KR20140140387A

KR20140140387A - 나노형 김치 유산균

Info

Publication number: KR20140140387A
Application number: KR1020130061200A
Authority: KR
Inventors: 김길동
Original assignee: 바이오제닉스코리아 주식회사
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2014-12-09
Also published as: WO2014193014A1; US20160074443A1; KR101638984B1; US9763988B2

Abstract

본 발명은 나노형 김치 유산균에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 장내 환경 개선 효과가 뛰어난 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 (L. plantarum)유산균에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노형 김치 유산균은 장내 부패균의 억제효과 및 면역기능 활성화를 통한 장내 환경 개선 효과가 있으며, 대장염, 대장암을 포함하는 대장 질환의 예방 및 치료 효과가 우수하다. 또한 장내 흡수가 용이하도록 균일한 입자로 구성되어 있어, 농도에 따라 장내 환경 개선 효과가 비례적으로 증가하는 특징을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 나노형 김치 유산균은 식품 첨가제로서 식품 본연의 맛과 향을 전혀 해치지 않고, 유산균이 갖는 효과를 그대로 제공할 수 있으며, 내열성이 강하여, 열을 가하는 식품에 첨가여도 효과가 유지되는 특징이 있다.

Description

나노형 김치 유산균{Nano-Sized Lactic Acid Bacteria from Kimchi}

본 발명은 나노형 김치 유산균에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 장내 환경 개선 효과가 뛰어난 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 (L.plantarum)유산균에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria, lactobacillus)은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 젖산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질이 있어 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제(整腸劑)로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.

김치는 유산균에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 유산균으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues) 등이 있다.

김치에서 분리한 유산균에 관한 특허로는 항균 펩타이드 물질을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스 BH5 (대한민국 특허 제413335호), 항산화 활성이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 NC (대한민국 특허 제771209호), 박테이로신을 생산하는 유산균주 (대한민국 특허 제1068531호) 등이 있다.

그러나 종래 공개된 김치 유산균은 모두 생균제(Probiotics)에 관한 것으로서, 식품으로 섭취 시 장내 환경에서 생균수가 급격히 감소할 뿐만 아니라, 장내에서 흡수가 이뤄지지 않아 고유한 효과가 떨어지는 문제점을 갖고 있으며, 일정 부피의 배양액 내에서 생육할 수 있는 균주가 제한되어 있어, 1일 섭취량이 제한된다는 문제가 있었다.

이에, 본 발명의 목적은 김치로부터 분리한 유산균 중 장내 환경 개선 효과가 가장 뛰어난 유산균을 동정하고, 이를 나노형 김치 유산균으로 제공함으로써 상기와 같은 문제점을 해결하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 대장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 균주로부터 나노형 김치 유산균을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 균주로 제조한 나노형 김치 유산균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노형 김치 유산균을 포함하는 식품 첨가제 또는 발효식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노형 김치 유산균을 포함하는 대장질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노형 김치 유산균을 포함하는 대장질환 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 나노형 김치 유산균은 장내 부패균의 억제효과 및 면역기능 활성화를 통한 장내 환경 개선 효과가 있으며, 대장염, 대장암을 포함하는 대장 질환의 예방 및 치료 효과가 우수하다. 또한 장내 흡수가 용이하도록 균일한 입자로 구성되어 있어, 농도에 따라 장내 환경 개선 효과가 비례적으로 증가하는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명에 따른 나노형 김치 유산균은 식품 첨가제로서 식품 본연의 맛과 향을 전혀 해치지 않고, 유산균이 갖는 효과를 그대로 제공할 수 있으며, 내열성이 강하여, 열을 가하는 식품에 첨가여도 그 효과가 유지되는 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 김치 유산균의 (a) 콜로니 관찰 이미지 및 (b) 그람 염색 결과 이미지이다.
도 2는 본 발명의 김치 유산균(SIID11558)의 16S rRNA 서열을 분석하여 나타낸 분자계통도이다 (왼쪽 아래의 선은 스케일바, 계통기 분기에 위치하는 숫자는 부트스트렙 값, 주명 말미의 T는 그 종의 기준주(Type strain)를 나타낸다.)
도 3은 본 발명의 나노형 김치 유산균 nF1의 제조 공정도이다.
도 4는 본 발명의 김치 유산균을 나노화 처리 전후로 관찰한 현미경 사진이다. (a) 나노화 처리 전 : 막대모양, (b) 나노화 처리 후 : 구형.
도 5는 본 발명의 실험 모델의 체중변화를 측정한 결과이다.
도 6(a)는 nF1 처리를 한 대장염 유도 마우스의 대장 길이 변화, (b)는 nF1 파우더를 첨가한 김치를 투여한 대장염 유도 마우스의 대장 길이 변화를 나타내는 그래프이다. (a~d는 Duncan's multiple range tests에 따른 유의적인 차이(p < 0.05)를 의미함)
도 7은 대장 조직 내 병리학적 관찰 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 nF1 처리를 한 대장염 유도 마우스의 염증성 사이토카인 발현량 변화를 나타내는 그래프이다. (a~d는 Duncan's multiple range tests에 따른 유의적인 차이(p < 0.05)를 의미함)
도 9는 nF1 파우더를 첨가한 김치를 투여한 대장염 유도 마우스의 염증성 사이토카인 발현량 변화를 나타내는 그래프이다. (a~d는 Duncan's multiple range tests에 따른 유의적인 차이(p < 0.05)를 의미함)
도 10은 nF1 처리를 한 대장염 유도 마우스의 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 변화를 나타내는 그래프이다. (a~d는 Duncan's multiple range tests에 따른 유의적인 차이(p < 0.05)를 의미함)
도 11은 nF1 파우더를 첨가한 김치를 투여한 대장염 유도 마우스의 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 변화를 나타내는 그래프이다. (a~d는 Duncan's multiple range tests에 따른 유의적인 차이(p < 0.05)를 의미함)
도 12는 마우스의 대장 내 염증 관련 유전자(iNOS, COX-2)의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 대장염 유도 마우스의 장내 유산균 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 대장염 유도 마우스의 장내 유해효소 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공한다.

본 발명자들은 김치에서 유산간균을 분리하여 장내 환경 개성 효과가 가장 우수한 미생물을 선별하였으며, 이를 동정한 결과 그람 양성 및 간균 형태의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum)인 것으로 밝혀졌다. 상기 신균주는 일본 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(National Institute of Technology and Evaluation, NITE; International Patent Organism Depositary, IPOD)에 2012년 11월 8일자로 "nF1"으로 기탁하였다 (NITE P-1462). 본 균주는 장내 부패균의 억제효과 및 면역기능 활성화를 통한 장내 환경 개선 효과가 있으며, 대장염, 대장암을 포함하는 대장 질환의 예방 및 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

본 발명의 김치 유산균 또는 이의 배양상등액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 김치 유래 유산균을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이들의 배양상등액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 과자류, 스낵류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 유제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 건강음료, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 의미에서 건강식품을 모두 포함한다.

상기 대장질환은 대장염 또는 대장암을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액에는 유효성분으로 포함하는 대장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에는 임상 투여 시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 주성분인 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 첨가제를 선택하여 통상적인 약제학적 제형의 조성물로 제조할 수 있다.

담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 콩기름, 미결정 셀룰로오스 또는 만니톨이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC), 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨 또는 크로스포비돈 중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨 또는 아스파탐 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Ma-CMC), 베타-싸이크로덱스트린, 백납 또는 산탄검 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠, 파라옥시안식향산프로필, 또는 소르빈산칼륨 중에서 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 대장 질환을 효율적으로 치료 또는 예방하는 목적으로 사용되는 것으로 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바 없으며, 음료, 파우더, 캅셀, 연질캅셀, 정제, 껌, 점착 타입 액제 조성물로 사용될 수 있으며, 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형으로 사용할 수 있고, 탕제, 환제, 정제, 산제, 과립제 등의 제제로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에는 상기 주요성분 이외에도 보조성분으로 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 올리고당, 아미노산 등의 화합물을 사용할 수 있으며, 이 중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 내지 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성 효과를 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린(Chlorophyllin), 플라보노이드(Flovonoid) 등의 천연색소 및 감미 성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 나노형 김치 유산균의 균체는 입도 분포에서의 최빈값(입도)이 1.0 ㎛ 이하인 것이며, 바람직하게는 0.5~1.0 ㎛인 것이다.

본 발명에서, "입도 분포에서의 최빈값"은 균의 크기를 나타내는 지표가 되는 값으로, 균체의 입자직경을 측정했을 때의 입도 분포에서의 상대빈도가 최대가 되는 입자직경을 말한다.

본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체의 형태는 생균 또는 사균 모두 가능하지만, 생균의 경우 제품 제조 이후의 배송 또는 진열 시에 형태변화를 일으킬 가능성이 있기 때문에, 그 이상 형태 변화를 일으키지 않는 사균인 것이 바람직하다.

유산균은 배양시의 생육 환경이 열악해지면, 그 스트레스로 형태가 변화되는 것으로 알려져 있다. 그래서 본 발명에서는, 배양 및 가공조건을 제어함으로써 유산균의 형태가 일정하게 되도록 유지하면서 유산균을 증식시켜, 상기한 입도 분포에서의 최빈값을 갖는 나노형 김치 유산균을 제조한다.

또한, 본 발명의 "나노형 김치 유산균의 균체"는 분산 처리된 것이 바람직하다.

분산 처리의 수법으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 균의 배양액을 습식으로 150 kgf/cm²(1.5 MPa)정도의 고압 호모지나이저로 분산하는 방법을 들 수 있다.

이 경우, 미리 공지의 분산제 또는 부형제를 배양액에 첨가해 두는 것이 바람직하며, 이것에 의해, 균체의 재응집을 효율적으로 방지할 수 있다. 사용하는 분산제 및 부형제의 첨가량은 균체의 성상에 따라 변화되지만, 질량 환산으로 균체에 대하여 1∼100배량이 바람직하고, 2∼20배량이 보다 바람직하다. 적합한 분산제 및 부형제로서는 트레할로스, 덱스트린, 스킴 밀크 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 "나노형 김치 유산균의 균체"를 최종적으로 분말로서 얻기 위해서는, 배양액에 공지의 분산제·부형제 등을 첨가하여 균체가 재응집하지 않도록 분산 처리한 후, 동결건조나 분무건조 하는 것이 바람직하다. 이에 따라 물에 대한 분산성이 우수한 균체 분말을 얻을 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체는, 입도가 1.0 ㎛ 이하의 나노미터(nm) 사이즈로까지 미세화된 것이다.

또, 이 균체는 상기 방법에 의해 건조분말로 하고, 당해 분말을 생리적 소화액에 재현탁한 경우에도 균체 입도가 1.0㎛ 이하를 유지한다. 생리적 소화액이란 공지의 방법으로 조제된 인공 위액 혹은 장액을 의미한다.

본 발명의 나노형 김치 유산균의 제조 시 첨가되는 분산제 또는 부형제의 양에 따라 건조 분말 1 g 당 김치 유산균 락토바실러스 플란타룸 균주의 농도를 조절할 수 있다. 본 발명은 나노형 김치 유산균 분말 1 g 당 김치 유산균 균주가 1억 내지 5조 마리가 포함되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 분말 1 g 당 균주 1조 내지 5조 마리를 포함할 수 있다.

본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체는 그대로 제품화 할 수도 있으나, 일반적으로는, 각종 첨가제 또는 향미료(flavor)를 첨가, 배합함으로써 풍미를 높이거나, 필요한 형상으로 제조하여 최종 제품을 만들 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 상기 나노형 김치 유산균을 포함하는 식품 첨가제 또는 발효식품을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 나노형 김치 유산균에 첨가, 혼합되는 성분으로는 각종 당질이나 유화제, 감미료, 산미료, 과즙 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 벌꿀 등의 당류; 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락티톨, 파라티니트 등의 당 알코올; 수크로스 지방산 에스테르, 글리세린당 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제 등을 들 수 있다. 그 밖에도, 비타민 A, 비타민 B류, 비타민 C, 비타민 E 등의 각종 비타민류나 허브 추출물, 곡물 성분, 야채 성분, 젖 성분 등을 배합해도, 우수한 풍미의 나노형 김치 유산균 조성물을 얻을 수 있다.

또한, 향미료로서는 요구르트계, 베리계, 오렌지계, 모과계, 자소계, 시트러스계, 애플계, 민트계, 그레이프계, 페어, 카스타드 크림, 피치, 멜론, 바나나, 트로피컬, 허브계, 홍차, 커피계 등의 향미료를 들 수 있고, 이것들을 1종 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 향미료의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 풍미면에서 균체 내에 0.05∼0.5질량%, 특히 0.1∼0.3질량% 정도가 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 나노형 김치 유산균을 포함하는 대장질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.

이상에서 설명한 본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체는 고형상, 액상 등 어느 형태의 제품으로 할 수도 있다. 구체적으로는, 의약적으로 수용한 염, 부형제, 보존제, 착색제, 교미제 등과 함께, 의약품 또는 식품의 제조분야에서의 공지의 방법에 의해, 음료, 과립, 정제, 캡슐제 등의 여러 형태로서 제품화 할 수 있다.

또, 본 발명의 나노형 김치 유산균 균체는 식품 조성물로 이용할 수 있으며, 특히 건강식품에 이용할 수 있다. 건강식품이란 통상의 식품보다도 적극적인 의미로, 보건, 건강유지·증진 등을 목적으로 한 식품을 의미한다. 그 형태는 액체, 반고형, 고형의 어떤 것이어도 되고, 구체적으로는, 쿠키, 전병, 젤리, 양갱, 과자, 빵, 케익 등의 과자류; 요구르트, 청량음료, 영양음료, 식혜, 과일음료 등의 음료류; 스프, 아이스크림, 분유, 김치, 라면 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체는 로션(화장수), 화장용 크림류, 유액, 화장수, 팩제, 스킨 밀크(유제), 젤제, 파우더, 립 크림, 립스틱, 언더 메이크업, 파운데이션, 썬 케어, 목욕용제, 보디 샴푸, 보디 린스, 비누, 클렌징 폼, 연고, 첩부제, 젤리제, 에어로졸제 등 여러 제품 형태로 피부 외용제에 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 나노형 김치 유산균의 균체에는, 하기에 예시되는 것과 같은 화장품, 의약부외품, 의약품에서 통상 사용되는 각종 성분이나, 첨가제를 필요에 따라 적당하게 배합할 수 있다.

구체적으로, 글리세린, 바셀린, 요소, 히알루론산, 헤파린 등의 보습제; PABA 유도체(파라아미노벤조산, 에스칼롤 507(아이에스비·재팬(주)) 등), 신남산 유도체(네오헬리오판, 파르솔 MCX(DSM 뉴트리션 재팬(주), 썬가드 B((주)시세이도) 등), 살리실산 유도체(옥틸살리실레이트 등), 벤조페논 유도체(ASL-24, ASL-24S((유)쇼난케미칼 서비스) 등), 디벤조일메탄 유도체(파르솔 A, 파르솔 DAM(DSM 뉴트리션 재팬(주) 등), 복소환 유도체(티누빈계 등), 산화티탄 등의 자외선흡수제·산란제; 에데트산 2나트륨, 에데트산 3나트륨, 시트르산, 시트르산 나트륨, 타르타르산, 타르타르산 나트륨, 락트산, 말산, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 봉쇄제; 살리실산, 유황, 카페인, 탄닌 등의 피지 억제제; 염화벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로로헥시딘 등의 살균·소독제; 염산디펜히드라민, 트라넥삼산, 구아이아줄렌, 아줄렌, 알란토인, 히노키티올, 글리시리즈산 및 그 염, 글리시리즈산 유도체, 글리실레틴산 등의 항염증제; 비타민 A, 비타민 B군(B1, B2, B6, B12, B15), 폴산, 니코틴산류, 판토텐산류, 비오틴, 비타민 C, 비타민 D군(D2, D3), 비타민 E, 유비퀴논류, 비타민 K(K1, K2, K3, K4) 등의 비타민류; 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌, 리신, 글리신, 글루타민, 세린, 시스테인, 시스틴, 티로신, 프롤린, 아르기닌, 피롤리돈카르복실산 등의 아미노산 및 그 유도체; 레티놀, 아세트산 토코페롤, 아스코르브산 인산 마그네슘, 아스코르브산 글루코시드, 알부틴, 코지산, 엘라그산, 태반 추출액 등의 미백제; 부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 갈산 프로필 등의 항산화제; 염화아연, 황산아연, 석탄산아연, 산화아연, 황산알루미늄칼륨 등의 수렴제; 글루코스, 프룩토스, 말토스, 수크로스, 트레할로스, 에리트리톨, 만니톨, 크실리톨, 락티톨 등의 당류; 감초, 카밀레, 마로니에, 범의귀, 작약, 모과나무, 황금, 황벽나무, 황련, 삼백초, 은행잎 등의 각종 식물 추출물 등 이외에, 유성 성분, 계면활성제, 증점제, 알코올류, 분말성분, 색소 등을 적당하게 배합할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 신규 김치 유산균의 동정

신규한 김치 유산균 개발을 위하여 본 발명자들은 김치 추출물을 희석하여 MRS 아가(Oxoid, Hampshire, 영국) 배지에서 30℃, 호기조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 전형적인 유산균 형태로 광택이 흐르는 유백색의 콜로니를 선별하여 분리한 후, 선별된 콜로니를 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였다. 순수 배양된 유산균 중 장내 환경 개선 효과가 가장 뛰어난 균주(SIID11558)을 최종 선발하여 동정 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, SIID11558 균주는 유백색의 콜로니를 형성하며, 형태적으로 그람 양성이며, 0.8~0.9 × 1.2~1.5 ㎛ 크기의 간균임을 확인하였다.

주식회사 테크노스루가·랩(TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd.)에서 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 결정 및 분석을 수행하였으며, 이를 통하여 분리된 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum)과 99.9%의 높은 상동성을 가지는 신규한 미생물로 동정되었다. 분리된 균주의 분석된 16S rRNA 염기서열은 서열번호 1과 같으며, 분자계통학적 위치를 나타내는 계통 발생적 분지도(phylogenetics tree)는 도 2와 같다. 16S rDNA의 PCR 증폭에는 정방향 프라이머(5'- ga gtt tga tcc tgg ctc ag - 3': 서열번호 2)와 역방향 프라이머 (5'- tcg taa caa ggt agc c - 3': 서열번호 3)를 사용하였으며, PCR 증폭으로부터 사이클시퀀스까지의 조작은 하기 각 프로토콜에 근거하였다.

- DNA 추출 : 아크로모벱티다아제 (와코준야쿠, 오사카)

- PCR : PrimeSTAR HS DNA Polymerase (다카라바이오, 시가)

- 사이클시퀀싱 : BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, CA, USA)

- 시퀀싱 : ABI PRISM 3130 x1 Genetic Analyzer System (Life Technologies, CA, USA)

- 염기서열결정 : Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, AUS)

- BLAST 상동성 검색 및 간이분자계통 해석 : 아폴론 2.0 소프트웨어 (테크노스루가·랩, 시즈오카)

- 데이터베이스 : 아폴론 DB-BA 7.0 데이터베이스 (테크노스루가·랩, 시즈오카), 국제염기서열 데이터베이스(GeneBank/DDBJ/EMBL)

상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규 미생물은 일본 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(National Institute of Technology and Evaluation, NITE; International Patent Organism Depositary, IPOD)에 2012년 11월 8일자로 "nF1"으로 기탁하였다 (NITE P-1462).

실시예 2. 나노형 김치 유산균 nF1 분말의 제조

상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 nF1 균주를 5질량% 포도당을 첨가한 공지의 영양 배지에서, 20 질랑% 수산화나트륨 수용액으로 배양하되 pH가 중성이고, 온도가 36.5℃인 조건에서 배양하였으며, 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 하였다. 본 발명의 나노형 김치 유산균 분말 제조 시pH의 범위는 pH 5~7의 중성 영역인 것이 바람직하며, pH 6.5인 것이 가장 좋다.

배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분 간 가열 멸균 처리한 후, 균체를 PBS로 세정하고, 균체 중량에 대하여 9배의 덱스트린을 부형제로서 첨가한 후 믹서로 분산하였다. 다음으로 이를 동결 분무건조하여 분말 시료를 조제하였으며, 제조한 분말 1 g 당 본 발명의 김치 유산균 nF1 균주가 1조 마리 이상 포함되어 있음을 확인하였다. 나노화 김치 유산균 제조 공정을 도 3에 간략히 나타내었다.

상기 nF1 분말을 다시 균체 농도로 10 mg/ml가 되도록 조정하면서 PBS에 현탁하였다. 가공공정 시의 pH는 6.5로 유지하였다. 상기와 같이 균주의 나노화 처리 결과를 현미경으로 촬영하여 확인하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이 김치에서 추출한 nF1 균주는 나노화 처리 전 막대모양의 간균이었으나, 상기 나노화 처리 후는 구균에 가까운 형태를 나타냄으로써 군체끼리 재응집하지 않는 성질을 갖게 되었음을 알 수 있다. 나노화 처리된 nF1 균주는 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛로 나타났으며, 재응집하지 않는 성질이 있어 물 또는 기타 용매에 대한 분산성이 뛰어난 유산균을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 나노형 김치 유산균 분말을 제조함에 있어서, 균체 배양액에 첨가되는 부형제의 양에 따라 분말에 포함되는 유산균의 농도를 조절할 수 있다. 균체 중량과 동일한 양의 덱스트린을 부형제로 첨가하여 제조한 경우, 제조된 분말 1 g 당 김치 유산균 5조 마리가 포함되며, 균체 중량에 대하여 4배의 덱스트린을 첨가하여 제조한 경우 1 g 당 2조 마리 이상의 균주가 포함되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 대장염 마우스 모델을 이용한 장내 개선 효과 실험

3-1) 실험 동물 및 시험 물질

실험 동물은 6주령의 Balb/c 수컷 마우스를 사용하였으며, 정상군(Normal)을 제외한 모든 군에 2% DSS (Dextran sulfate sodium)를 투여하여 대장염을 유도하였다. 구체적으로, 마우스 모델은 대장염이 유발되지 않은 정상군(normal)과 DSS 용액으로 대장염을 유발한 실험군으로 분류하였으며, 실험군은 시험물질을 투여하지 않은 대조군(control), nF1 고농도 투여군(nF1-H), nF1 중간 농도 투여군(nF1-M), nF1 저농도 투여군(nF1-L), 표준화 김치 투여군(N-Kimchi), nF1 분말을 첨가한 김치 투여군(nF1-Kimchi)으로 분류하였다. 실험 동물은 각 군마다 11마리씩 사용하였으며, 온도 20±2℃, 습도 40~60%, 명암 사이클 12시간의 조건에서 사육하였다.

대장염 유발 물질로서 증류수에 DSS를 2% 농도로 교반하여 제조하였으며, 마우스의 체중과 관계 없이 2% DSS 용액을 음수로 공급하여 대장염을 유도하였다. 대장염을 유도한 직후부터 대장염 상태를 유지시키기 위하여 7일간 2% DSS 를 식수에 용해시켜 지속적으로 공급하였고, 3일마다 마우스의 체중을 측정함으로써 대장염 유발 여부를 확인하였다. 정상군은 다른 군에 비하여 실험 기간 내내 체중의 감소가 나타나지 않았고, 실험 종료일(15일째)에 가장 체중이 높았다. 그 외 다른 군들은 모두 비슷한 체중 변화를 보였다 (도 5 참조).

nF1 처리군의 경우, 상기 실시예 2에서 제조한 나노형 김치 유산균 nF1 분말을 시험물질로 하였으며, 분말 상의 시험물질을 PBS에 농도별로 희석하여 제조하였다. 성인 50 kg 기준으로 유산균 1일 섭취량이 1조 마리일 경우 좋은 결과를 나타내었다는 선행 연구의 데이터를 바탕으로, 마우스의 체중을 20 g으로 환산하여 약 4억 마리를 1일 투여량으로 정하였다. 본 발명의 나노형 김치 유산균 nF1 분말은 1 g 당 1조 마리로 조절되어 있어, 0.4 mg/mouse (4억 마리/mouse)를 기본농도(중농도, nF1-M)로 하였고, 고농도군(nF1-H)은 4 mg/mouse (40억 마리/mouse), 저농도군(nF1-L)은 0.04 mg/mouse (0.4억 마리/mouse)가 되도록 조제하였다.

김치 처리군은 부산대학교의 표준화 김치 레시피를 이용하여, nF1 분말을 첨가하지 않은 김치(N-Kimchi)와 nF1 분말을 첨가한 김치(nF1-Kimchi)로 2가지를 제조하였으며, nF1 분말은 김치 1 kg 당 2 g을 첨가하였다. 이렇게 제조한 김치들을 3주 동안 숙성시켜 유산균이 10^7~8Logcfu/g에 이르렀을 때인 적숙기 상태의 김치를 착즙하여 마우스에 투여하였다. 김치 착즙액의 투여 농도는 마우스 최대 투여 용량(200 μl)으로 정하였으며, 상기 모든 시험물질은 매 회 경구투여 직전에 농도에 맞게 PBS와 혼합하여 제조하였다.

각각의 시험군과 시험물질을 하기 표에 정리하였다.

시험군	시험물질	투여용량 (g/ kg )	투여액량 (μl, p.o.)	동물 수 (마리)
정상군	-	-	200	11
대조군	DSS	2% DSS	200	11
nF1 -H	nF1	2	200	11
nF1 -M	nF1	0.2	200	11
nF1 -L	nF1	0.02	200	11
N- Kimchi	표준화 김치	0.2	200	11
nF1 - Kimchi	nF1 첨가 김치	0.2	200	11

총 2주간의 시험물질 투여가 끝난 후 부검을 실시하여 하기 항목에 대한 결과를 비교하였다.

3-2) 대장 길이 변화 측정

상기 3-1)의 DSS를 이용하여 대장염을 유도한 마우스의 대장을 적출하여 길이와 무게를 측정함으로써 염증과 관련된 대장염으로 인한 장기의 변화를 관찰하였다. 대장염이 유도된 마우스의 경우 정상적인 대장보다 길이는 짧게 나타나고, 궤양성 대장염이 발생하면 조직의 변화 및 경직화로 인해 무게가 약간 증가하는 경향을 보인다. 따라서 대장의 길이가 길고 무게가 가벼울수록 대장염 예방에 효과가 있다고 볼 수 있다.

먼저, 각각의 시험물질을 처리한 마우스의 대장을 적출하여, 각 군에 속한 11마리 마우스의 대장 길이를 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6(a)에 나타난 바와 같이 정상군(normal)의 대장 길이는 8.5 ± 0.7 cm, 대장염이 유도된 대조군(control)은 5.7 ± 0.6 cm로 나타나, 대조군의 대장 길이가 유의적으로 감소하였으며, DSS로 인한 궤양성 대장염이 유발되었음을 알 수 있었다 (p < 0.05).

한편, 본 발명의 나노형 김치 유산균 nF1을 처리한 군의 대장길이는 nF1-H군 7.0 ± 0.6 cm, nF1-M군 6.7 ± 0.7 cm 및 nF1-L군 6.4 ± 0.6 cm로 나타났다. nF1-H이 가장 높은 예방효과를 보였으며 nF1-M과 nF1-L도 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 있어 대장염을 예방하는 효과가 있는 것으로 나타났다 (p < 0.05).

다음으로, nF1을 처리한 김치를 투여한 마우스의 대장 길이를 상기와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 6(b)에 나타내었다. 도 6(b)에 나타난 바와 같이, 일반 김치 투여군(N-Kimchi)은 6.2 ± 0.4 cm, nF1 처리 김치 투여군(nF1-Kimchi)은 6.7 ± 0.2 cm로 나타났다. 두 그룹 모두 대조군에 비하여 유의적으로 대장염 예방 효과를 나타낸 것을 알 수 있었으며, 특히 nF1-Kimchi군에서 보다 유의적으로 높은 대장염 예방 효과가 나타났음을 알 수 있었다 (p < 0.05).

3-3) 대장 조직의 병리학적 관찰

대장 조직의 손상정도를 알아보기 위하여, 3-1)의 마우스 모델 각각의 대장 내 잔여 분뇨를 PBS를 사용하여 깨끗이 제거하고, 10% 포르말린 용액에 넣어 4℃ 냉장 상태에서 24시간동안 고정시킨 후 파라핀 조직표본을 제작하여 5 ㎛로 각 조직표본을 절편하였다. 조직 절편은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin eosin)으로 염색하여 저배율 (x 40)에서 관찰하고 확대하면서 사진을 찍어 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 정상군(normal)과 비교하였을 때 DSS로 궤양성 대장염을 유발시킨 대조군(control)은 대장조직의 점막층과 점막하층에서 손상이 일어났고, 점막과 조직 내 세포들이 염증으로 인해 괴사되거나 심하게 변형되었으며, 대장 조직 표면의 상피세포가 탈락되고 선와가 짓물러진 것과 점막층에 많은 염증세포들이 모이고 염증반응이 일어난 것을 관찰할 수 있었다.

한편, nF1을 처리한 군(nF1-H, nF1-M, nF1-L)들은 상대적으로 조직의 손상이 덜하고 상피세포층의 손상이 대조군보다 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다. 특히 nF1-H군과 nF1-M군은 염증과 손상 정도가 낮고 조직의 변형이 적었으며, 이는 nF1-M보다 nF1-H군에서 더욱 뚜렷하게 나타났다.

또한, 김치 처리군에서 역시 nF1-Kimchi군이 N-Kimchi군보다 염증부위가 적게 발생한 것을 확인함으로써 김치에 nF1을 첨가할 경우 대장염 예방 및 치료 효과가 뚜렷이 상승하는 것을 알 수 있었다.

3-4) 혈청 내 염증성 사이토카인의 발현 수준 측정

TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL-17A는 염증을 매개하는 신호 인자들로서 면역계에서 염증반응을 공통적으로 담당하는 중요한 분자들이다. 신호 인자가 줄어들었다는 것은 시험물질이 염증반응을 억제하는 효과가 있다는 것을 보여준다. DSS로 유도된 대장염 모델에서 혈청 중 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6 등)의 발현 수준을 통해 염증 매개인자의 생성 정도를 관찰하였으며, 이를 통해 나노형 김치 유산균 nF1의 대장염 예방효과를 알아보았다.

구체적으로, 3-1)의 마우스에서 혈액 샘플을 얻고, 각각의 혈액을 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후, 효소 면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA MAX Deluxe Sets, Biolegend)을 이용하여 TNF-α, IFN-γ 등의 사이토카인 분비를 측정하였다. 미리 96-웰 마이크로플레이트에 마우스 TNF-α, IFN-γ 등에 대한 캡쳐 항체를 코팅용 완충액에 희석하여 100 μl 씩 분주한 후 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 플레이트를 세척용 완충액으로 4번 세척한 후 희석액(assay diluent) 200 μl을 분주하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 4번 세척한 후 검출(detection) 항체 100 μl을 분주하고 다시 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 4번 세척한 후 표지물질로서 아비딘-HRP (avidin-horse-radish peroxidase) 100 μl을 접종하여 다시 실온에서 30분 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 TMB Substrate solution이 포함된 기질액 100 μl을 접종하여 실온에서 15분 동안 방치하고 정지용액(stop solution) 100 μl을 처리하여 반응을 정지시켰다. ELISA 분석기로 450 nm에서 광학밀도를 측정하였으며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL-17A의 측정 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 9에서 정상군(normal)의 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, IL-17A의 발현량은 대조군(control)보다 유의적으로 낮게 나타났으며 (p < 0.05), 염증을 유발시키면 이러한 염증성 사이토카인의 발현 수준이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 나노형 김치 유산균 nF1을 투여한 마우스의 경우, IL-6의 발현수준은 농도에 따라 유의적인 차이를 보였으며 nF1-H군에서 가장 낮게 나타났다 (p < 0.05). TNF-α, IL-1β, IL-12의 발현 수준은 nF1-H군과 nF1-M군간 유의성은 없었으나 nF1-L군보다는 유의적으로 감소하는 것을 나타냈고, IFN-γ와 IL-17A의 발현수준은 nF1-H, nF1-M, nF1-L 모두 대조군에 비해 유의적으로 감소하였으며, nF1-H군의 발현량이 가장 적었다. 이상의 결과를 종합하여 보면 nF1을 투여한 군에서는 대조군에 비해 사이토카인의 발현량이 감소하는 것을 알 수 있었고, 특히 고농도를 투여할수록 사이토카인 발현량이 낮게 나타났다. 따라서 nF1을 고농도로 섭취할 경우 대장염 예방 효과가 가장 높은 것을 알 수 있었다.

또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 김치를 투여한 마우스의 경우, nF1-Kimchi군은 N-Kimchi군에서보다 사이토카인의 발현 수준이 모두 유의적으로 낮은 것을 확인할 수 있었으며 (p < 0.05), 따라서 nF1을 김치에 첨가하면 대장염 예방 효과를 상승시키는 것을 확인할 수 있었다.

3-5) 조직 내 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준 측정

실험 마우스의 대장 조직을 PBS로 세척한 후 트리졸(trizol)을 이용하여 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리한 RNA 중 mRNA를 모두 cDNA로 만들기 위하여, 분리된 RNA를 정량한 후, 올리고 dT 프라이머(oligo dT primer)와 AMV 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 2 μg의 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사시켰다. 이 cDNA를 주형(template)으로 사용하여 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-12, IL-17A, COX-2, iNOS 유전자의 특정 유전자 부위를 증폭하였다. 이 때 내부 대조군(internal control)으로 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH를 사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하고 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr, Sigma, USA)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 대장 조직 내 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines; TNF-α, IL-1β, IL-6 등)의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10 및 11에 의하면, TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-6 및 IL-17A의 발현은 정상군보다 대조군에서 유의적으로 상승하였으며 (p < 0.05), 이로부터 대장염이 유발되면 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준이 증가하는 것을 알 수 있었다.

한편, nF1 투여군의 경우 도 10에 나타난 바와 같이, 농도가 높을수록 TNF-α, IFN-γ, IL-6 의 mRNA 발현량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다 (p < 0.05). IL-1β 및 IL-17A의 mRNA 발현량은 nF1-H와 nF1-M에서 유의적인 차이를 나타내지는 않았으나 nF1-L보다는 모두 낮은 수준이었다 (p < 0.05).

김치 투여군의 경우 도 11에 나타난 바와 같이, F1-Kimchi군의 염증성 사이토카인 mRNA 발현 수준이 N-Kimchi군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다 (p < 0.05).

따라서 nF1을 고농도로 섭취할 경우 대장염 예방 효과가 가장 높은 것을 알 수 있었으며, 김치에 nF1을 첨가하면 대장염 예방 효과가 유의적으로 상승되는 것을 확인할 수 있었다.

3-6) 염증 관련 유전자( iNOS , COX -2)의 mRNA 발현 수준 측정

대장 조직 내 염증 관련 유전자 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인하고 그 결과를 도 12에 나타내었으며, iNOS 및 COX-2의 발현 수준 역시 상기 실시예 3-4 및 3-5의 염증성 사이토카인과 비슷한 양상을 보였다.

도 12에 나타난 바와 같이, 대조군의 iNOS와 COX-2 발현 수준이 정상군보다 높게 나타나, 궤양성 대장염이 유발됨에 따라 iNOS와 COX-2의 발현량이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다 (p < 0.05).

한편, nF1투여군의 경우 nF1 투여 농도가 높을수록 낮은 발현 수준을 나타내고, 투여 농도가 낮을수록 높은 발현 수준을 나타내어, nF1 투여 농도에 따라 iNOS와 COX-2 발현 수준에 유의적인 차이를 나타내었다 (p < 0.05).

또한, nF1-Kimchi군과 N-Kimchi군을 비교하였을 때, nF1-Kimchi의 iNOS, COX-2는 각각 0.62 ± 0.00, 0.60 ± 0.04이며, N-Kimchi의 iNOS, COX-2는 각각 0.83 ± 0.00, 0.85 ± 0.01로 나타나 양자 간의 유의적인 차이를 확인하였다 (p < 0.05). nF1을 첨가한 김치에서 일반 김치보다 iNOS와 COX-2의 발현량이 낮게 나타나, 대장염 예방 효과가 유의적으로 상승되는 것을 확인할 수 있었다.

3-7) 분변 중 유산균 수 측정

대장 내의 유산균은 유기산을 생성하여 장 내 pH를 낮추고 유해균들의 생육을 억제하여 장내환경의 개선을 가져온다고 알려져 있다. 이에 시험물질 투여에 따른 분변 중의 유산균 수의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

유산균 수의 측정은 평판계수법(plate count technique)을 이용하였다. 마우스의 분변을 멸균된 증류수로 단계별로 희석하여, 미리 가열 용해한 후 43~45℃로 냉각한 MRS agar plate (Difco, Detroit, MI, USA)에 0.1 mL씩 분주하여 도말하였다. 37℃에서 2일 동안 혐기 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 배양된 균의 생성 콜로니 개수(colony forming units per gram, CFU/g)로 총 유산균 수를 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 분변 중의 유산균을 측정한 결과 마우스가 섭취하는 시험물질에 따라 유산균 수가 상이한 것을 알 수 있었다. 정상군과 대조군은 투여 전과 큰 차이가 없었고, nF1 투여군(nF1-H, nF1-M, nF1-L)과 김치 투여군 모두 분변 중의 유산균 수가 증가하였는데, 그 중 nF1-H군에서 가장 많은 증가를 보였다

구체적으로, 총 2주간의 시험물질 투여 후 nF1-H군의 분변 속 유산균은 8.47 ± 0.09 Log CFU/g으로 높은 양의 유산균이 검출되어, 고농도의 nF1을 섭취할 경우 장내에 유산균을 증가시키는 효과가 있는 것으로 나타났다.

또한, 2주 후 nF1-Kimchi군의 분변 속 유산균은 8.31 ± 1.10 Log CFU/g으로 nF1를 첨가하지 않은 일반 김치에 비해 높은 양의 유산균이 검출되어, 김치에 nF1을 첨가할 경우 장내에 유산균을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

3-8) 분변 중 유해효소(β- glucosidase , β- glucuronidase ) 측정

장내 세균들의 대사작용 등을 통하여 분비되는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)는 베타-글루코사이드(β-glucoside) 배당체 화합물과 글루쿠론산 화합물을 유해화합물로 변형시키는 유해효소로 알려져 있다. 특히 장내의 대표적인 유해효소인 베타-글루쿠로니다아제는 아민류와 독성물질, 변이원 등을 생성하여 장점막에 손상을 주어 대장암을 일으키고 장관내로 흡수된 유독 물질들은 체내를 순환하면서 각종 장기에 손상을 입히며 암 유발, 동맥경화, 간장 장해, 면역기능 저하 등을 초래한다. 이에 시험물질 투여에 따른 마우스 분변 중의 유해효소 활성 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

구체적으로, β-글루코시다아제 활성은 0.1 M 인산 나트륨 완충액(Sodium phosphate buffer, pH 7.0) 0.3 mL, 2 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드 (p-nitropheyl-β-D-glucopyranoside) 0.2 mL에 효소액 0.1 mL을 가하여 37℃에서 15분 간 반응시킨 후, 0.5 N NaOH 0.3 mL를 가하여 반응을 종료시켰다. 여기에 증류수 1 mL을 가한 후 3,000 rpm에서 20분 간 원심분리한 후 상등액을 취해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시험물질을 투여하기 전(initial) 마우스의 β-글루코시다아제 활성은 1.11 ± 0.22 units/g이었고, 도 14에 나타난 바와 같이, 시험물질을 2주 간 투여 하고 난 후 정상군의 활성은 1.48 ± 0.04 units/g, 대조군의 활성은 2.76 ± 0.29 units/g로 나타났다.

한편, nF1을 투여한 마우스군의 경우 nF1-H군이 1.64 ± 0.06 units/g, nF1-M군이 1.81 ± 0.06 units/g, nF1-L군이 2.57 ± 0.04 units/g로 나타나 고농도로 갈수록 β-글루코시다아제의 활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, nF1-Kimchi군의 경우 1.97 ± 0.23 units/g, N-Kimchi군은 2.09 ± 0.10 units/g으로 나타나, nF1을 첨가한 김치에서 유의적으로 보다 낮은 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다 (p < 0.05).

또한, β-글루쿠로니다아제 활성은 0.1 M S인산 나트륨 완충액 (pH 7.0) 0.38 mL, 2 mM p-니트로페닐-β-D-글루쿠로니드 (p-nitropheyl-β-D-glucuronide) 0.02 mL에 효소액 0.1 mL을 가하여 37℃ 에서 1시간 반응시킨 후, 0.5 N NaOH 0.4 mL을 가하여 반응을 종료시켰다. 여기에 증류수 1 mL을 첨가하고 이것을 3,000 rpm에서 20분 간 원심분리한 후 상등액을 취해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시험물질을 투여하기 전(initial) 마우스의 β-글루쿠로니다아제 활성은 0.29 ± 0.01이었으며, 도 14에 나타난 바와 같이, 2주 간 시험물질을 투여한 후 정상군의 활성은 0.27 ± 0.01 units/g, 대조군의 활성은 0.58 ± 0.04 units/g으로 나타났다.

한편, nF1을 투여한 마우스군의 경우 nF1-H군이 0.44 ± 0.01 units/g, nF1-M군이 0.44 ± 0.01 units/g, nF1-L군이 0.50 ± 0.05 units/g로 나타나 고농도군과 중농도군에서 β-글루쿠로니다아제의 활성이 낮았다. 또한, nF1-Kimchi군의 경우 0.44 ± 0.01 units/g, N-Kimchi군은 0.47 ± 0.05 units/g으로 나타나, nF1을 첨가한 김치에서 유의적으로 보다 낮은 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다 (p < 0.05).

따라서 nF1을 고농도로 섭취하거나 김치에 nF1을 첨가할 경우 분변에서 β-글루코시다아제 및 β-글루쿠로니다아제 효소의 활성이 감소하는 것으로 나타나, 장내 유독물질의 생성(pro-carcinogen을 carcinogen으로 전환)을 감소시킴으로써 대장 내 환경을 개선시키는 효과가 있는 것으로 보인다.

독립행정법인제품평가기술기반기구특허미생물기탁센터

nF1NITEP-1462

20121108

<110> BIOGENICS KOREA CO., LTD <120> Nano-Sized Lactic Acid Bacteria from Kimchi <130> 13P1169 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of Lactobacillus plantarum gene : nF1 <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctggt attgattggt 60 gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc 120 tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac 180 cgcatggtcc gagcttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta 240 ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg 300 taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360 atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420 gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 480 ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600 gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660 gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720 ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 780 aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 840 ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag 900 gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 1020 gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attaagttgg 1140 gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac 1260 tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320 cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg 1440 gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg attagggtga ag 1492 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 tcgtaacaag gtagcc 16

Claims

김치로부터 분리되고, 그람양성 간균 형태이며, 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주.
제 1항에 있어서,
상기 유산균은 수탁번호 NITE P-1462로 기재되는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제 1항에 있어서,
상기 유산균은 장내 환경 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제 3항에 있어서,
상기 장내 환경 개선 효과는 장내 유해 균주의 억제 효과 또는 면역 기능 활성 효과인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제 1항에 있어서,
상기 유산균은 대장질환의 치료 또는 예방 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제 5항에 있어서,
상기 대장질환은 대장염 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 식품.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 이의 배양상등액을 유효성분으로 포함하는 대장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 대장질환은 대장염 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주.
제1항의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주를 나노화 처리하는 단계를 포함하는 나노형 김치 유산균의 제조방법.
제 11항에 있어서,
상기 나노화 처리 단계는 상기 균주를 pH 중성 조건에서 배양하는 단계 및 배양 종료 후 배양액을 동결 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 pH 조건은 pH 5 ~ 7 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서,
김치로부터 제1항의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주를 분리하는 단계를 더 포함하는 나노형 김치 유산균의 제조방법.
김치로부터 분리되는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주를 나노화 처리하여, 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛되는 것을 특징으로 하는 나노형 김치 유산균 조성물.
제 15항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 나노형 김치 유산균 조성물.
제 15항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주는 수탁번호 NITE P-1462로 기재되는 나노형 김치 유산균 조성물.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum)균주를 1 g 당 1조 ~ 5조 마리 포함하는 것을 특징으로 하는 나노형 김치 유산균 조성물.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 나노형 김치 유산균 조성물을 포함하는 식품 첨가제.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 나노형 김치 유산균 조성물을 포함하는 기능성 식품.
제 20항에 있어서,
상기 식품은 김치인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 나노형 김치 유산균 조성물을 포함하는 대장질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 나노형 김치 유산균을 포함하는 대장질환 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물.
제 22항 또는 제 23항에 있어서,
상기 대장질환은 대장염 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 조성물.