TWI358266B - - Google Patents

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1358266 * Ο) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於既使添加於含人類的哺乳動物（具體爲 家畜、寵物等）、鳥類（具體爲飼養雞、賞鳥類等）、兩 生類' 爬蟲類、魚類（具體爲水產養殖魚、寵物魚類等） '無脊椎動物及醫藥品、動物用醫藥品 '醫藥部外品、化 妝品、食品、功能性食品、飼料及浴用劑等亦可得到安全 φ 且免疫賦活物質之發酵及培養方法、植物發酵萃取物之製 • 造方法、含有發酵及培養方法所得之免疫賦活物質的植物 - 發酵萃取物、由該植物發酵萃取物所得之免疫賦活物質含 有粉末、及該植物發酵萃取物所調製的植物發酵萃取物配 合物。 【先前技術】 有關含人類的哺乳動物（具體爲家畜、寵物等）、鳥 φ 類（具體爲飼養雞、賞鳥類等）、兩生類、爬蟲類、魚類 (具體爲水產養殖魚、寵物魚類等）、無脊椎動物，確立 ' 其含感染防除技術之疾病預防、治療法係爲重要的課題。 - 且要達到此目的時，被要求使用無須使用化學物質、無環 境污染、無產生耐性菌、不會累積於人體中的方法。本發 明者對於上述的課題，發現小麥水萃取物等的來自植物的 免疫賦活物質可安全地達成疾病預防與治療效果（專利文 獻1、專利文獻2)。又，欲達成以上目的，發現可使用 由小麥共生細菌的稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans) -5- ⑧ • (2) 1358266 ' 所得之低分子量脂多醣（非專利文獻2)。另一方面，由 最近的硏究得知，脂多醣以外的種種物質可顯示免疫賦活 效果，含有這些複數的免疫賦活物質之天然物質原料受到 注目。 .然而，使用微生物的發酵技術不僅使用於食品領域中 ，亦廣泛地使用於其他領域中。例如以葡萄酒爲主的酒類 * 製造、醬油或味噌之製造、乳酪等發酵乳製品之製造、醫 φ 藥品的製造等及廣泛領域。使用於這些發酵的微生物之範 圍極爲廣泛，以麯（真菌）酵母、乳酸菌等爲主者，但幾 乎未有使用革氏陰性菌之報告。一般發酵爲有機物經微生 物作用之分解作用現象，廣義爲藉由微生物之有用物質的 生產（非專利文獻3)。作爲使用微生物的發酵技術，可 舉出作爲代表性的葡萄酒。.葡萄酒爲使用附著於葡萄皮上 的葡萄酒酵母菌之發酵技術，生產物爲醇類。又，使用微 生物的發酵技術中使用革氏陰性菌者可舉出使用甲烷菌 φ 進行甲烷發酵，使用乙酸菌進行乙酸發酵，使用運動發酵 單胞菌（Zymomonas mobilis)由龍舌蘭的根莖之乙醇發 ' 酵（龍舌蘭酒製造）等，但以食用植物作爲原料，使用與 - 該植物作特殊共生爲特徵之微生物進行發酵培養的技術爲 未知，作爲發酵產物免疫賦活物質並未受到注目。 另一方面，藉由微生物發酵時，必須具有滿足一般微 生物生長時的發酵基質之營養條件。即，作爲碳源，必須 存在含有充分的葡萄糖、果糖等單糖類等作爲微生物的營 養素而可被利用的物質。因此原先已含有多量的果糖之如 -6- ⑧ 1358266 • Ο) ' 葡萄的水果’無須進行任何加工步驟即可作爲發酵基質利 用，其他則必須進行加熱或酵素處理等之藉由微生物的發 酵則階段處理。例如則述運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis )爲使用於製造龍舌蘭酒上之微生物，此爲由非 食用植物之龍舌蘭的粮莖所得之多醣類經加熱分解發酵性 單糖後’藉由該微生物的發酵得到發酵產物的酒類。因此 使用一般微生物進行發酵培養時，澱粉等多醣類並非適當 φ 的發酵基質。例如有文獻指出稻穀病原細菌（Pantoea _ agglomerans)無法分解殿粉（非專利文獻4) » 本發明者已確立小麥粉之水萃取物中含有可賦活化免 疫的有效成分（非專'利文獻5 )。又，穀物（小麥、米） 、海草（海帶芽、昆布、洋栖菜、海苔等）、豆類（大豆 、紅豆）中已含有有效成分（非專利文獻6)。作爲該生 物活性，具有人類或老鼠之各疾病（糖尿病、高脂質血症 、異位性皮膚炎、癌症）等預防效果，故可有效地預防魚 φ 類、甲殻類、鳥類的感染（專利文獻1、非專利文獻1 ) 。然而小麥粉水萃取物要達到所期待的上述效果必須攝取 ' 大量的小麥粉。 •另一方面，稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)爲 共生於小麥的細菌，因供給磷、氮於小麥故對於小麥栽培 爲有用的菌（非專利文獻7 )。又，於歐洲已知稻穀病原 細菌（Pantoea agglomerans)不僅於小麥、亦附著於梨或 蘋果等果實的表皮上，有該菌附著時可預防因霉菌所引起 的腐爛病，故開發該菌利用於無毒下對自然環境佳之防霉 1358266 * (4) ' 劑已被進行（非專利文獻8)。且，所謂共生即爲「一般 表示相異種的生物一起生活的現象，此時彼此的行動或生 理維持一定的密切關係。因此，不僅是生活於相同地方之 槪念，對於共生者之生活上的意義及必須性、關係的持續 性、共生者的空間位置關係等，共生可分成各式各樣的類 型、區別。一般爲共生者的生活上利益、非利益之有無做 ' 爲基準下，共生分爲共利共生、片利共生、寄生之三大類 φ 」（非專利文獻 9 )。稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)的情況爲，已知可於任意產地、任意種類 的小麥中分離出（非專利文獻5)，又亦可由果實分離出 (非專利文獻 10、11 )。稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)可產生抗生素（非專利文獻12、13)而由 真菌或其他細菌保護植物，及進行磷、氮固定（非專利文 獻7)。因此，稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)常 在於植物上，擔任植物的有益角色，有時此並非稱爲「共 φ 生J而稱爲「寄生j 。且，本發明者已知稻穀病原細菌中 含有可賦活化免疫的有效成分。又，由該菌所得之低分子 ' 量脂多醣具有對人類或老鼠之各疾病（糖尿病、高脂質血 * 症、異位性皮膚炎、癌症）等預防效果，對魚類及甲殼類 、鳥的感染預防亦有效（專利文獻3、非專利文獻2 )。 如此狀況下，本發明者考慮到作爲製造安全且便宜的 免疫賦活物質之方法，確立出使用稻穀病原細菌之植物發 酵萃取物的製造方法。換言之，（1)使用含於培養液的 蛋白質之主成分由來自植物者取代之培養基，使稻穀病原 -8- ⑧ (5) 1358266 ' 細菌於低成本下培養的同時使植物成分發酵、（2)調製 出含有大量含於植物的稻穀病原細菌或發酵生產物之原料 、利用此開發出含人類的哺乳動物（具體爲家畜、寵物等 )、鳥類（具體爲飼養雞、賞鳥類等）、兩生類、爬蟲類 、魚類（具體爲水產養殖魚、寵物魚類等）、無脊椎動物 及醫藥品、動物用醫藥品、醫藥部外品、化妝品、功能性 食品、食品、飼料及浴用劑受到注目。然而，並非意味著 φ 共生於植物的微生物爲例如來自食用植物的原料之植物成 ' 分可作爲發酵基質被利用。例如，小麥粉爲存在於小麥粒 之澱粉質等複合有機物質，但與小麥共生微生物之稻穀病 原細菌爲隔著外皮而並非直接接觸，故稻穀病原細菌是否 可使用於小麥粉的發酵培養並非單由微生物與小麥共生之 關連性即可瞭解，事實上至今未知稻穀病原細菌可資化小 麥粉，完全無相關報導。相反地，基於至今的公知事實， 稻穀病原細菌不能利用小麥澱粉作爲發酵基質。 # 因此，含於植物的糖質以澱粉的狀態保持之情況較爲 多’此於食用植物、特別爲穀類時特別顯著。一般微生物 ' 並未具有高澱粉資化功能。對於此已知一部份的通性革氏 ' 陰性菌可發酵澱粉。例如已知Erwinia可資化澱粉。該發 酵技術爲，發酵澱粉時另外添加適當培養基中進行大量培 養的微生物，其爲利用微生物所具有的澱粉酶活性，但對 於培養時直接使用澱粉且同時發酵的型態爲至今無法想像 到的。公知技術爲單有效地利用微生物所具有的澱粉酶活 性爲目的之發酵.，但並非可推想到澱粉可作爲基質而使微 -9- (6) 1358266 ' 生物增殖。另一方面，本發明的實施例中揭示因澱粉作爲 唯一碳源故使微生物增殖以外亦產生發酵產物，本案實施 例並非僅爲單純的發酵，其所揭示的發酵培養亦與公知技 術有著相當大的差異。 另一方面，相反地某些微生物既使保持分解澱粉的功 能，並非表示此微生物爲直接以澱粉作爲基質進行增殖。 培養時微生物的增殖亦爲目的時，培養開始時所加入的微 φ 生物量極少，此時既使微生物具有少量的澱粉酶活性，該 ' 活性因過於薄弱亦無法充分地分解基質，而無法達到微生 ' 物的增殖。.事實上，多數微生物無法以澱粉作爲唯一的碳 源而進行增殖。 然而，使用稻穀病原細菌於含有以小麥粉爲主成分的 培養基中進行發酵及培養時，或可低成本下製造出富含免 疫賦活物質的植物發酵萃取物（以下將使用稻穀病原細菌 以含有小麥粉爲主成分的培養基中發酵及培養所得之植物 Φ 發酵萃取物稱爲小麥發酵萃取物），則可提供於例如人類 、對畜產及水產養殖領域下的環境佳、安全下預防感染有 效之醫藥品、動物用醫藥品 '醫藥部外品、化妝品、食品 ' 、功能性食品、飼料及浴用劑等。本發明係以上述背景下 ’發現稻穀病原細菌可於以小麥粉作爲基質下進行生長， 而進行種種重複實驗而完成本發明。 本發明所提供的植物發酵萃取物係爲，由發酵及培養 所得之培養液’經固液分離所得之液體成分、及固液分離 後所得之固體成分經萃取過程後所得之液體成分等之總稱 -10- ⑧ (7) 1358266 。即，植物發酵萃取物係由本發明的發酵及 之培養液，及含有使用其培養液的全部或一 的所有萃取物。理所當然地，植物發酵萃取 爲植物發酵萃取物粉末利用，或植物發酵萃 於任意濃度的適當溶液中，例如含有生理食 衝液等中利用。 專利文獻1 :特開平3 - 2 1 8 4 6 6號公報 專利文獻2 :特開平8- 1 98902號公報 專利文獻3 : WO 00/57719 專利文獻4 :特開平6-78 75 6號公報 專利文獻5:特開平4-187640號公報 專利文獻6 :特開平4-49240號公報 專利文獻7:特開平4-99481號公報 專利文獻8 :特開平5 - 1 5 5 7 7 8號公報 非專利文獻1 :稻川裕之其他8名， ” ，1991 年，第 5 卷，4 號，p617-621 非專利文獻2: Soma，G-Ι.其他1名， Necrosis Factor: Molecular and Cellular Clinical Revenvance ^ ，1 993 年，p203 -220 非專利文獻3 :山田常雄其他6名， 第 3 版〃，1983 年，pl〇21 非專利文獻4: Gavini,F.其他6名， Bacteri 〇]. " ，] 98 9 年，第 39 卷，p3 3 7 -3 45 非專利文獻5 : Nishizawa，T.其他7名 培養方法所得 部份可調製出 物可乾燥後作 取物粉末溶解 鹽水之磷酸緩 ' Biotherapy Tumor Biology and Λ生物學事典 Int.J.Syst. ' C h e m . -11 - ⑧ (8) 1358266

Pharm. Bull/ ，1 992 年，第 40 卷，2 號，p479-483 非專利文獻6 : Inagawa, Η.其他8名，，Chem. Pharm. Bull.^ ，1 992 年，第 40 卷，4 號，ρ994-997 非專利文獻 7 : Neilson, A. Η. ' J. Appl. Bacteriol. ” ，1 979 年，第 46 卷，3 號，p483-49 1 非專利文獻8 : Nunes，C.其他3名，' Int. J. Food

Microbiol." ，2001 年，第 70 卷，1，2 合倂號，p53-61 非專利文獻9:山田常雄其他6名，、生物學事典 第 3 版"，1 98 3 年，p2 8 7-2 8 8 非專利文獻10 : Nunes, C.其他4名，"J. Appl. Microbiol." ，2002 年，第 92 卷，2 號，p247-255 非專利文獻11 : Asis, C. A. Jr.其他1名，、Lett. Appl. Microbiol." 2004 年，第 3 8 卷，1 號，p l 9-23 非專利文獻12: Vanneste，J. L.其他3名， Bacteriol，1 992 年，第 174 卷，9 號，p2785-2 796 非專利文獻13 : Kearns, L. P.其他1名，，Appl E n v i r ο η M i c r 〇 b i ο 1 · " 1 9 9 8 年，第 6 4 卷，5 號，p 1 8 3 7- 1844 【發明內容】 如上述，免疫賦活物質爲植物本身所含有或與植物共 生之微生物的構成成分或生產物的情況爲多。因此，欲得 到可攝取且安全的來自天然物之免疫賦活物質，可由食用 植物本身萃取出成分（例如limulus陽性糖脂質、專利文 -12- 1358266 . Ο) ' 獻1)或效率地培養於食用植物共生的微生物後取得其構 成成分或生產物（例如低分子量脂多醣，專利文獻2) » 然而’含於食用植物的免疫賦活物質的含量較少，若希望 ' 藉由食用後之免疫賦活效果必須攝取極多量的食品，或若 要保·持適當的免疫賦活物質攝取量並不容易，效果無法達 成。且由植物萃取作爲食品或藥劑利用時必須花費高成>本 * 缺乏實用性。 φ 另一方面，受到注目的與植物共生之微生物，例如小 ' 麥共生細菌之稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)含有 • 構成免疫賦活有效成分之低分子量脂多醣成分。然而至今 對於低分子量脂多醣的萃取，必須使用含於培養液之蛋白 質爲主成分爲來自動物者，例如必須使用NZ胺或胰化蛋 白或酪蛋白胺基酸等高價的培養液進行稻穀病原細菌的培 養。因此，作爲廣用性高的免疫賦活物質難以便宜價格下 提供’無法避免同時混入來自BSE其他動物之未知有害 φ 物質。 鑑於上述問題點，本發明爲提供一種使用安全原料且 ' 便宜價格下有效率地得到免疫賦活物質之發酵及培養方法 •，藉由該方法所得之植物發酵萃取物、該植物發酵萃取物 所得之植物發酵萃取物粉末及添加該植物發酵萃取物粉末 的植物發酵萃取物配合物爲目的。 本發明的發酵及培養方法爲，將來自食用植物的原料 藉由於特定植物中共生的兼性厭氧性革氏陰性菌進行發酵 ，同時培養該兼性厭氧性革氏陰性菌爲桿菌爲特徵者。 -13- (10) (10)1358266 又，作爲碳源的澱粉藉由該兼性厭氧性革氏陰性菌發 酵下，可經由單純的過程進行發酵及培養。 該兼性厭氧性革氏陰性菌以兼性厭氧性桿菌爲佳。 該兼性厭氧性革氏陰性菌屬於腸內細菌科爲佳。 • '又，該兼性厭氧性桿菌屬於團泛菌屬（pantoea)、 沙雷氏菌屬（serratia)、或腸內桿菌屬（enterbacter)者 爲佳。 又，該兼性厭氧性桿菌爲稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)，而碳源可爲澱粉。 又，該食用植物爲穀物、海草、或豆類、或這些混合 物爲佳。 又’該穀物的原料爲小麥粉、米粉、小麥糠粉、米糠 '或酒粕爲佳，特別爲小麥粉含有作爲蛋白質源之麵筋， 故既使不使用來自動物的原料亦可效率良好下進行發酵及 培養。 又’來自該海草的原料爲海帶芽粉、和布蕪、或昆布 粉爲佳。 又’來自該豆類的原料爲豆腐渣，故含有大量的蛋白 質而無須來自動物的原料，既使不使用來自動物的原料亦 可效率良好下進行發酵及培養。 又’本發明的植物發酵萃取物，其特徵爲由前述發酵 及培養方法所得者。 又’本發明的植物發酵萃取物粉末，其特徵爲如前述 植物發酵萃取物所得者。 -14- • (11) 1358266 ' 又，本發明的植物發酵萃取物配合物，其特徵爲添加 如前述植物發酵萃取物或植物發酵萃取物粉末者。 又，前述植物發酵萃取物配合物，其中該植物發酵萃 取物配合物可爲醫藥品、動物用醫藥品、醫藥部外品、化 妝品、食品、功能性食品、飼料、或沐浴劑。 又，前述植物發酵萃取物，其爲存在多黏菌素B下亦 * 顯示巨噬細胞活化能之物理化學性質者爲佳。又，前述植 φ 物發酵萃取物具有免疫賦活活性。 本發明因以未含來自動物成分之培養基進行培養，故 提供一種不會有混入來自動物成分的雜質之問題，例如不 會有BSE或未知有害物質混入的危險，可高安全性且便 宜等多方面用途下提供植物發酵萃取物的製造方法，且安 全、便宜下製造出免疫賦活物質含有植物發酵萃取物或植 物發酵萃取物，以及該培養液、免疫賦活物質、萃取物及 萃取物粉末、更提供添加該萃取物或萃取物粉末的醫藥品 φ 、動物用醫藥品、醫藥部外品、化妝品、食品、功能性食 品、飼料及浴用劑等。 ' 將來自食用植物的原料藉由與特定植物共生的兼性厭 • 氧性革氏陰性菌進行發酵，同時可培養該兼性厭氧性革氏 陰性菌之單純過程下發酵及培養的技術，至今未被想到， 且由至今的發酵技術之常識亦無法輕易地推想得知。 又，作爲顯示物質的免疫賦活效果的指標，可使用由 巨噬細胞是否產生TNF ( TNF衍生活性）之方法。且藉由 TNF產生量可定量化免疫賦活效果。其中使用來自小麥的 -15- (12) 1358266 ' limulus陽性植物糖脂質、來自稻穀病原細菌的低分子量 脂多醣’對由巨噬細胞的TNF產生作檢討時，來自小麥 的limulus陽性植物糖脂質、來自稻穀病原細菌的低分子 量脂多醣皆以多黏菌素B處理時，不會由巨噬細胞產生 ， TNF ’但由本發明的實施例顯示本發明的植物發酵萃取物 進行如上處理時由巨噬細胞產生大量的TNF。此爲進行發 酵培養結果所得之本發明的植物發酵萃取物，其爲具有與 φ 成爲其原料的植物本身、及使用於發酵的微生物本身的構 成成分所造成的免疫賦活效果於質地上相異的效果。 實施發明的最佳型態 以下對本發明的較適實施型態作詳細說明。 1_ :使用稻穀病原細菌（Pantoea aggl omerans)之植物發 Φ 酵萃取物的製造方法重點 本案中’本發明者首先發現稻穀病原細菌可將澱粉作 爲直接碳源生長，發明使用稻穀病原細菌進行發酵及便宜 •地製造出富含作爲培養生成物的免疫賦活物質之小麥發酵 萃取物之方法。藉由此，作爲具體例子爲可提供人類、畜 產、水產養殖之領域下對環境溫和且安全下可預防感染的 有效醫藥部外品、化妝品、食品、功能性食品、飼料。 1 稻穀病原細菌的分離 -16- ⑧ 1358266 • (13) * 將小麥粉懸浮於水中，將澄淸液體塗佈於L-broth洋 菜培養基中進行培養後出現微生物的菌落。這些菌落以一 定方法進行微生物的鑑定。例如選擇出革氏染色陰性、葡 萄糖厭氣性代謝反應陽性、氧化酶活性陰性的菌落，且使 用ID測試· EB-20 (日水製藥）等，選擇出與標準稻穀病 原細菌具有相同性質者。作爲標準的稻穀病原細菌可由理 ' 化學硏究所生物基盤硏究不微生物系統保存設施獲得（非 φ 專利文獻4 )。以下說明中，百分率的表示若無特別說明 則表示重量。 2 :免疫賦活活性之評估 本實施的型態中，作爲小麥發酵萃取物顯示免疫賦活 作用的指標，將巨噬細胞活性化能由巨噬細胞的TNF產 生作評估。 # 3 ‘·來自稻穀病原細菌的低分子脂多醣 又，藉由使用稻穀病原細菌之發酵及培養，可期待其 ' 中含有作爲免疫賦活之有效成分之一的來自稻穀病原細菌 ' 之低分子量脂多醣。低分子量脂多醣與廣泛被使用的高分 子量型脂多醣（以下稱爲脂多醣）相比其安全性極高，且 其生物活性亦與一般的脂多醣相比較爲優良。因此，測定 低分子量脂多醣含量。對於低分子量脂多醣於專利文獻2 中已詳細說明。且，本實施例雖與小麥發酵萃取物相關， 但本發明並未將植物限定爲小麥、將免疫賦活物質限定爲 -17- ⑧ 1358266 * (14) * 低分子量脂多醣。 於是稻穀病原細菌可使用公知方法進行培養（專利文 獻2、非專利文獻8)，但公知培養液中所含有的蛋白質 主要成分爲來自動物者，其培養基的成本較爲高。且，動 :物給予例如功能性食品或功能性飼料、或經皮性投與時， 會有如BSE的來自動物的雜質混入而造成食物上安全性 * 問題，且由製造成本更高，由實用性來看並非好方法。因 φ 此本發明者欲得到具有安全且便宜的免疫賦活作用之天然 物進行詳細硏究結果，欲取得小麥發酵萃取物依據實施例 所示使用稻穀病原細菌進行發酵及培養方法而完成。含於 培養液的蛋白質主成分爲於過去爲使用來自動物者，本發 明則使用來自植物者。一般培養液體中添加由消化酵素分 解來自牛奶的酪蛋白等蛋白質之產物。此時1L的培養基 原價約2 5 0日圓，但由小麥粉取代時原價爲約1 6日圓。 至今並未進行植物及與其共生的微生物雙方之免疫賦活活 * 性使其高濃度下會融合化之相乘作用爲目的的發酵。 以下以實施例對本發明內容作詳細說明，但作爲本發 明於實施例中所記載的微生物並未限定爲稻榖病原細菌， * 作爲食用植物的小麥或原料亦未限定爲小麥粉，亦可使用 含有大量免疫賦活物質的其他食用植物，經過一般步驟所 得之原料、例如可適用於海帶芽、穀物（來自穀物的原料 含有小麥粉、米粉、小麥糠粉、米糠、或酒粕等）'海草 (來自海草的原料含有海帶芽粉、和布蕪、或昆布粉）、 豆類（來自該豆類的原料含有豆腐渣）等。已知這些植物 -18- ⑧ 1358266 • (15) • 中含有蛋白質、醣類，適用於使用稻穀病原細菌之發 培養上。又，已知這些植物一般與常在性細菌，例如 雷氏菌屬（serratia)、或腸內桿菌屬（enterbacter) (非專利文獻4)、使用於發酵的微生物當然亦可使 這些植物共生的兼性厭氧性革氏陰性菌。 ' II :綜合發明的重點 φ ( 1 )小麥、其共生細菌之稻穀病原細菌、及組 些之發酵產物的融合而具有免疫賦活作用之物質的小 酵萃取物爲新穎物，但本發明並未限定於此。 (2)使用革氏陰性菌的稻穀病原細菌製造植物 萃取物係爲新的技術。但本發明並未限定於此。 III :小麥發酵萃取物的具體製造方法 (1)稻榖病原細菌依據一般方法由小麥粉中分 Φ 非專利文獻1 )。且，僅一次分離鑑定後，此菌可保 5 0 %甘油等中。 • (2)調製出0.05〜5%的食鹽、0.005〜1莫耳 •酸緩衝液、或混合鹽類溶液（0.5〜10%的磷酸第二 0.05〜5%的磷酸第一鉀' 0.05〜5%的氯化鈉、〇.〇5、 的氯化銨）等。 (3 )將小麥粉懸浮於水中至〇 . 〇 5〜1 0 %濃度。 (4)調製出0.2〜3莫耳的氯化鎂溶液。 (5 )調製出0 · 2〜3莫耳的氯化鉀溶液。 酵及 與沙 共生 用於 合适 麥發 發酵 離（ 存於 的磷 鈉、 ^ 5% -19- ⑧ * (16) 1358266 • (6) 2至5則依據所需可進行高壓滅菌釜之滅菌操 作。 (7) 將2至5作適量混合’加入水後成爲含有〇1〜 5%的小麥粉之懸浮液。依據所需加入鹼溶液或酸性溶液 後pH成爲中性。 (8) 藉由7的情況，於每1L的培養基中添加10〜 ' 50000單位的澱粉酶，於°C〜80 °C下保溫1〜24小時， φ 亦可消化部份的小麥澱粉。 (9) 7至8的步驟中添加於1中分離之稻穀病原細 —t如 囷 。 (10) 9於1〜4(TC下進行發酵。依情況可靜置或震 盪。又，亦可進行數小時之攪拌。 (11) 將10進行6小時至一星期的發酵。發酵進行 下小麥粉的水溶液會著色成黃色。 (12) 11的發酵途中可添加適當的鹼溶液，使pH成 # 爲中性、或可添加小麥粉懸浮液或無機鹽類。 (13) 發酵終了後，藉由離心分離（ 1000〜5000 rpm ' ，〗0〜60分鐘）等操作回收沈澱物的固體成分。沈澱物 ' 作爲小麥粉發酵物，可直接作爲飼料或混合於飼料的原料 使用。 (1 4 )製造小麥發酵萃取務實，將1 3懸浮於水或鹽 類緩衝液等中，將此於80〜140°C下進行1〇分鐘至6小 時的熱處理。且經由離心分離或過濾可除去固體成分。所 除去的沈澱物中再次加入水或緩衝液進行數次重複的加熱 -20- ⑧ 1358266 • (17) ' 萃取。 (15)依據於14所製造的小麥發酵萃取之用途’可 再進行簡單的純化步驟。即，14的萃取物中加入氯化鈉 等鹽類使其成爲最終濃度爲〇·〇5〜1莫耳/ L·，其後添加 萃取物的1〜3倍量的乙醇等溶劑使其沈澱。將此可使用 離心分離機等進行回收。將此沈澱可再以乙醇等溶劑洗淨 。將此乾燥後可做出粉末。 【實施方式】 A.有關小麥發酵萃取物之製造方法的實施例 實施例1 稻穀病原細菌的小麥培養基中之生長試驗 欲確認以小麥粉作爲碳源時是否可使小麥常在性共生 菌之稻穀病原細菌增殖，對小麥粉固體培養基之稻穀病原 細菌的生長作調查。 • ( 1 )作成含有〇_5%小麥粉作爲碳源之M9洋菜培養 基。 " (2)經LB洋菜培養基，取出稻穀病原細菌的1個 ' 菌落懸浮於1 ml的PBS中。將此再以PBS作10倍至 10000倍之階段式稀釋，再將各0.1 ml接種於1的M9洋 菜培養基。 (3 )於3 7 °C下培養6天後，觀察菌落的出現。其結 果於]0000倍稀釋的〇.1 ml所播種的培養皿中觀察到約 3 〇 〇個菌落。

-21 · (18) 1358266 由此可知，確認出稻穀病原細菌可利用小麥作爲碳源 實施例2 ·_ 小麥發酵萃取物的製造 (1 ) 0.5 g的小麥粉中加入5 ml的蒸餾水使其懸浮 ，澄淸液0.1 ml添加於L-broth洋菜培養基中，於37°c φ 下經一晚培養。 (2) 分離黃色的菌落，以一般方法進行菌的鑑定， 分離出稻穀病原細菌，將此懸浮於50%甘油溶液中，於 冷凍庫中保存。將此保存液的一部份塗抹於LB洋菜培養 基，放置於3 7 °C下作成稻穀病原細菌之獨立菌落。 (3) 2L的三角錐形瓶中加入64 g的磷酸第二鈉· 7 結晶水、〗5 g的磷酸第一鉀、2.5 g的氯化鈉、5 g的氯化 銨’加入純水使全量成爲1L (無機鹽類混合溶液）：取

# 1 3 . 1 g的氯化鎂· 2結晶水，加入純水使全量成爲1 00 mL (氯化鈣溶液）：將4L的純水放入5L的三角錐形瓶中 (純水）。上述溶液及純水皆放入高壓滅菌釜（T0MY ^ BS-325，120°C ’ 20分鐘）進行滅菌處理。 (4) 於】L的三角錐形瓶中放入24 g的小麥粉（曰 淸製粉），加入純水使全量成爲600 ml。將此進行相同高 壓爸滅菌後，加入3 mg的α —澱粉酶（SIG Μ A, Bacillus ，1 mg蛋白質中1500〜3000單位的酵素活性），65 °C的 水浴下加熱4〜1 2小時（小麥粉澱粉酶處理液）^ -22- ⑧ (19) 1358266 (5)將各如表1所示量之調整的溶液放入經滅菌之 3L之Sakaguchi錐形瓶作爲小麥粉培養基。 表1 材料 用量 無機鹽類混合溶液 2 0 0ml 純水 5 5 0ml 小麥粉澱粉酶酯處理液 200ml 氧化鎂溶液 2.0ml 氯化鈣溶液 0.1ml

(6) 種菌的調製。與上述祖同組成所調製之5的10 ml小麥粉培養基中，放入2中由小麥粉所分離出的1個 稻榖病原細菌菌落’於37 °C下緩緩攪拌1晚（12〜15小 時）使其發酵，調製出小麥粉發酵用種菌。 (7) 於5中加入6全量並於37。(：下攪拌的同時，經 20〜30小時使其發酵。測定發酵液的pH，加入氨水後將 pH調整爲7。於此無菌下加入150 ml的小麥粉澱粉酶處 理液與無機鹽類混合溶液3 7 · 5 m丨，進行相同的2 0〜3 0小 時之發酵。相同操作在重複一次後總計發酵時間爲6 5〜 8 0小日寺〇 (8 ) 7的小麥粉發酵溶液經離心分離（日立，高速 冷卻離心機SCR-20B，5000 rpm，20分鐘，4°C )，回收 沈澱物。

-23- (20) 1358266 ’ （9) 8的沈薇物中加入磷酸緩衝液使其成爲全量100 m 1的懸浮狀態，取出3 3 m 1移入5 0 m 1的離心管中，於沸 騰水浴中進行30分鐘的熱萃取。加熱終了後，冷卻至室 溫’離心分離本液體（日立，高速冷卻離心機 SCR-20B ，1 0000 rpm，20分鐘，20t )。經離心後將82 ml的淡 黃色澄淸液傾析回收至另外容器中。 (10) 9的80 ml澄淸液中加入8.9 ml的5莫耳氯化 φ 鈉溶液，於此加入178 ml的乙醇使其成爲白濁狀。將此 放置於冷凍庫（-90 °C )中一晚後，本液體經離心分離（ 日立，高速冷卻離心機 SCR-20B，10000 rpm，20分鐘， 4 °C )後除去澄淸液得到沈澱物。沈澱物中加入經冷卻的 10 ml 70%乙醇使其懸浮後，離心分離本液體（曰立，高 速冷卻離心機 SCR-20B，1000 rpm，20 分鐘，20。(：）， 洗淨沈澱物。風乾沈澱物後溶解於蒸餾水中，得到11ml 的小麥發酵萃取物溶液。 φ ( 1 1 )乾燥重量的測定：預先秤取〇. 3 m 1後移至1 . 5 ml的塑膠試管爭，冷凍後，以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥 ' 得到7.45 mg。因此1〇的小麥發酵萃取物之乾燥重量爲1 • ml的溶液中爲24.8mg，全量11 ml中爲273 mg。 (12)以相同方法製造出獨立8次的小麥發酵萃取物 ，各以Bradford蛋白濃度測定法，將蛋白質定量BSA作 爲標準蛋白質，測定各樣品的蛋白質質量。作爲比較對象 ，使用經純化的limulus陽性糖脂質（專利文獻1 )與低 分子脂多醣（專利文獻2 )。測定結果如表2所示。有關 -24- * (21) 1358266 • 表2〜5、7的小麥發酵萃取物之數値爲，上述ι〇所得之 小麥發酵萃取物經乾燥所得之lg重量中的含有量mg» (13)糖含量的測定：藉由酚硫酸法將葡萄糖作爲標 準糖進行測定。測定結果如表3所示》 (1 4 )核酸含有量測定：將經丨〇〇倍稀釋的樣品進行 210〜340 nm的吸光度測定。減去260 nm吸光度至320 ’ nm的吸光度所得値、與DNA的吸光度10D算出50仁g φ 的最大含有量。測定結果如表4所示。 (1 5 )藉由1 i m u 1 u s測定之1 i m u 1 u s活性物質含有量 的測定：limulus活性物質量爲使用生化學工業的 toxycolor system’作爲標準limulus活性物質使用生化學 工業Et — 1。測定結果如表5。 (16)碘-澱粉反應：使用碘試藥in( 12.7.g的碘 中及2 5 g的碘化鉀中加入1〇 m 1的水，仔細混合後，加 入水使其成爲100 ml)時，以水稀釋200倍，將5//1加 φ 入預先以1 mg/ ml的濃度溶解之小麥發酵萃取物〇」mi 中’仔細攪拌。小麥發酵萃取物馬上由淡紫色轉換成濃紫 • 色（陽性）。Limulus陽性糖脂質' 低分子量脂多醣於相 • 同條件下操作時並無相同發色現象（陰性）。以上結果歸 納於表6中。 由上述結果得知，小麥發酵萃取物與limulus陽性糖 脂質、低分子量脂多醣於蛋白質含量、唐含量、核酸含量 (limulus陽性糖脂質並無數據故除去）、limulus活性物 質含量、碘-澱粉反應所有項目中皆顯示相異性，故本發 -25- (22) 1358266 明係爲新穎之物質。以上的結果簡化歸納於如表7表示。 即，本實施例的植物發酵萃取物因顯示如下各理化學性質 ，故與limulus陽性糖脂質低分子量脂多醣爲相異的新穎 者。含有 5〜15%的蛋白質' 20〜45%的糖、10〜35%的 核酸、及10〜40%的limulus陽性物質，於碘—澱粉反應 時爲陽性，於存在多黏菌素B下亦顯示巨噬細胞活化能。 表2發酵萃取物中的蛋白質含量 樣品 蛋白質含量（mg/g) 小麥發酵萃取物1 60 小麥發酵萃取物2 7 1 小麥發酵萃取物3 90 小麥發酵萃取物4 1 05 小麥發酵萃取物5 103 小麥發酵萃取物6 82 小麥發酵萃取物7 88 小麥發酵萃取物8 88 1 i m u 1 u s陽性糖脂質 40 低分子量脂多醣 3.8以下

-26- (23)1358266

表3發酵萃取物中的糖含量 樣品 糖含量（mg/g ) 小麥發酵萃取物1 3 1 8 小麥發酵萃取物2 428 小麥發酵萃取物3 3 13 小麥發酵萃取物4 232 小麥發酵萃取物5 372 小麥發酵萃取物6 324 小麥發酵萃取物7 298 小麥發酵萃取物8 329 limulus陽性糖脂質 133 低分子量脂多醣 668 -27 ⑧ (24)1358266

表4發酵萃取物中的核酸含量 樣品 核酸含量（mg/g ) 小麥發酵萃取物1 102 小麥發酵萃取物2 1 02 小麥發酵萃取物3 226 小麥發酵萃取物4 29 1 小麥發酵萃取物5 302 小麥發酵萃取物6 240 小麥發酵萃取物7 2 18 小麥發酵萃取物8 2 16 limulus陽性糖脂質 未幸i告 低分子量脂多醣 2.8 -28 ⑧ (25)1358266

表5發酵萃取物中的limulus活性物質含量 樣品 limulus活性物質含量（mg/g) 小麥發酵萃取物1 242 小麥發酵萃取物2 118 小麥發酵萃取物3 125 小麥發酵萃取物4 458 小麥發酵萃取物5 224 小麥發酵萃取物6 23 1 小麥發酵萃取物7 356 小麥發酵萃取物.8 289 limulus陽性糖脂質 970 低分子量脂多醣 993 -29 ⑧ (26)1358266 表6發酵萃取物的碘-澱粉 樣品 判定 小麥發酵萃取物] 陽性 小麥發酵萃取物2 陽性 小麥發酵萃取物3 陽性 小麥發酵萃取物4 陽性 小麥發酵萃取物5 陽性 小麥發酵萃取物6 陽性 小麥發酵萃取物7 陽性 小麥發酵萃取物8 陽性 1 i m u 1 u s陽性糖脂質 陰性 低分子量脂多醣 陰性 ⑧ (27) 1358266 表7小麥發酵萃取物與類似品之相異性 樣品 蛋白質含量 糖含量 核酸含量 Limulus 活 碘-薇 性物質含量 粉反應 小麥發酵萃取物 86±15mg/g 327±57mg/g 212±75mg/g 255±113mg/g 陽性 (平均土標準差） Limulus陽性糖脂質 過小 過小 未測定 過多 陰性 低分子量脂多醣 過小 過多 過小 過多 陰性 過小：比小麥發酵萃取物之數値範圍（平均±標準差） 少許多之値。 過小：比小麥發酵萃取物之數値範圍（平均±標準差） 多許多之値。 實施例3 小麥發酵萃取物之免疫賦活作用 於4 8格培養皿中放入作爲人類巨噬細胞使用的急性 Φ 骨髓性白血病細胞株之THP-1 ( lxlO6個/ 250//1:放有 10%牛胚胎血淸之RPMI 1640培養基），進行30分鐘的 < 預培養。使各樣品的最終濃度成爲1〜1 0000 ng/ ml加入 250//1(最終量500//1)。調製出樣品中含有多黏菌素B (12.5 y g/ ml )之群。經4小時培養後，回收培養澄淸 液及細胞。澄淸液的TNF活性使用L - 929細胞障礙試驗 進行測定。結果如表8所示。小麥發酵萃取物於多黏菌素 B存在下亦可由巨噬細胞中產生TNF，但低分子量脂多醣 及limulus陽性糖脂質於多黏菌素B存在下並不會由巨噬

-31 - (28) 1358266 細胞中產生TNF。因此可得知小麥發酵萃取物與低分子量 脂多醣或丨imiilus陽性糖脂質相比具有相異的生物活性。 表8藉由小麥發酵萃取物之由巨噬細胞的TNF產生與多 黏菌素B之阻斷效果（小麥發酵萃取物之TNF誘導活性） 樣品 濃度 小麥發酵萃 取物中添加 多黏菌素B 小麥發酵萃取 物中未添加多 黏菌素B 低分子量脂 多醋中添加 多黏菌素B 低分子量脂 多醣中未添 加多黏菌素 B Limulus 陽 性糖脂質中 添加多黏菌 素B Limulus 陽 性糖脂質中 未添加多黏 菌素B 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0.64 0 1.2 10 0 1.2 0 6.3 0 4.2 100 0 8.7 0 10.2 0 14.2 1000 1.7 28.3 0 6.3 0 26.3 10000 26 50.4 0 3.8 0 13.2 B.小麥發酵萃取物對飼料的應用實施例 ^ 實施例4 '放入小麥發酵萃取物之養雞飼料（大規模試驗之 broiler飼養之暴斃抑制效果） 製造出含有43 0 " g/kg之實施例2所製造出的小麥 發酵萃取物的飼料。所提供的雞爲一群約5 500〜6000隻 之broiler commercial雞。對照組爲未含小麥發酵萃取物 之飼料。對於孵化後3星期齡投與含有小麥發酵萃取物之 -32- ⑧ (29) 1358266 飼料’每日投與至7週齡。每日測定死亡數。廢棄未達到 出場基準的雞。結果如表9所示。試驗組（含有小麥發酵 萃取物之飼料）的除去率爲較低之1.9% ,對照組爲3.3 %。成長率於試驗組爲98.1%，於對照組爲96.7%，故 顯示提高1.4%的成長率。進行試驗組與對照組之間的出 場實際數目與除去數目之顯著差檢定時，發現於X2檢定 下有P<0.0001之顯著差。由此可知，含有小麥發酵萃取 φ 物之飼料的broiler飼養顯示感染防除效果。 表9放入小麥發酵萃取物之飼料的broiler飼養效果 試驗區 對照區 雛雞數 5 906 5 525 實際出場數目 5 792 5345 除去數 114 180 除去數 1-9% 3.3% 成長率 98.1% 96.7% 實施例5 放入小麥發酵萃取物之養殖魚用飼料（獅魚的野外試驗之 感染防除效果） 放入實施例2所製造的小麥發酵萃取物之飼料的感染 防禦效果以餵食野外試驗的一群約5200尾的獅魚進行。 結果如表1 0所示。因鏈球菌所引起的死亡於非投與對照 組時到達4.8%。攝取100/ig/kg/日（體重1 kg，每天 (30) (30)1358266 )的小麥發酵萃取物之群（試驗組）與非投與群（對照組 )中’小麥發酵萃取物投與群之死亡率（P< 0.0000 1 )有 顯著地降低。 表10放入小麥發酵萃取物的飼料之野外試驗之鲫魚感染 防除效果 處理 飼育數 暴斃數 暴斃率 顯著差檢定 (X 2檢定） 對照區 52 0 1 249 4.79 試驗區 5 193 -1 01 1.94 (P<0.00001) 實施例6 小麥發酵卒取物（對於錦鯉疱疫病毒症（Koi herpesvirus disease)之感染防除效果） (】）鯉魚··體重70 g的黑鯉魚。試驗爲—群2 0條 〇 (2) 錦鯉疱疹病毒之調整：因錦鯉疱疹病毒感染死 亡的鯉魚之鰓1 g中加入1 0 ml的Hanks’緩衝食鹽溶液（ HBSS)後進行均質’過濾0.45 rnicron的過濾器，將該濾 液作爲病毒溶液。 (3) 錦鯉疱疹病毒感染：將上述濾液以6〇〇# 1/100 g體重，注射於鯉魚的腹腔。 (4 )含有小麥發酵萃取物的飼料製作：將購得之飼 料以0、5、1 0、2 0 m g / k g飼料比率混合於實施例2所製 -34- (31) 1358266 造出的小麥發酵萃取物中而製成。 (5) 給餌方法：以體重的1%重量之各飼料進行1 曰1次的給餌。將此換算成小麥發酵萃取物量時分別相當 於 0、50、100、200#g/kg 體重 / 日。 (6) 實驗··將一星期的含有小麥發酵萃取物之飼料 的給餌後’使其感染病毒，再經1〇天之含有小麥發酵萃 取物之飼料的饌食。觀察病毒感染操作後1 0天間鯉魚的 φ 生存率。其結果如圖1所示。 以無添加小麥發酵萃取物餵食之鯉魚於第6天全死亡 。另一方面以含有小麥發酵萃取物的飼料餵食的試驗組， 於感染第10天，生存率皆有顯著增加（Kaplan - M.e i e r法 、Logrank試驗下危險率爲0.01 %以下）。特別爲以1 〇〇 #g/kg體重/日進行餵食的群有65%的生存率。 C.放入小麥發酵萃取物之手部乳液的製造 Φ 如表1 1所記載的脂溶性基材1的軟膏中加入1成左 右之實施例2所製造的小麥發酵萃取物後混合成爲軟膏。 • 35 - ⑧ (32) 1358266 表1 1 組成 用量 _ _ 白色凡士林 250g 硬脂醇 200g 伸丙醇 "0g ___ 聚環氧乙烷硬化箆麻油60 40g 單硬脂酸甘油酯 1 〇g - 對羥基苯甲酸丙酯 1 g____ 對羥基苯甲酸丙酯 lg __- 純水 適量

實施例8 放入小麥發酵萃取物之保濕霜的製造 1.放有小麥發酵萃取物之保濕霜處方 使用成分如表12所示。A組於701下加熱溶解’於 ® 此加入以1 / 4量的純水溶解並於70 t下加熱溶解的B組 、及以1 / 4量的純水溶解並於70°C下加熱溶解的C組’ ’經均質充分混合後冷卻至40 °C，加入D組後將pH調整治 6.8後，加入剩餘的純水與以實施例2製造的適量小麥發 酵萃取物，充分混合後得到乳液。且小麥發酵萃取物預先 溶解於純水中至5 m g / m 1，對於1 0 0 g的乳液添加0 . 1 m 1 (33) Γ358266 表12 成分 w / w % 組 三十碳院 5.0 A 橄欖油 10.0 A 荷荷芭油 5.0 A 硬脂酸 4.0 A 單硬脂酸聚環氧乙烷山梨糖醇酐（20Ε.Ο) 1.8 A 甲基聚環氧乙烷 0.3 A 單硬脂酸山梨糖醇酐 0.5 B 自身乳化型單硬脂酸甘油酯 3.0 B 對羥基苯甲酸甲酯 0.2 B 對羥基苯甲酸丙酯 0.2 B 1,3-丁二醇 5.0 B 濃甘油 6.0 B 羧基乙烯聚合物 0.22 C 氣氧化鉀 適量 D 小麥發酵萃取物（5mg/rnl) 0.1 純水 適量 全量 100.00

2.放有小麥發酵萃取物之保濕霜的效果 本乳霜讓男女43人使用後作問卷調査。其結果對於 保濕效果確實有效果的答案者爲18名，稍有效果的答案 者爲18名，毫無效果的答案者僅爲2人’無回答者爲5 -37- (34) 1358266 名（一標本符號檢定：P<〇. 00 01)。對於乾燥肌膚的改 善效果，確實有效果的答案者爲6名，稍有效果的答案者 爲13名，無效果的答案者爲〇名，無回答者爲24名（一 標本符號檢定：Ρ<〇·〇〇〇1)。對於使用後肌膚症狀惡化 狀況認爲有的爲0名。又，讓4名輕度擬異位性症狀者使 用本乳霜後進行問卷調查，對於異位性皮膚炎的改善，認 爲確實有效果的答案者爲3名，稍有效果的答案者爲1名 Φ (—標本符號檢定：Ρ<〇.125)。其他認爲對於青春痘的 治療有提早痊癒的回答者爲1名。又，本乳霜讓9名男性 於刮鬍子後使用並進行問卷調查的結果，8名認爲刮鬍子 後的疼痛感減輕 '具有粗糙感防止、刮傷提早痊癒等效果 (一標本符號檢定：Ρ<0·01)。且對於2名有五十肩症 狀的患者塗佈於肩膀上，嘗試疼動減輕效果時，認爲具有 效果者爲1名。 且，該乳霜使用於火傷患者時，對於兩手皮膚皆相同 Φ 程度的火傷患者，單手以實施例2所製造的含有小麥發酵 萃取物之乳霜塗抹’另一手則以未含小麥發酵萃取物的乳 霜塗抹後’含有小麥發酵萃取物之乳霜塗抹的手明顯有提 早復原的現象。將此對於10名的火傷患者進行塗抹時， 任一人塗膜含有小麥發酵萃取物之乳霜的火傷處皆有明顯 的提早復原之現象（Fisher直接槪率法檢驗：ρ< 〇.〇〇〇] )。由上述得知本小麥發酵萃取物對於火傷具有治療效果 -38- (35) (35)1358266 實施例9 放入小麥發酵萃取物之化妝水的製造 1.放入小麥發酵萃取物之化妝水處方 使用成分如表13所示。小麥發酵萃取物爲，5 mg/ ml的濃度預先溶解於純水的實施例2所製造的小麥發酵 萃取物溶液，對於1 〇〇 g的化妝水而言添加〇. 1 ml。 成分 % 檸檬酸鈉 0.1 吡咯烷酮羧酸鈉 1.0 1,3-丁二醇 5.0 POE(30)POP(6)癸基四癸基醚 0.6 純水 適量 小麥發酵萃取物（5mg/ml) 0.1 防腐劑 適量 乙醇 10.0 全量 100.0 2 .放入小麥發酵萃取物之化妝水的效果 讓5名女性使用本化妝水後進行問卷調查。其結果對 於保濕認爲良好者爲5名，認爲普通爲2名。皆無發生肌 膚不適者。 ③ (36) 1358266 實施例1 Ο 放有小麥發酵萃取物的沐浴劑之製造 以活體功能改善爲目的添加小麥發酵萃取物製作成沐 浴劑。沐浴劑的基本成分如表1 4所示。 表14 成分 含有量 硫酸納 25.〇g 矽酸鈣 0.26g 香料（柚子） 0.5g 作爲放入小麥發酵萃取物之沐浴劑，係爲添加實施例 2所製造出的ll〇#g小麥發酵萃取物所製造者。讓102 人被驗者於隱蔽下使用放有萃取物者與未放萃取物之對照 組，進行使用於洗澡時的一般浴缸（160〜200公升）中 ® 時的問卷調查（（〇身體保溫程度、（2 )水不易冷卻的 程度、（3 )疲勞恢復效果、（4 )易入睡程度、（5 )肩 膀酸痛減輕程度、（6)肌肉疼痛治療效果、（7)神經痛 治療效果、（8)腰痛治療效果、（9)虛寒體質治療效果 ' (1 0 )香港腳改善效果、（Π )肌膚粗糙改善效果、（ 】2 )異位皮膚炎治療效果）。其結果’與對照組相比發現 有7%以上改善的有（1)身體保溫程度（10%) 、.（2) 水不易冷卻的程度（7·9%) 、（6)肌肉疼痛治療效果（ 13%) 、（8)腰痛治療效果（16%) 、（9)虛寒體質治 -40- (3) (37) 1358266 療效果（10%) 、（11)肌膚粗糙改善效果（7.3%)等 (Mantel-Haenszel檢定：P<〇.〇4)。由上述結果得知， 將小麥發酵萃取物作爲沐浴劑使用時，對於疼痛的緩和效 果與身體保溫確實有改善。 實施例1 1 放入小麥發酵萃取物之糖果的製造 ·( 1 )於原料的細砂糖、水飴、水中以5 : 5 : 5 : 1的 比率添加實施例2所製造的小麥發酵萃取物並混合、加熱 煮沸至120〜160 °C。 (2 )由1所得者於冷卻用鐵板上冷卻後，以棒狀延 伸再成型爲lg左右的粒狀糖。 將適量的本粒狀糖放入20 ml的水中，使其加熱溶解 。作爲該溶液中的小麥發酵萃取物有效成分，測定脂多醣 量爲4.6// g/g»將該糖給因感冒而有喉嚨痛的男女患者 Φ 6名攝取。其後直接對於喉嚨疼痛的改善作問卷調查。對 於喉嚨痛的改善有6名覺得有減輕（一標本符號檢定：p < 0.03 )。 實施例1 2 放入小麥發酵萃取物的醇類分解功能增強食品之製造 現今作爲醇類分解功能增強食品之購得製品中混合實 施例2所製造的小麥發酵萃取物，對於新效果之咽喉痛緩 和是否有效作檢討。 (38)1358266 購得商品：商標「飲酒息」 成分如表1 5所示 表15 成分 成分含有率 糖粉 78.98% 維他命C 10.00% Toyodene-P 5.00% 維他命B2 0.02% 香料（薄荷醇） 0.50% 七葉膽（Gynostemma pentaphyllum,皂角普） 3.50% T-flavorconc 13189B(類黃酮） 2.00%

現今的「飮酒息」中含有七葉膽（Gynostemma pentaphyllum)萃取物及綠茶萃取物，但對於作爲植物萃 取物的有效成分之一的脂多醣僅爲1包中0.002 // g程度 。因此添加適量的脂多醣含有量較高的小麥發酵萃取物時 ’可期待獲得新功能。小麥發酵萃取物的有效成分之一的 脂多醣之1包2g中添加1〜30/zg爲佳（作爲小麥發酵萃 取物爲5〜l5〇eg)，故製造出1包中含有50/ig的小麥 發酵萃取物之製品。飮酒息的製造步驟中每】〇〇 g的製品 中’添加2.5 m g的實施例2所製造的小麥發酵萃取物。 其結果’製造出每2g的製品中含有50//g的小麥發酵萃 取物之新製品。

-42- (39) 1358266 以邊喝酒邊唱卡拉OK時會有咽喉痛的成人男女20 名作爲對象，各1 0人服用原先的「飮酒息」，另1 〇名服 用含有小麥發酵萃取物的「飮酒息j 。對於公知效果的醇 類分解能強化效果、及咽喉痛緩和效果作檢討。其後直接 對於咽喉疼痛緩和效果作問卷調查。其結果，認爲「放有 小麥發酵萃取物之飮酒息」對於咽喉痛有減輕效果者爲 10名中8名，對於「飮酒息」的1〇名中2名認爲有減輕 φ 效果作比較，於統計上有顯著差（Fisher直接槪率法檢驗 ：P < 0.0 1 2 )。 E.小麥發酵萃取物的藥效實施例 實施例1 3 放入小麥發酵萃取物的甘油溶液之製造（對於異位性皮膚 炎的治療效果） 對於臉部、手腳、身體、脖子、手腕、背部等觀察到 # 皮疹、自覺症狀爲中等程度至重度症狀之難治性異位性皮 膚炎患者男女9名（25歲至34歲），將含有實施例2所 製造的小麥發酵萃取物50/zg/ml的50%甘油溶液以1 •天2〜3次，1次2〜3 ml的程度讓患者服用。對有自覺狀 態（搔癢感）的患者分類成輕度、中度、重度。使用2星 期至2個月後再度受診，評估效果。結果爲顯著有效者（ 皮疼的顯著改善與自覺狀態幾乎消失）爲4名（44% )， 有效（皮疹的輕度改善與自覺狀態的減少）爲4名（44 % )，不變爲〗名（11%)，惡化爲〇名（一標本符號檢定 -43- (§) (40) 1358266 ：P < 0.03 )，由上述得知有效率爲89%。 實施例1 4 小麥發酵萃取物的止痛作用 將實施例2所製得的小麥發酵萃取物溶解於蒸餾水中 ，對每匹老鼠使用探針器，進行〇·2 ml的經口投予。經 90分鐘後以腹腔內投予0.7%的乙酸，經5分鐘後觀察其 • 情況，測定30分鐘後引起身體抽動的數目。結果表示表 6中可阻斷蒸餾水投予對照組織身體抽動數30%之各試料 必要量。 來自大腸的低分子量脂多醣之有效成分作爲1時小麥 發酵萃取物爲7，顯示小麥發酵萃取物具有優良的止痛作 用。 表16小麥發酵萃取物對老鼠乙酸之止痛作用 處理 3 0%阻斷誘導量 相對活性 蒸餾水 230±190mg 1 小麥發酵萃取物 3 3 ± 3 5 m g 7.0

實施例1 5 小麥發酵萃取物的異位性皮膚炎抑制效果 欲對於小麥發酵萃取物的異位性皮膚炎之效果作調査 ’導入I型過敏模型。對於一群3〜4匹的雄性BALB/ c 老鼠進行1 g /老鼠之抗硝基苯、老鼠單株抗體的靜脈 -44- (41) 1358266 投予。一小時後將實施例2所製得之小麥發酵萃取物（4 A g/老鼠）進行腹部皮內投予或經口投予（100#g /老 鼠），再經1小時後，魚老鼠耳殼表面上塗佈20 "丨含有 0.25%的二硝基氟苯之丙酮一橄欖油混合溶液（4: 1)作 爲抗原。塗佈後於第1、2、24及4 8小時以厚度量測器測 定耳殼厚度，與塗佈前的厚度之差（△)作爲浮腫程度。 藥劑投予效果爲抗原投予I小時後被確認的早期反應、與 # 24小時後被誘導出的遲發反應，各抑制情況由以下式子 求得抑制率並評估。{抑制率=(1 —藥劑投予後的△耳 殼之浮腫/對照的△耳殼之浮腫）xlOO}結果如表17所 示。由表得知，小麥發酵萃取物於皮內投予、或經口投予 皆可抑制過敏反應。 表1 7小麥發酵萃取物的過敏反應抑制效果 小麥發酵萃取 投予量（/老鼠） 抑制率（％) 抑制率（％) 物投予方法 (1 h 後） (24h 後） 皮內投予 4 # g 8 1.0 102.1 經口投予 1 〇〇 ^ g 4 1.3 60.8 實施例1 6 小麥發酵萃取物的感染預防效果 欲對小麥發酵萃取物之感染預防效果作調查，導入耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌（M RSA )感染模型。對於一群 ]0匹雄性BALB/c老鼠（6〜8週齡）以200 mg/kg的 (42) 1358266 環磷酵胺（CY)進行腹腔內投予，經5天後進行實施例2 所製得之小麥發酵萃取物之皮內投予。3小時後進行 MRSA(3xl07菌落形成單位（CFU))的靜脈內投予， 調查其生存日數。結果如表18所示。由表得知小麥發酵 萃取物與生理食鹽水（對照組）群相比，於統計學上具有 顯著差（X2檢定’ ρ<0·001)，顯示對於MRSA具有感 染預防效果。 表18小麥發酵萃取物的MRSA感染預防效果 投予藥劑 生存率 危險率 生理食鹽水 0/10 小麥發酵萃取物（0.004j[z g) 9/10 P < 0.001 小麥發酵萃取物（0.04/i g) 6/10 P < 0.005 實施例1 7 ® 小麥發酵萃取物的癌細胞轉移治療效果 欲調查小麥發酵萃取物之癌細胞轉移治療效果，導入 MethA癌細胞之肺轉移模型。對於—群匹雄性balB /c老鼠（6〜8週齡）進行ιχι〇5細胞之MethA細胞的 靜脈內投予’ 1 2天後4天連續，進行實施例2所製造的 小麥發酵萃取物之皮內投予。細胞移植2〇天後剖開檢查 ’摘出肺’進行福馬林固定。肺由肉眼觀察，測定結節數 。結果如表1 9所示。由表得知，小麥發酵萃取物與生理 食鹽水（對照組）相比，於統計學上具有顯著差（t 一檢 -46- (43) 1358266 定’ ρ<〇·001)，顯示對於MethA之肺癌細胞轉移具有治 療效果。 辈19小爹發酵萃取物的MethA肺癌細胞轉移治療效果 投予藥劑 結節數 (平均±標準差） 危險率 生理食鹽水 6〇±11 小麥發酵萃取物（40 // g/kg) 33±8 P<0.00 1 小麥發酵萃取物（400 a g/kg) 】9±6 P<0.001 F.豆腐渣發酵萃取物之相關實施例 實施例1 8 豆腐渣發酵萃取物的製造· (1 ) 2公升的三角錐形瓶中放入1.0 L的水、與0.2 g的磷酸第一鉀、1.15 g的磷酸第二鉀、8 g的食鹽、0.2 g的氣化鉀。 (2 )於1中加入20g的乾燥豆腐渣。 (3) 將2以高壓滅菌釜滅菌。 (4) 種菌的調製。如前組成所調製的2%豆腐渣培 養棊5 ml中放入由小麥粉分離出的稻穀病原細菌之1個 菌落’於3 71下緩緩攪拌1晚（1 5小時）使其發酵，完 成裒腐渣用種菌的準備。 (5 )於3加入4全量，於3 7 °C下緩緩攪拌下發酵4 8 小時° -47- (44) 1358266 (6) 5的豆腐渣發酵溶液以高壓滅菌釜進行i2〇乞 20分鐘的加熱萃取。將此進行離心分離（窪田8 8 00， 2000 rpm，10分鐘），回收澄淸液，作爲豆腐渣發酵萃 取物。 (7) 乾燥重量的測定：將預先稱取0.3 ml後移至 .1 · 5 ml的塑膠試管’冷凍後，以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥 時爲5.97 mg。因此，6的豆腐渣發酵萃取物之乾燥重量 φ 爲每1ml的溶液中爲19.9 mg，全量爲1〇〇〇 ml時爲19.9 g 0 (8 )以Bradford蛋白濃度測定法，將蛋白質定量 BSA作爲標準蛋白質，測定10倍稀釋之樣品的蛋白質質 量。結果如表1 5。 (9 )核酸含有量測定：將經1 〇〇倍稀釋的樣品進行 210〜340 nm的吸光度測定。減去260 rim吸光度至320 nm的吸光度所得値、與DNA的吸光度10D算出5〇eg Φ的最大含有量》 (1〇)糖含量的測定：藉由酚硫酸法將葡萄糖作爲標 " 準糖進行測定》 _ ( I 1 )藉由丨imulus測定之limulus活性物質含有量 的測定：limulus活性物質量爲使用生化學工業的 toxycolor system，作爲標準limulus活性物質使用生化學 工業Et- 1。 ⑧ (45) 1358266 表20豆腐渣發酵萃取物中的成分含量 成分 (m g/g ) 蛋白質 112 糖 537 核酸 無法檢測 Limulus活性物質 10 # 實施例1 9 豆腐渣萃取物之免疫賦活作用 於48格培養皿中放入作爲人類巨噬細胞使用的急性 骨髓性白血病細胞株之THP-1 ( 1 X 1 06個/ 250 a 1 :放有 10%牛胚胎血淸之RPMI 1640培養基），進行30分鐘的 預培養。使各樣品的最終濃度成爲1 0 0〜1 0 0 0 0 n g / m 1加 入250 /z 1(最終量5 00 //1)。調製出樣品中含有多黏菌 素B(12.5yg/ml)之群（成爲僅含100 ng/ml的多黏 9 菌素B的群）。經4小時培養後，回收培養澄淸液及細胞 。澄淸液的TNF活性使用L - 929細胞障礙試驗進行測定 。結果如表21所示。豆腐渣發酵萃取物於多黏菌素B存 在下亦可由巨噬細胞中產生TNF，但低分子量脂多醣及 limulus陽性糖脂質於多黏菌素B存在下並不會由巨噬細 胞中產生TNF。因此可得知豆腐渣發酵萃取物與低分子量 脂多醣或limulus陽性糖脂質相比具有相異的生物活性。 (46) 1358266 表21藉由豆腐渣發酵萃取物之由巨噬細胞的TNF產生 與多黏菌素B之阻斷效果（豆腐渣發酵萃取物的TNF誘 導活性） 樣品 濃度 豆腐渣發酵萃 取物中添加多 黏菌素B 豆腐渣發酵萃 取物中未添加 多黏菌素B 低分子量 脂多醣中 添加多黏 菌素B 低分子量脂 多醣中未添 加多黏菌素 B 小麥發酵萃 取物中添加 多黏菌素B 小麥發酵萃 取物中未添 加多黏菌素 B 0 0 0 0 0 0 0 _ 100 N.D. 0.45 0 0.39 0 3.27 _ 1000 0.38 4.6 0 0.42 0.5 11.3 _ 10000 11.1 11.1 0 0.28 14.4 25.3 _ N.D.:未測定 G.米粉發酵萃取物之相關實施例 米粉發酵萃取物的製造 鲁實施例20 (1) 2公升的三角錐形瓶中放入1.0 L的水、與〇·2 g的磷酸第一鉀、1.15 g的磷酸第二鉀、8 g的食鹽、0.2 g的氯化鉀。 (2) 於1中加入20 g的乾燥米粉。 (3) 將2以高壓滅菌釜滅菌。 (4) 種菌的調製。如前組成所調製的2%乾燥後培 養基5 ml中放入由小麥粉分離出的稻穀病原細菌之1個 菌落’於37°C下緩緩攪拌1晚（15小時）使其發酵，完 -50- (47) 1358266 成米粉用種菌的準備。 (5) 於3加入4全量，於37°C下緩緩攪拌下發酵72 小時。 (6) 5的米粉發酵溶液以高壓滅菌釜進行120 °C 20 分鐘的加熱萃取。將此進行離心分離（窪田8800，2000 rpm，10分鐘），回收澄淸液，作爲米粉發酵萃取物。

I (7) 藉由】imulus測定之limulus活性物質含有量的 # 測定：limulus活性物質量爲使用生化學工業的toxycolor system，作爲標準limulus活性物質使用生化學工業Et- 1。測定米粉發酵萃取物中的limulus活性物質含有量爲 1 . 7 y 1 / m g。 實施例2 1 米粉萃取物之免疫賦活作用 於48格培養皿中放入作爲人類巨噬細胞使用的急性 • 骨髓性白血病細胞株之ΤΗΡ-1(1χ106個/ 250/zl:放 有1 0%牛胚胎血淸之RPMI 1 640培養基），進行30分鐘 的預培養。使各樣品的最終濃度成爲1〜1 0 0 0 0 n g / m 1加 1 入250 #1(最終量500 # 1)。調製出樣品中含有多黏菌 素B ( 12.5 " g/ ml )之群。經4小時培養後，回收培養 澄淸液及細胞。澄淸液的TNF活性使用L - 929細胞障礙 試驗進行測定。結果如表2 2所示。米粉發酵萃取物於多 黏菌素B存在下亦可由巨噬細胞中產生TNF，但低分子 量脂多醣及limulus陽性糖脂質於多黏菌素B存在下並不 • 51 - (48) J358266 會由巨隨細胞中產生TNF。因此可得知米粉發酵萃取物與 低分子量脂多醣或limulus陽性糖脂質相比具有相異的生 物活性。 表22藉由米粉發酵萃取物之由巨噬細胞的TNF產生與 多黏菌素B之阻斷效果（米粉發酵萃取物的TNF誘導活 性） 樣品 米粉發酵萃取物中 米粉發酵萃取物中 低分子量脂多醣中 低分子量脂多醒中 濃度 添加多黏菌素B 未添加多黏菌素B 添加多黏菌素B 未添加多黏菌素B 0 0 0 0 0 1 ------ 0 0 0 0.1 10 一-- 0 0 0 2.2 _U)0 0 0.1 0 6.1 _!〇〇〇 0.1 0.6 0 23.9 10000 0.5 2.4 0 29.3

Η· '诲帶芽發酵萃取物之相關實施例 實施例22 $帶芽和布蕪發酵的製造 (1 ) 2公升的三角錐形瓶中放入1.0 L的水、與0.2 g的磷酸第一鉀、1.15 g的磷酸第二鉀、8 g的食鹽、0.2 g的氯化鉀。 (2) 於1中加入20g的海帶芽和布蕪米粉。 (3) 將2以高壓滅菌釜滅菌。 -52- ⑧ (49) 1358266 (4) 種菌的調製。如前組成所調製的2%乾燥後培 養基5 ml中放入由海帶芽和布蕪分離出的稻穀病原細菌 之1個菌落，於37°C下緩緩攪拌1晚（15小時）使其發 酵，完成海帶芽和布蕪用種菌的準備。 (5) 於3加入4全量，於3 71：下緩緩攪拌下發酵72 小時》 (6) 5的海帶芽和布蕪發酵溶液以高壓滅菌釜進行 # 120°C 20分鐘的加熱萃取。將此進行離心分離（窪田 8800，2000 rpm，10分鐘），回收澄淸液，作爲海帶芽 和布蕪發酵萃取物。 (7) 藉由limulus測定之limulus活性物質含有量的 測定：limulus活性物質量爲使用生化學工業的toxycolor system，作爲標準limulus活性物質使用生化學工業Et — 1。測定海帶芽和布蕪發酵萃取物中的limulus活性物質 含有量爲132/zl/mg。 實施例23 '海帶芽和布蕪萃取物之免疫賦活作用 1 於48格培養皿中放入作爲人類巨噬細胞使用的急性 骨髓性白血病細胞株之THP — 1 ( I x 1 〇6個/ 25〇 v I ··放 有10%牛胚胎血淸之RPMI 164〇培養基），進行30分鐘 的預培養。使各樣品的最終濃度成爲1〜10000 ng/ml加 入250//1(最終量500#1)。調製出樣品中含有多黏菌 素B ( 1 2 · 5 " g / m 1 )之群。經4小時培養後，回收培養 -53- (50) 1358266 澄淸液及細胞。澄淸液的TNF活性使用L- 929細胞障礙 試驗進行測定。結果如表22所示。海帶芽和布蕪發酵萃 取物於多黏菌素B存在下亦可由巨噬細胞中產生TNF’ 但低分子量脂多醣及limulus陽性糖脂質於多黏菌素B存 在下並不會由巨噬細胞中產生TNF。因此可得知海帶芽和 布蕪發酵萃取物與低分子量脂多醣或limulus陽性糖脂質 1 相比具有相異的生物活性。 表23藉由海帶芽和布蕪發酵萃取物之由巨噬細胞的TNF 產生與多黏菌素B之阻斷效果（海帶芽和布蕪發酵萃取物 的TNF誘導活性） 樣品 海帶芽和布蕪發酵萃 海帶芽和布蕪發酵萃 低分子量脂多 低分子量脂多 濃度 取物中添加多黏菌素 取物中未添加多黏菌 醣中添加多黏 醣中未添加多 B 素B 菌素B 黏菌素B 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0.1 10 0 0 0 2.2 100 0 3.2 0 6.1 1000 2.4 14.4 0 13.9 10000 18.7 31.8 〇 29.3 1

產業上可利用性 本發明係關於可便宜地製造出安全免疫賦活物質的植 物發酵萃取物，所得之植物發酵萃取物可利用於含人類的 -54- ⑧ (51) 1358266 哺乳動物（具體爲家畜、寵物等）、鳥類（具體爲飼養雞 、賞鳥類等）、兩生類、爬蟲類、魚類（具體爲水產養殖 魚、寵物魚類等）、無脊椎動物及醫藥品、動物用醫藥品 、醫藥部外品、化妝品、食品、功能性食品、飼料及浴用 劑等。 ~ 【圖式簡單說明】 • 〔圖1〕圖1表示藉由添加小麥發酵萃取物之飼料所 顯示的錦鯉疱疹發病抑制效果圖。

Claims (1)

1358266 Μ年丨\月(〇日修正本1 ±4 第094108978號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國100年11月 1〇 曰修正 十、申請專利範圍 1· 一種發酵及培養方法’其特徵爲將小麥粉藉由.稻 穀病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其發酵， 同時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 2. —種發酵及培養方法，其特徵爲將豆腐渣藉由稻 穀病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其發酵， 同時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 3. —種發酵及培養方法，其特徵爲將米粉藉由稻穀 病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其發酵，同 時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 4. 一種發酵及培養方法，其特徵爲將海帶芽和布蕪 藉由稻穀病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其 發酵，同時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 5. —種植物發酵萃取物，其特徵爲將小麥粉藉由稻 穀病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其發酵， 同時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 6. —種植物發酵萃取物，其特徵爲將豆腐渣藉由稻 穀病原細菌（Pantoea agglomerans)在單獨下使其發酵， 同時在單獨下培養該稻穀病原細菌。 7. —種植物發酵萃取物，其特徵爲將米粉藉由稻穀 病原細菌（Pantoea agglomerans)單獨下使其發酵，同時 單獨下培養該稻穀病原細菌。 1358266 8· ~種植物發酵萃取物，其特徵爲將海帶芽和布蕪 藉由稻榖病原細菌（Pantoea aggl〇nierans)單獨下使其發 酵’同時單獨下培養該稻榖病原細菌。 9- 一種植物發酵萃取物粉末，其特徵爲如申請專利 範圍第5項至第8項中任—項之植物發酵萃取物所得者。 10· —種植物發酵萃取物配合物，其特徵爲添加如申 請專利範圍第5項至第8項中任一項之植物發酵萃取物。 11·如申請專利範圍第10項之植物發酵萃取物配合 物，其中該植物發酵萃取物配合物爲醫藥品、動物用醫藥 品、醫藥部外品、化妝品 '食品、功能性食品、飼料或沐 浴劑。 12. 如申請專利範圍第5項至第8項中任一項之植物 發酵萃取物，其爲顯示即使在多黏菌素B存在下亦表示巨 噬細胞活化能之物理化學性質者。 13. 如申請專利範圍第5項至第8項中任一項之植物 發酵萃取物，其爲具有免疫賦活活性。 1358266 第094108978號專利申請案 . 中文圖式修正本 民國100年2月17日修正

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