解2.5～5h，固液分离，所得上清液干燥，得到小麦胚芽蛋白水解物；

所述蛋白酶包括链霉蛋白酶或蛋白酶N。

本发明以小麦胚芽粉为原料制备小麦胚芽蛋白水解物，所述小麦胚芽粉来源于市售商品，也可以选择脱脂的小麦胚芽粉作为制备原料。本发明对此无特殊限定。

本发明将小麦胚芽粉以pH值为9～10的碱性溶液提取，固液分离，所得上清液为碱提取液。小麦胚芽粉中富含多种蛋白，不同的浸提条件、蛋白质凝聚与分离条件等均会影响最终得到的蛋白组成。本发明选择pH值为9～10的碱性溶液对小麦胚芽粉进行提取，有利于富集其中酶解后具有抗幽门螺旋杆菌活性的蛋白。在本发明中，所述碱性溶液的pH值优选为9.5。

在本发明中，所述小麦胚芽粉的质量与碱性溶液的体积之比优选为1g：8～15L；更优选为1g:10～12L。在本发明中，所述碱性溶液提取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次提取时的碱性溶液添加量按照上述小麦胚芽粉与碱性溶液的料液比即可；每次提取的时间独立的优选为20～50min，更优选为30～40min。

在本发明中，所述碱性溶液优选的包括但不限于氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

本发明对所述固液分离的方式无特殊限定，采用本领域已知的固液分离方式即可。在本发明的具体实施例中，采用离心对碱性溶液提取后的混合物进行固液分离，其离心的转速为4000rpm，离心时间为10min。

得到碱提取液后，本发明将碱提取液的pH值调节为3.5～4.5，静置，固液分离，所得沉淀为小麦胚芽蛋白。本发明将碱性提取液的pH值调节为3.5～4.5，对碱性提取液中的蛋白进行沉淀，以富集能够分解为具有抗幽门螺旋杆菌粘附的蛋白。在本发明中，所述酸性溶液的pH值优选为4.0。

本发明优选的，所述调节pH值为3.5～4.5的过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为300～600rpm，进一步优选为400rpm。搅拌能够加速蛋白沉淀的速率。

在本发明中，所述酸性溶液提取的次数优选为2～4次，更优选为3次；在本发明中，每次酸性溶液提取的时间独立的为30～60min，更优选为40～50min。

在本发明中，所述酸性溶液优选的包括但不限于盐酸溶液、磷酸溶液或醋酸溶液。

本发明对所述固液分离的方式无特殊限定，采用本领域已知方式即可。如本发明的具体实施例所示，固液分离方式采用离心方式，其离心的转速为4000rpm，离心时间为10min。

得到小麦胚芽蛋白后，本发明以蛋白酶对所述小麦胚芽蛋白酶解2.5～5h，固液分离，所得上清液干燥，得到小麦胚芽蛋白水解物；所述蛋白酶包括链霉蛋白酶或蛋白酶N。本发明采用链霉素蛋白酶或蛋白酶N对所得小麦胚芽蛋白进行酶解，均可得到具有抗幽门螺旋杆菌粘附的水解产物，并且其抗幽门螺旋杆菌粘附的活性均优于现有药物。

在本发明中，所述小麦胚芽蛋白与蛋白酶的质量比优选为1～5:80～120，更优选为2～3:100。在本发明中，所述酶解的时间优选为3～4.5h，更优选为4h。本发明在酶解完成后优选的采用高温法终止酶解反应。本发明对所述的链霉蛋白酶或蛋白酶N的来源无特殊限定，采用市售商品即可。

在本发明中，当所述蛋白酶选择链霉蛋白酶时，其酶解温度优选为48～52℃，更优选为50℃；其酶解的pH值优选为7.0～7.8，更优选为7.5。在本发明中，当所述蛋白酶选择蛋白酶N时，其酶解温度优选为52～58℃，更优选为55℃；其酶解的pH值优选为7.0～7.8，更优选为7.5。

本发明所述小麦胚芽蛋白水解物的制备方法操作简单、原料来源广泛、易于获得、成本低、安全环保，是一种更为天然的抗幽门螺旋杆菌粘附的活性成分。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法得到的小麦胚芽蛋白水解物。

本发明还提供了上述技术方案所述小麦胚芽蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用。本发明研究表明，当本发明所述小麦胚芽蛋白水解物先与幽门螺旋杆菌混合后，再与胃粘膜上皮细胞接触，幽门螺旋杆菌的粘附抑制率显著优于现有药物瑞巴派特；而当本发明所述小麦胚芽蛋白水解物先与胃肠粘膜上皮细胞混合，再与幽门螺旋杆菌接触后，本发明所述小麦胚芽蛋白水解物对幽门螺旋杆菌的粘附无抑制作用。因而含有幽门螺旋杆菌粘附抑制剂主要是作为功能性食品或营养品使用，以防止食物中可能含有的幽门螺旋杆菌粘附在胃粘膜上皮细胞中。

在本发明中，所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的剂型包括但不限于片剂、口服液、颗粒剂或胶囊剂。本发明对所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的具体剂型制备的方式无特殊限定，采用本领域已知方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实验材料及试剂：

实验采用市售脱脂小麦胚芽粉。异硫氰酸荧光素(FITC)、无水乙醇、氯化钠。蛋白酶N购于日本Amano Pharmaceutical Co.，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

链酶蛋白酶(Pronase)来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、胰蛋白酶-EDTA消化液、1×PBS缓冲液和青链霉素混合液(100X)购于北京索莱宝科技有限公司。

胰蛋白胨、大豆蛋白胨、磷酸氢二钾，胎牛血清(FBS Premium)购于PAN-Seratech。DMEM basic(1X)培养基、盐酸、氢氧化钠，从Thermo Fisher Scientific购买。

脱纤维绵羊血购于北京飞默生物科技有限公司。实验室自制蒸馏水。

人胃粘膜上皮细胞(GES-1细胞)购买于南京科佰生物科技有限公司。

实施例1链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物的制备

采用碱提酸沉法从脱脂小麦胚芽粉中提取小麦胚芽蛋白。称取100g脱脂小麦胚芽粉，加入1L去离子水(w/v＝1:10)，在400rpm转速搅拌的状态下用1M氢氧化钠调节pH至9.5，搅拌30min后4000rpm的转速下离心10min，收集上清液。所得沉淀重复上述步骤处理一次，合并两次上清液，在400rpm转速搅拌的状态下用1M盐酸调节溶液pH至4.0，搅拌30min，静置20min，在4000rpm的转速下离心10min，收集沉淀。沉淀用200mLpH4.0的去离子水洗涤3次，用50mL去离子水分散沉淀，并调节pH至7.0，冷冻干燥后得到的物质即是小麦胚芽蛋白。

称取小麦胚芽蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至链酶蛋白酶的最适作用pH值7.5，于恒温水浴锅中加热至链酶蛋白酶的最适作用温度50℃。然后，加入20mg链酶蛋白酶，在50℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1M NaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g，10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物。

实施例2链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性检测

实验准备：

(1)幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)的培养

由于H.pylori(

43504^TM)是模式菌株，因而本发明选择此菌株作为抗粘附活性实验菌株。

将冻存的H.pylori菌株37℃解冻后首先以#18液体培养基混悬，得到幽门螺旋杆菌混合液。将该混合液随后接种到添加5％脱纤维绵羊血的#260斜面培养基上，在微需氧环境(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)37℃条件下培养48～72小时，得到幽门螺旋杆菌菌液(H.pylori菌液)，所得菌液可用于抗粘附活性检测和菌种传代。

#18液体培养基的配制方法为：称取17克胰蛋白胨、3克大豆蛋白胨、5克氯化钠和2.5克磷酸氢二钾，加入1L蒸馏水，搅拌溶解后调节pH至7.2，121℃灭菌1小时。

添加5％去纤维绵羊血的#260斜面培养基配制方法：称取15克胰蛋白胨、5克大豆蛋白胨、5克氯化钠、15克琼脂和950mL蒸馏水，搅拌溶解后调节pH至7.2，121℃灭菌1小时。当培养基冷却到约47℃时，加入50mL无菌的脱纤维绵羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基。

(2)菌落浓度与菌悬液光密度值(OD₆₀₀)标准曲线的建立

将步骤(1)中得到的H.pylori菌液进行4次10倍梯度稀释获得5种不同浓度的菌液，在600nm下测定不同菌浓度的H.pylori菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线。

在600nm下测定H.pylori菌液的OD值依次为0.5027、0.0537、0.0043和0.0003，同时通过平板涂布法计算其相对应的菌落浓度为3.63×10⁹cfu/mL、3.63×10⁸cfu/mL、3.63×10⁷cfu/mL和3.63×10⁶cfu/mL，建立菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线，结果见图2。

(3)人胃粘膜上皮细胞(GES-1)的培养

无抗生素的细胞培养基的配制：按照体积比9:1的比例将DMEM培养基和胎牛血清混合，即得。

细胞培养基的配制：向无抗生素的细胞培养基中添加其总质量1％的青链霉素，即得。

将1mL冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后，首先加入到10mL细胞培养基中，混匀后在1,000rmp转速下离心4min，弃掉上清液，重新加入4～5mL新鲜的细胞培养基后轻轻吹打细胞，细胞分散均匀后，移入T25细胞培养瓶中。在37℃、5％CO₂条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代。消化细胞悬液，以每孔200μL接种到96孔板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜后，吸出旧培养基，再加入200μL不含抗生素的细胞培养基，在37℃，5％CO₂条件下继续孵育24小时后用于抗H.pylori粘附活性测定实验。

(4)小麦胚芽蛋白水解物抗H.pylori粘附GES-1细胞的活性测定

A、异硫氰酸荧光素(FITC)标记H.pylori

首先，配制浓度为2mg/mL FITC的DMSO溶液，尼龙膜过滤。与浓度约为2.2×10¹⁰cfu/mL(OD₆₀₀值为1.2)的H.pylori菌液按照体积比1:1进行混合，在生化摇摆台上避光混合30min后，4,500g离心3min，弃掉上清液后，用1×PBS缓冲液洗涤三次去除多余的FITC，最后用#18液体培养基稀释菌液至OD₆₀₀值为0.2左右(约2×10⁹cfu/mL)，待用。

B、FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线的建立

将步骤A中FITC标记的H.pylori菌液梯度稀释六个浓度，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值，同时在600nm下测定OD值，进而建立FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线。

将FITC标记的H.pylori菌液梯度稀释六个浓度，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值，分别为12511、6990、4012、2020和1046，同时在600nm下测定OD值，分别为0.0127、0.0087、0.0050、0.0017、0.0013，进而建立FITC荧光强度值与OD₆₀₀标准曲线，结果见图3。

①.小麦胚芽蛋白水解物与H.pylori优先混合

将实施例1制备得到的链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物溶解于不含抗生素的细胞培养基中，使链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物在培养基中的浓度分别为0.16g/L、0.31g/L、0.63g/L、1.25g/L、2.50g/L、5.00g/L和10.00g/L，PVDF膜过滤，作为各试验组；同时设置不添加链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物的作为对照组。

将试验组或对照组的溶液分别与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的幽门螺旋杆菌菌液按照体积比1:1混合，混匀后避光室温静置30min，得到第一混合液。

随后，将步骤(3)中准备好的96孔板中的GES-1细胞用200μL 1×PBS缓冲液冲洗一次，每孔加入100μL第一混合液中，在微需氧环境(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)37℃条件下培养90min，弃掉上清液，用200μL 1×PBS缓冲液冲洗三次。

最后，每孔加入100μL PBS缓冲液，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值。根据步骤(4)中建立的“FITC荧光强度值与OD₆₀₀的标准曲线”(如图3所示)，通过荧光强度值计算OD₆₀₀值，再根据步骤(2)中建立的“幽门螺旋杆菌菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线”(如图2所示)，求出粘附于GES-1细胞表面的H.pylori菌落浓度，结果见表1。

粘附抑制率用下列公式计算：

粘附抑制率(％)＝(阴性对照组细胞粘附的菌落浓度-实验组细胞粘附的菌落浓度)/阴性对照组细胞粘附的菌落浓度×100

表1不同浓度链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

②小麦胚芽蛋白水解物与GES-1细胞优先混合

首先，将步骤(3)中准备好的96孔板中的GES-1细胞用200μL 1×PBS缓冲液冲洗一次，每孔加入100μL试验组或对照组溶液，在微需氧环境(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)37℃条件下培养30min。

吸出液体，每孔再加入100μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的幽门螺旋杆菌菌液，在微需氧环境(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)37℃条件下培养90min，弃掉上清液，用200μL 1×PBS缓冲液冲洗三次。

最后，每孔加入100μL PBS缓冲液，分别在激发波长485nm和发射波长530nm下测量荧光强度值。根据步骤(4)中建立的“FITC荧光强度值与OD₆₀₀的标准曲线”(如图3所示)，通过荧光强度值计算OD₆₀₀值，再根据步骤(2)中建立的“幽门螺旋杆菌菌落浓度与OD₆₀₀的标准曲线”(如图2所示)，求出粘附于GES-1细胞表面的H.pylori菌落浓度。粘附抑制率用下列公式计算：

粘附抑制率(％)＝(阴性对照组细胞粘附的菌落浓度-实验组细胞粘附的菌落浓度)/阴性对照组细胞粘附的菌落浓度×100

结果表明，所有检测浓度的链酶蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物均不具有抗H.pylori粘附活性。

实施例3蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物的制备

采用碱提酸沉法从脱脂小麦胚芽粉中提取小麦胚芽蛋白。称取100g脱脂小麦胚芽粉，加入1L去离子水(w/v＝1:10)，在400rpm转速搅拌的状态下用1M氢氧化钠调节pH至9.5，搅拌30min后4000rpm的转速下离心10min，收集上清液。所得沉淀重复上述步骤处理一次，合并两次上清液，在400rpm转速搅拌的状态下用1M盐酸调节溶液pH至4.0，搅拌30min，静置20min，在4000rpm的转速下离心10min，收集沉淀。沉淀用200mLpH4.0的去离子水洗涤3次，用50mL去离子水分散沉淀，并调节pH至7.0，冷冻干燥后得到的物质即是小麦胚芽蛋白。

称取小麦胚芽蛋白1g，加100mL蒸馏水搅拌，调至蛋白酶N的最适作用pH值7.5，于恒温水浴锅中加热至蛋白酶N的最适作用温度55℃。然后，加入20mg蛋白酶N，在55℃下进行4h酶解反应。酶解反应过程中，用0.1MNaOH维持pH值恒定。酶解完成后，95℃加热灭酶15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心(10,000g,10min)除去沉淀，取上清液，冷冻干燥得到蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物。

实施例4蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性检测

除了以实施例3制备的蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物替代实施例2中实施例1制备的链霉蛋白酶小麦胚芽蛋白水解物外，其他操作均与实施例2相同。

①.小麦胚芽蛋白水解物与H.pylori优先混合的检测结果如表2所示。

表3不同浓度蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物的抗H.pylori粘附活性

②小麦胚芽蛋白水解物与GES-1细胞优先混合，结果表明，所有检测浓度的蛋白酶N小麦胚芽蛋白水解物均不具有抗H.pylori粘附活性。

实施例5

瑞巴派特，化学名为2-(4-氯苯甲酰胺基)-3-(1,2-二氢-2-氧代-4-喹啉基)丙酸，是一种辅助治疗H.pylori感染的药物。研究表明该药物可以抑制H.pylori粘附至胃黏膜上皮细胞、减少氧化应激、降低H.pylori产生的细胞因子浓度等，进而起到辅助治疗H.pylori感染的疗效。因此，本发明选择瑞巴派特作为阳性对照组，使用浓度选择依据文献报道(Asha M K,Debraj D,Prashanth D,et al.In vitro anti-Helicobacter pyloriactivity of a flavonoid rich extract ofGlycyrrhiza glabra and its probablemechanisms ofaction[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,145(2):581-586)。

①抗粘附样品与H.pylori优先混合

本发明以实施例1和3制备的两种具有抗H.pylori粘附活性的小麦胚芽蛋白水解物在浓度为10g/L时作为抗粘附样品，采用抗粘附样品与H.pylori优先混合的方式测定其抗粘附活性。与阳性对照组相比较，均具有更好的抗H.pylori粘附活性，结果见表4。具体操作步骤同实施例2。

表4 10g/L的小麦胚芽蛋白水解物与阳性对照组的抗H.pylori粘附活性比较

②抗粘附样品与GES-1细胞优先混合

本发明中验证的两种具有抗H.pylori粘附活性的小麦胚芽蛋白水解物在浓度为10g/L时，采用抗粘附样品与GES-1细胞优先混合的方式测定其抗粘附活性。仅阳性对照组具有抗H.pylori粘附活性，结果见表5。

表5 10g/L的小麦胚芽蛋白水解物与阳性对照组的抗H.pylori粘附活性比较

由上述实施例可以看出，本发明所述方法制备得到的小麦胚芽蛋白水解物具有显著的抗幽门螺旋杆菌粘附的作用，其作用方式主要是针对幽门螺旋杆菌，在无法与幽门螺旋杆菌同时存在时无法发挥其抗粘附作用。

本发明探索了小麦胚芽蛋白的新功能，以期为扩大小麦胚芽的应用领域、深度开发和利用小麦胚芽资源提供更加有效的途径，实现小麦加工业副产物的有效增值。本发明证明小麦胚芽蛋白水解物具有抗H.pylori粘附胃粘膜上皮细胞的活性，与现有药物相比，是一种天然、安全、价格低廉、高效的抗H.pylori粘附进而预防H.pylori感染的新产品，可以作为功能食品配料和营养品，具有替代抗生素的潜力，将有利于保障人类胃肠道健康，预防H.pylori感染所引起的各种胃部疾病，进而减少国家财政医疗负担。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.小麦胚芽蛋白水解物在制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂中的应用；

所述小麦胚芽蛋白水解物的浓度为10g/L；

所述小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，由以下步骤组成：

（1）将小麦胚芽粉以pH值为9~10的碱性溶液提取，固液分离，所得上清液为碱提取液；

（2）将碱提取液的pH值调节至3.5~4.5，静置，固液分离，所得沉淀为小麦胚芽蛋白；

（3）以蛋白酶对所述小麦胚芽蛋白酶解2.5~5h，固液分离，所得上清液干燥，得到小麦胚芽蛋白水解物；

所述蛋白酶为链酶蛋白酶或蛋白酶N；

步骤（1）所述碱性溶液的提取次数为2~4次，所述碱性溶液每次提取的时间独立的为20~50min；

步骤（2）所述酸性溶液的提取次数为2~4次，所述酸性溶液每次提取的时间独立的为30~60min；

步骤（3）所述小麦胚芽蛋白与蛋白酶的质量比为（1~5）:（80~120）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述酸性溶液选自盐酸溶液、磷酸溶液或醋酸溶液。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂为功能性食品或营养品。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的剂型包括片剂、口服液、颗粒剂或胶囊剂。

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